本方案描述了一种低成本声流控装置的组装与操作方法，该装置通过超声造影剂诱导的声孔效应，实现分子对细胞的快速递送。
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摘要
摘要
生物分子的有效细胞内递送对于广泛的生物医学研究和基于细胞的治疗应用至关重要。超声介导的声孔效应是一种新兴的生物分子快速细胞内递送技术。当充满气体的微泡发生空化时，会在邻近细胞膜上形成瞬时孔隙，从而使细胞快速摄取周围液体中的生物分子。目前针对悬浮细胞的体外声孔处理技术受限于通量低、每个细胞所受超声暴露条件不一致以及成本高昂等问题。为克服这些局限，已开发出一种低成本的声流控装置，该装置将超声换能器集成于基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片中，结合超声造影剂，在细胞流经通道时实现稳定一致的声孔效应。该装置采用标准的光刻技术制备基于PDMS的微流控芯片，将一个超声压电圆盘换能器连接至装置，并由微控制器驱动。整个组件可集成于一个3D打印外壳中以提供额外保护。通过连接PVC管路的注射泵或蠕动泵推动细胞和微泡流经装置。本声流控系统已成功实现了向人源T细胞和肺癌细胞高效递送生物分子。与整体处理方法相比，该声流控系统提高了处理通量并降低了实验变异性，有助于改进生物医学研究中的细胞处理方法以及细胞治疗产品的生产制备。
引言
病毒性和非病毒性递送平台已被用于增强分子向细胞的递送。病毒递送（转导）是一种常用于需要基因组修饰的细胞治疗中的技术。病毒递送的局限性包括潜在的插入突变、转基因容量有限以及非预期的多重感染1,2。因此，非病毒性分子递送技术正在被开发，以适用于广泛的生物医学和科研应用。常见技术包括机械法、电穿孔法、流体动力法，或利用基于激光的能量来促进生物分子进入细胞 3。电穿孔是一种常用的非病毒性分子递送平台，能够诱导细胞膜产生瞬时穿孔，从而实现分子化合物的胞内递送4,5,6,7,8,9。然而，细胞膜的瞬时穿孔是一个随机过程，通过电穿孔实现的分子摄取通常依赖于分子被动扩散穿过瞬时形成的膜孔4,7,8。
另一种方法是利用超声波，通过超声造影剂（即充满气体的微泡）的空化作用，增强分子向细胞内的递送。微泡空化在其周围介质中引发微流效应，可导致邻近细胞质膜发生瞬时穿孔（"声孔效应"），从而通过被动或主动转运机制实现生物分子快速进入细胞内10,11,12。声孔效应是一种高效的细胞分子递送技术，但该方法通常需要昂贵的设备和批量处理方式，且受限于通量较低以及超声暴露条件的较高变异性13。为克服这些局限，目前正致力于开发声流控装置，以实现对悬浮细胞进行稳定一致的声孔处理。
声流控技术是一个不断发展的领域，它将超声波与微流控技术相结合，适用于多种应用。此前，该方法已用于颗粒分离，通过施加连续的超声能量在流体通道内激发驻波14,15,16,17。颗粒根据其尺寸、密度以及相对于介质的可压缩性等多种特性被分选到装置的不同区域16。声流控技术还正在开发中，以实现向多种细胞类型快速递送分子，用于科研应用及细胞治疗产品的生产18。最近，我们展示了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的声流控装置，可增强对红细胞的分子递送效率19。在该声流控平台上，可通过调控细胞与微泡的动力学行为，诱导物理相互作用，从而增强生物分子的递送效果。通过优化细胞与微泡之间的距离，有望进一步提高细胞内分子递送的效率和一致性。
声流控介导的声穿孔技术的一个重要应用是将生物分子导入原代人T细胞。基于过继性T细胞转移的免疫疗法，例如嵌合抗原受体T细胞（CAR T）疗法，正在迅速发展，用于治疗包括癌症和HIV病毒在内的多种疾病20。CAR T疗法在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中尤其有效，完全缓解率可达70-90%21。然而，这些疗法的T细胞制备通常依赖于病毒转导，而该方法存在插入突变风险、制备周期长，以及难以递送蛋白质或小分子等非遗传性生物分子等局限性1。声流控介导的分子递送方法有望克服这些限制，提升T细胞疗法的生产效率。
声流控介导的声穿孔另一项重要应用是向细胞内递送保护性化合物（如海藻糖），以在冷冻和干燥过程中保护细胞。自然界中某些生物能够产生海藻糖，并通过其保护细胞膜来耐受冷冻和干燥过程22,23。然而，哺乳动物细胞不能合成海藻糖，且海藻糖无法透过哺乳动物细胞膜。因此，必须采用有效的分子递送技术（如声穿孔），才能实现保护细胞内膜所需的足够胞内海藻糖浓度。目前，该方法正在开发用于多种细胞类型的干燥保存。
本方案详细描述了一种由微控制器驱动的、成本相对较低的声流控系统的组装与操作。利用超声造影剂在流体通道内诱导声孔效应，实现向多种细胞类型（包括T细胞和癌细胞）的快速分子递送。该声流控系统可用于多种科研应用，也可作为原型系统，用于评估改进细胞治疗生产工艺的声孔效应方法。
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方案
根据路易斯维尔大学机构审查委员会批准的方案，从健康献血者采集全血。
1. 制备 的 声流控 设备
- 获取具有同心螺旋结构的光掩模，其中通道直径为 500 µm。补充文件中提供了一个 CAD 文件作为示例。可从商业供应商处订购定制光掩模，或使用掩模写入设备自行制备。
- 使用标准光刻技术在涂有光刻胶的硅片上制备同心螺旋结构的模具。
- 在 100 mm 硅片上加入约 2 汤匙（~30 mL）SU-8 2100。
- 将硅片置于匀胶机上，以 150 rpm 的速度旋转 30 秒以铺展光刻胶，然后将速度提高至 1,200 rpm 持续 60 秒，形成厚度为 200 µm 的涂层。
- 将涂有光刻胶的硅片放入聚酰亚胺真空烘箱中，在 115 °C 下进行固化：先升温 30 分钟，保温 30 分钟，再降温 30 分钟。
- 使用掩模对准器，通过步骤 1.1 中的光掩模对涂有光刻胶的硅片曝光 130 秒。
- 曝光后，按照步骤 1.2.3 中所述相同过程对硅片进行烘烤。
- 将光刻胶在 SU-8 显影液中显影约 8 分钟。
注意：仅可在通风良好的化学通风橱中使用显影液。
- 对模具进行硅烷化处理，使其表面更具疏水性。将涂有光刻胶的硅片放入干燥器中，并加入 20 µL 氯硅烷（C8H4Cl3F13Si）液滴。对腔体抽真空 30 秒，然后密封并静置过夜。
注意：氯硅烷具有高度危险性和易燃性，接触可导致严重灼伤和眼部损伤。 - 在杯子中混合 54 g 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基体与 6 g 固化剂，用刮刀剧烈且充分搅拌至少 1 分钟。
- 将盛有 PDMS 溶液的杯子放入干燥器中约 30 分钟，或直至溶液中残留的气泡完全去除。
- 将带有图案面朝上的光刻胶硅片放入 150 mm 培养皿中。
- 将 PDMS 溶液倒入 150 mm 培养皿内的模具上。
- 如有需要，将 150 mm 培养皿放入干燥器中并抽真空，直至残留气泡消失。
- 将 150 mm 培养皿转移至实验室烘箱中，在 60 °C 下烘烤 2 小时以固化 PDMS。
- 固化完成后，使用剃刀刀片沿硅片边缘切割，小心地将 PDMS 从培养皿中取出。
- 使用刀片或剃刀刀片切割出每个独立的装置。
- 使用 2.5 mm 活检打孔器在每个装置的进样口和出样口处打孔。
- 将每个 PDMS 装置的通道面朝上（暴露）放入等离子体灰化仪中。进行氧气等离子体处理（100 W，45 秒，500 mbar O2），然后立即将每个 PDMS 装置通道面向下贴合到洁净的钠钙玻璃载玻片（75 mm × 25 mm × 1 mm）表面。
- 让装置在室温下静置过夜以完成键合。
- 在直径为 1 cm 的压电换能器表面均匀涂抹厚度约为 1–2 mm 的硅胶，然后仔细对准同心螺旋结构，并轻轻将其压在玻璃载玻片底部（与 PDMS 装置相对的一侧）。
2. 组装 和 操作 的 声流控 系统
- 使用 USB A 转 B 数据线将微控制器连接到计算机。绿色电源指示灯（标有 PWR）应亮起。
- 在计算机上使用配套程序上传生成 8 MHz 信号的程序。示例程序见 补充 文件。程序上传后将存储在微处理器内存中，无需再次上传。
- 将一段 1" 长的 22 号导线焊接到压电换能器每根导线的末端。
- 通过焊接好的导线将压电换能器的负极（黑色）端子导线连接至接地引脚（GND）。
- 通过焊接好的导线将压电换能器的正极（红色）端子导线连接至输出引脚（在提供的示例程序中为 #9 引脚）。
- 可选：将声流控装置和微控制器安装在一个 3D 打印外壳中。示例 CAD 文件见 补充 文件 。可根据需要将额外导线连接至微控制器的其他引脚，以控制外部 LED 指示灯和开关按钮。
- 截取 3–6" 长的 Tygon PVC 软塑料管（内径 1/16"，外径 1/8"），将其推入进样口和出样口。插入时可能需要边施加压力边旋转软管，直至其完全嵌入开口。可选：在将软管插入各端口后，可在连接处涂抹胶水，以使 PDMS 与软管粘合。
- 根据制造商说明组装微流控储液装置。
- 截取一段 3–6" 长的 Tygon PVC 软塑料管（内径 1/16"，外径 1/8"），将其套在微流控储液装置出口管路的 1/32" 内径管上。可选：在连接处缠绕一层石蜡膜，以防止泄漏。
- 用环境空气填充一支 60 mL 注射器（可选：使用 0.2 µm 滤膜过滤空气），并将其连接至微流控储液装置一侧的 Tygon PVC 管（内径 1/16"，外径 1/8"）。
- 将注射泵设置为 200 mL/h 的流速，以 50 mL/h 的体积流速推动细胞/超声造影剂溶液通过声流控装置，并将装置出口的样品收集至 50 mL 离心管中。可选：在进行声流控处理前，用 15 mL 70% 乙醇溶液冲洗通道，以提高流体通道的无菌性。此外，在向系统中泵入细胞前，可用 15 mL 去离子水冲洗通道，以去除装置中残留的乙醇。
3. 超声造影剂的制备
注意：超声造影剂通过暂时增加邻近细胞膜的通透性，显著增强分子化合物的声流体递送效率19。在该系统中，若无超声造影剂，分子递送效果极为有限。
- 在20 mL闪烁瓶中配制磷脂溶液，包含以下混合物：
- 加入25 mg的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）。
- 加入11.6 mg的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（DSEPC）。
- 加入0.26 mg的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DSPG）。
- 加入0.88 mg的聚氧乙烯40硬脂酸酯。
- 加入氯仿直至所有磷脂完全溶解（例如，加入3 mL氯仿）。
- 在干燥器中蒸发氯仿48小时，形成干燥的脂质膜（也可在氩气氛围下或使用旋转蒸发仪加速干燥过程）。
- 用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重新水合脂质膜。
- 将脂质溶液在40%振幅下超声处理3分钟，形成阳离子胶束溶液。
- 超声处理后，将磷脂溶液在2–6 °C保存，可稳定保存长达1个月。
- 为制备超声造影剂，向2 mL玻璃密封小瓶中加入200 µL阳离子胶束溶液和600 µL无菌PBS。
- 通过压紧瓶盖密封小瓶。
- 使用1.5" 20G针头向小瓶顶部空间充入十氟丁烷气体30秒。
- 以4,350 cpm速度振荡小瓶45秒，形成填充全氟丁烷气体的超声造影剂。
- 在将造影剂/细胞混合物泵入声流控装置前，立即向每1 mL细胞溶液中加入25 µL超声造影剂溶液。细胞溶液可根据用户需求进行调整，但在本研究中，步骤4.21使用的是原代T细胞，步骤5.7使用的是A549肺癌细胞。
4. 原代T细胞的制备
- 从全血溶液中分离外周血单个核细胞（PBMCs），并在 -150 °C 下保存。通常采用含有基质的密度梯度离心法从全血中分离 PBMCs24,25,26。
- 在 37 °C 水浴中解冻冻存的细胞管。
- 在 15 mL 离心管中用 PBS 将解冻后的 PBMCs 按 1:10 比例稀释。每 1 mL 细胞管中约含有 1000 万个 PBMCs。
- 在 4 °C 条件下，以 580 x g 离心 11 分钟。
- 吸除上清液，并加入 13 mL MACs 洗涤缓冲液重悬细胞。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对 PBMCs 进行计数。
- 再次在 4 °C 条件下，以 580 x g 离心 11 分钟，吸除上清液。
- 每 1000 万个 PBMCs 加入 40 µL 冷却的洗涤缓冲液。
- 为分离 T 细胞，每 1000 万个 PBMCs 加入 10 µL Pan T 细胞生物素抗体混合液。
- 轻轻振荡混匀 PBMCs，并在 4 °C 下孵育 5 分钟（每 1000 万个细胞）。
- 每 1000 万个 PBMCs 加入 30 µL 洗涤缓冲液和 20 µL Pan T 细胞 MicroBead 混合液。
- 充分混匀 PBMCs 与磁珠，并在 4 °C 下继续孵育 15 分钟。
- 加入洗涤缓冲液，使总体积达到 500 µL。
- 使用市售的台式磁性分选仪器，按照制造商说明书中的“耗竭式分离"depletes separation"设置分离初始 T 细胞。此步骤在细胞分选后应获得 500 万至 1000 万个 T 细胞。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对 T 细胞进行计数。
- 将 T 细胞用 10 mL 无菌 PBS 稀释，在 4 °C 条件下以 580 x g 离心 10 分钟以收集细胞。
- 吸除上清液，并将 T 细胞重悬于 1 mL PBS 中。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对 T 细胞进行计数，并将细胞分装为每毫升含 100 万个细胞用于实验。
- 在 PBS 中配制浓度为 1 mg/mL 的荧光素溶液。
- 在处理前立即向每 1 mL T 细胞悬液中加入 100 µL 的 1 mg/mL 荧光素溶液（终浓度 = 100 µg/mL）。
- 加入 25 µL 超声造影剂溶液，操作同步骤 3.11 中所述。
- 使用声流控系统处理 1 mL 细胞分装液（参见步骤 2.10–2.11）。此步骤可增强荧光素向初始 T 细胞内的递送。
- 处理后立即用 500 µL PBS 以 580 x g 离心 10 分钟，洗涤细胞三次，以去除胞外荧光素。应在加入荧光素溶液后 10 分钟内完成细胞洗涤。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 250 µL PBS 中，并在流式细胞仪上检测荧光强度。
5. 制备 A549 肺癌细胞
- 在37 °C、5% CO2 条件下，将A549（人肺腺癌肺泡基底上皮）细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的完全DMEM培养基中，使用平底组织培养瓶。
- 当A549细胞融合度达到70–90%时进行收获。吸除培养瓶中的培养基，并用PBS洗涤细胞一次，以去除血清蛋白。
- 向培养瓶中加入0.25% EDTA胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5分钟。胰蛋白酶是一种消化酶，可使细胞从组织培养瓶底部脱离。
- 将胰蛋白酶溶液转移至15 mL离心管中，并按1:3比例加入完全DMEM培养基以中和酶活性。
- 在4 °C下以1,500 x g 离心5分钟，使细胞沉淀。
- 吸除上清液，将沉淀重悬于含有200 mM海藻糖的PBS溶液中，调整细胞浓度为100,000/mL，置于15 mL锥形管中。
- 加入25 µL超声造影剂溶液，操作同前3.11步骤所述。
- 使用声流控系统处理1 mL细胞分装样品（参见步骤2.10–2.11）。此步骤可增强海藻糖向A549肺癌细胞内的递送。
- 处理后立即通过离心用500 µL PBS洗涤细胞三次，以去除胞外海藻糖。应在加入海藻糖溶液后10分钟内完成细胞洗涤。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于100 µL PBS中。
- 加入11 µL 1% Triton X-100溶液，裂解细胞以释放胞内海藻糖。
- 涡旋振荡15秒，然后在室温下孵育30分钟。
- 再次涡旋振荡15秒，随后按照制造商说明书，使用市售海藻糖检测试剂盒测定海藻糖浓度。
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结果
图1展示了组装在3D打印外壳内的声流控系统的图像。本方案构建的声流控系统可用于在多种细胞系中利用超声造影剂增强细胞内分子递送。
图2 显示，与未处理的对照组相比，采用声流控处理可显著增强荧光化合物荧光素向原代人T细胞的胞内递送（p<0.05，n=3/组）。将T细胞以1×10⁶个/mL的浓度悬浮于含100 µg/mL荧光素溶液和25 µL/mL超声造影剂溶液的PBS中，混合液经声流控装置进行超声处理。处理后通过离心洗涤去除胞外荧光素，再通过流式细胞术检测胞内荧光素的递送效率及细胞活力。未处理对照组的T细胞同样以1×10⁶个/mL的浓度悬浮于含100 µg/mL荧光素溶液的PBS中，但未添加超声造影剂溶液，且未经过声流控装置处理。经声流控处理后，T细胞的荧光强度较未处理对照组提高了5倍，表明荧光素的递送效率显著增强。声流控处理后细胞活力略有下降，但仍保持在80%以上（p<0.05，n=3/组）。
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讨论
本方案描述了一种低成本声流控系统的组装与操作方法，该系统可增强生物分子向细胞内的递送，适用于科研应用。在组装和操作该系统时，需考虑若干重要因素。声流控装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，这是一种生物相容性材料，可方便地模塑成型，并保持通道尺寸的一致性27。在进行声流控处理前，可用15 mL的70%乙醇溶液冲洗装置通道，以提高与培养细胞操作时的无菌性。乙醇清洗后，可使用15 mL去离子水冲洗装置，以在加入细胞溶液前清除通道中残留的乙醇。微小的声流控通道容易被碎屑或细胞聚集体堵塞，这限制了装置的频繁使用。每次样品处理后彻底冲洗通道有助于防止通道堵塞问题。此外，每批次可制备多个PDMS装置，以便在必要时快速更换。对于基于超声的应用，制备具有均匀厚度的PDMS装置至关重要，因为PDMS厚度的差异会影响流体通道内的超声压力。超声波在装置中持续传播，透射波与反射波相互作用形成稳定的声波模式，该模式对PDMS厚度的差异极为敏感17。PDMS的厚度主要由加入模具中的PDMS量决定（步骤1.7），本方案所得PDMS厚度为3.5 mm。
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披露
共同作者 MAM 和 JAK 持有 DesiCorp 的所有权，该公司可能从与本研究相关的產品中获得经济利益。
致谢
本工作部分得到了美国国家科学基金会（#1827521、#1827521、#1450370） 和美国国立卫生研究院（U01HL127518）资助。光刻服务由路易斯维尔大学微/纳米技术中心提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 声流控装置的制备 | |||
| DOW SYLGARD 184 硅胶封装剂，透明，0.5 kg 套件 | 埃尔斯沃思粘合剂 | 4019862（SKU） | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core（2.5 mm） | 电子显微镜科学公司 | 69039-25 | |
| 15 mL Falcon管微型储液器 - S型（2/4端口） | 达尔文微流控 | LVF-KPT-S-2（货号） | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| 显微镜载玻片 | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| 三氯硅烷 | Gelest | 105732-02-3（Cas号） | 氯硅烷具有高度危险性和易燃性。接触会导致严重灼伤和眼部损伤。 |
| Tygon PVC 软塑料管（1/16" ID，1/8" OD | McMaster-Carr | 5233K51（部件编号） | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| 声流控系统的组装 | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050（条形码） | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| 超声造影剂的制备 | |||
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（DSEPC） | Avanti Lipids | 890703P-25mg（货号） | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DSPC） | Avanti Lipids | 850365P-25mg（货号） | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油（DSPG） | Avanti Lipids | 840465P-25mg（货号） | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP（十氟丁烷气体） | FlouroMed | 355-25-9（Cas No.） | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 混合器 | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| 聚氧乙烯40硬脂酸酯 | Sigma-Aldrich | P3440-250G（货号） | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=zh&®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj 高效递送生物分子进入细胞内是广泛生物医学研究和细胞治疗应用所必需的。超声介导的声致孔技术是一种新兴的生物分子胞内递送方法。当充满气体的微泡发生空化时，会在邻近细胞膜上形成瞬时孔隙，从而使细胞快速摄取周围液体中的生物分子。目前针对悬浮细胞体外声致孔的技术受限于通量低、各细胞所受超声暴露条件不一致以及成本高昂等问题。为克服这些局限，已开发出一种低成本声流控装置，该装置将超声换能器集成于基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片中，结合超声造影剂，在细胞流经通道时实现稳定一致的声致孔效应。该装置采用标准光刻技术制备PDMS微流控芯片，将压电超声圆盘换能器连接至装置并由微控制器驱动。整个组件可集成于3D打印外壳中以提供额外保护。通过连接PVC管路的注射泵或蠕动泵推动细胞与微泡流经装置。该声流控系统已成功实现向人源T细胞和肺癌细胞高效递送生物分子。与传统的批量处理方法相比，该系统提高了通量并降低了实验变异性，有助于优化生物医学研究中的细胞处理方法以及细胞治疗产品的生产制备。 vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 超声波破碎仪 | Qsonica | Q125-110（参考） | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&&_sid=406df3776&_ss=r |
| 原代T细胞的制备 | |||
| autoMACs 运行缓冲液 | Miltenyi Biotec | 130-091-221（订单号） | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| 人泛T细胞分离试剂盒（泛T细胞生物素抗体混合液） && Pan T细胞微珠混合液） | Miltenyi Biotec | 130-096-535（订单号） | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| 磁性细胞分选仪（autoMACS Pro 分离器） | Miltenyi Biotec | 130-092-545（订单号） | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| A549 肺癌细胞的制备 | |||
| 海藻糖检测试剂盒 | Megazyme | K-TREH（货号） | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| 台盼蓝（0.4% 水溶液，即用型，无菌） | VWR | 97063-702（货号） | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
参考文献
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- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27(2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
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