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高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

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DOI：

10.3791/62038

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2021年4月18日

 ,  ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

本文内容

摘要

通过高通量延时成像技术，对固定化的酵母细胞在微菌落生长过程中的生长表型进行精确测量。同时，可监测其胁迫耐受性、蛋白质表达及蛋白质定位，从而生成整合型数据集，用于研究环境差异、遗传差异以及同基因型细胞间基因表达异质性如何调控细胞生长。

摘要

准确测量菌株间和菌株内微生物生长速率的异质性，对于理解遗传和环境因素对胁迫耐受性、致病性及其他适合度关键组分的影响至关重要。本文描述了一种基于显微镜的检测方法，每次实验可追踪约105 Saccharomyces cerevisiae微菌落。通过自动化的延时成像技术对固定在多孔板中的酵母进行成像后，可利用定制的图像分析软件轻松分析微菌落的生长速率。对于每个微菌落，还可同时监测荧光蛋白的表达与定位以及对急性胁迫的存活情况。该检测方法不仅能够精确估算菌株的平均生长速率，还可全面测量克隆群体内生长、基因表达和胁迫耐受性方面的异质性。

引言

生长表型对酵母适应性具有关键影响。自然选择能够有效区分生长速率差异达到有效种群大小倒数的谱系，而有效种群大小可超过108个个体1。此外，种群内单个个体间生长速率的变异性也是一个具有进化意义的参数，因为它可作为生存策略（如“赌注对冲”）的基础2,3,4,5,6。因此，能够实现对生长表型及其分布进行高精度测量的检测方法，对于微生物研究至关重要。本文所述的微菌落生长检测法可在每次实验中获得约105个微菌落的个体生长速率测量数据。该方法为研究酵母进化遗传学与基因组学提供了强有力的实验方案，尤其适用于探究在基因完全相同的单细胞种群中，个体间变异性的产生机制、维持方式及其对种群适应性的贡献7,8,9,10。

本文所述方法（图1）利用周期性采集的低倍明场图像，对在96孔或384孔玻璃底板中液体培养基内生长的细胞形成微菌落的过程进行追踪。细胞黏附于涂覆在显微镜板底部的刀豆球蛋白A（concanavalin A）上，并形成二维菌落。由于微菌落以单层形式生长，微菌落面积与细胞数量高度相关7。因此，可通过定制的图像分析软件，通过追踪每个微菌落面积变化速率，准确估算微菌落的生长速率和滞后期。此外，该实验装置还可监测这些微菌落中荧光标记蛋白的丰度甚至亚细胞定位。该微菌落生长检测所产生的数据，可通过定制分析或现有图像分析软件进行后续处理，例如“轻松处理图像”（Processing Images Easily, PIE）11——一种可从GitHub获取的算法12，用于从低倍明场图像中稳健识别菌落面积并实现高通量生长分析。

由于微菌落生长实验所获得的生长速率估计值源自大量单菌落的测量，因此其准确性极高，对于合理规模的实验而言，标准误差比估计值本身小数个数量级。因此，该实验在检测不同基因型、处理方式或环境条件之间的生长速率差异方面具有很高的灵敏度。多孔板的格式使得在单次实验中可以同时比较多种不同的环境与基因型组合。如果菌株组成型表达不同的荧光标记物，则可将其混合在同一孔中，并通过后续的图像分析加以区分，从而可通过孔间数据归一化进一步提高检测效能。

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图1：实验方案的示意图。本方案包括两个主要步骤，即实验用培养板的制备和待成像细胞的制备。培养板的随机化处理及细胞培养应在实验前及实验当天之前完成。在稀释过程中的每一步均需对细胞进行充分混匀，直至接种完成，因此建议优先制备实验用培养板，以便在细胞稀释完成后立即进行接种。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 随机化平板的制备（实验日前）

  1. 规划将在生长实验中测试的菌株和培养条件。在此阶段，可将菌株和条件随机分配至任意孔中。
    注意：在考虑板式设计时，建议在同一块板上为每种菌株和生长条件设置多个重复，以消除因孔间差异导致的测量噪声。详见“讨论”部分。
  2. 对将在不同日期运行的板重复实验，通过计算方法对每种菌株和环境条件的位置进行随机化处理。
  3. 将实验中使用的所有细胞在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YEPD；2% 葡萄糖）培养基中，于30 °C（或其他适当温度）摇床培养至饱和状态。
  4. 通过手动或液体处理机器人制备随机化的储备板。将指定的饱和培养细胞各10 µL加入无菌U型底组织培养板的每个孔中。若单个孔中需测试多个菌株，此时不要混合；这些菌株的混合应在实验当天进行细胞稀释前完成，以确保所有菌株在作为微菌落起始细胞点板时处于正确浓度。
  5. 向每块板的每个孔中加入10 µL的30%甘油。用移液器吹打混匀，使细胞与甘油充分混合。
  6. 用铝箔封膜密封每块板，并立即在-70 °C下冷冻保存，直至使用。
    ​注意：务必在同一天制备所有随机化板并立即冷冻，以确保各板中细胞的预培养条件完全一致，避免在生长速率测定中引入技术性变异。

2. 酵母预培养

注意：通常在实验开始前进行，具体时间高度依赖于实验问题。详见讨论部分。

  1. 从 -70 °C 冰箱中取出一块储备板（每孔含 10 µL 酵母和 10 µL 甘油），并向其中每孔加入 180 µL 实验所用培养基。若实验将使用营养限制性培养基，则不要在营养限制性培养基中将酵母预培养至饱和状态，因为这可能导致酵母发生孢子形成。相反，应在非限制性培养基中进行预培养。
  2. 在 30 °C 条件下振荡培养酵母。需考虑实验起始时使用对数生长期还是稳定期的细胞，以确定是否需要在实验前对细胞进行多次稀释。如果实验中的酵母菌株或条件预期具有显著不同的生长速率，则需要进行为期两天的预培养，以使所有不同条件下的细胞均达到稳定期。

3. 显微镜设置

  1. 显微镜载板准备
    1. 确保显微镜培养箱已开启，并将显微镜腔室加热至实验所需的目标生长温度。对于使用 Saccharomyces cerevisiae 细胞的标准实验，培养箱应将显微镜腔室加热至 30 °C，以确保在生长速率测定期间细胞的生长条件正确。
    2. 使用 70% 乙醇对工作台、移液器及其他工具进行消毒。取出一块显微镜载板，将其放置在无尘且防静电的擦拭布上。
      注意：切勿用手（即使戴手套）触碰显微镜载板的底部，且每次载板接触任何表面时，都必须将其放置在无尘且防静电的擦拭布上。这可以防止污渍或划痕影响实验成像期间的生长速率测量。
    3. 解冻 5 mL 的 5 倍浓度刀豆蛋白 A（concanavalin A）溶液，用水稀释至 1 倍浓度，并使用装有 0.2-µm 滤膜的注射器过滤除菌。
    4. 使用 0.2 µm 滤膜对实验中使用的其他所有液体（包括实验培养基）进行过滤除菌，以去除溶液中可能形成的晶体或碎屑。晶体的存在会降低显微镜图像的质量。
    5. 向显微镜载板的每个孔中加入 200 µL 刀豆蛋白 A 溶液。
    6. 将载板置于离心机中，在载板下方垫上无尘且防静电的擦拭布，以 411 × 重力加速度（g）离心 2 分钟，确保刀豆蛋白 A 溶液均匀覆盖每个孔的底部，并排除气泡。
    7. 盖上载板盖，静置 1–2 小时。静置时间可灵活调整，但在不同实验运行之间应保持一致。
    8. 通过抽吸或强力吹出的方式将载板中的刀豆蛋白 A 溶液全部移除至水槽或容器中。操作时注意不要触碰载板的玻璃部分。允许少量刀豆蛋白 A 溶液残留在孔中。
    9. 通过向显微镜载板各孔加入 400 µL 无菌水进行洗涤，并按上一步骤中移除刀豆蛋白 A 的方式移除水分。切勿让载板干燥。
    10. 立即向载板中加入 185 µL 实验生长培养基。随后将向其中加入 15 µL 正确稀释的细胞悬液。
  2. 酵母细胞稀释
    注意：以下步骤描述了将酵母从饱和培养物（约 108 个细胞/mL）稀释 400 倍，以获得 250,000 个细胞/mL 的浓度。取 15 µL 该稀释液加入含 400 µL 培养基的玻璃底板中，最终在 96 孔板中每孔约含 4000 个细胞。若使用 384 孔板，则每孔最终细胞数应约为 700，需相应调整稀释比例。对于处于对数生长期、在更丰富或更贫瘠的预培养基中生长或来自不同菌株的细胞，该比例应进行相应调整。当生长速率测定实验持续时间超过 10 小时时，应降低每孔细胞的最终密度。
    1. 准备两个 96 孔培养板用于系列稀释：标记为板 1 和板 2，并向每个系列稀释板的各孔中加入 90 µL 实验生长培养基。
      注意：无论最终稀释倍数如何，建议至少进行两步系列稀释，每步均将少量酵母加入较大体积的实验培养基中，再用移液器剧烈混合（如步骤 3.2.5 和 3.2.6 所示）。
    2. 取出预培养的细胞板，以 411 × g 离心 2 分钟。
      注意：必须严格避免板中不同孔之间的交叉污染。在揭开铝箔封膜前进行此离心步骤，是为了防止某一孔中的酵母液滴从铝箔上飞溅并落入其他孔中。离心后应小心避免倾斜或晃动板，以防酵母接触铝箔封膜。
    3. 小心揭开铝箔，用移液器吸取约等于板中总体积一半的液体，反复吹打混匀，同时在孔内移动移液器头以充分混合。检查是否所有细胞均已从孔底重新悬浮。
    4. 若实验中需使用单个孔内的多个菌株，此时应按实验所需比例混合菌株。若使用参考菌株进行生长速率测量，则参考菌株与测试菌株的比例应为 1:1。
    5. 从生长培养基中吸取 10 µL 酵母加入稀释板 1 中。向每孔加入 100 µL 实验生长培养基，使每孔终体积为 200 µL，并剧烈吹打混匀。
    6. 从板 1 中吸取 10 µL 酵母加入板 2 中。向每孔加入 100 µL 实验生长培养基，并剧烈吹打混匀。
      注意：这些稀释步骤至关重要，有助于分离预培养阶段末期聚集在一起的酵母细胞团块，确保每个孔中最终含有大致相等数量的酵母细胞。各孔中酵母数量的一致性有助于减少生长速率测量中的实验噪声和偏差（参见代表性结果）。
  3. 超声处理
    ​注意：超声处理为可选步骤，仅针对易发生细胞粘连的酵母菌株（例如某些野生型菌株）进行。对于实验室常用菌株，通常无需超声处理，可直接进入步骤 3.4。
    1. 将 96 针超声探头放入盛有 70% 乙醇的 96 孔板中，用 70% 乙醇消毒，再用无尘且防静电的擦拭布擦干。
    2. 设置一个足够强的超声程序，以打散聚集的酵母细胞，但不会杀死细胞或引发过度的应激反应。可能需要预先测试以确定特定实验的最佳超声参数。本实验所用超声程序为：振幅 = 10，处理时间 = 10 秒，脉冲开启 = 1 秒，脉冲关闭 = 1 秒。该具体参数可能不适用于所有超声仪，建议在实验前进行测试。
    3. 再次用移液器剧烈吹打 5 次，充分混匀系列稀释板 2 中的酵母细胞。
    4. 将稀释板 2 放置在平台上，并用超声探针固定，确保探针插入细胞悬液中但不接触板底。运行超声程序时需佩戴适当的耳部防护装置。
    5. 程序结束后，用 70% 乙醇清洁超声探头，再用水冲洗，然后立即进入显微镜载板准备步骤，以防细胞再次聚集。
  4. 显微镜载板准备：
    1. 从系列稀释板 2 中吸取 15 µL 酵母加入显微镜载板中，使终体积为 200 µL。向每孔加入 200 µL 实验生长培养基，使每孔终体积为 400 µL，并剧烈吹打混匀。
    2. 用透气膜封盖载板。必须使用密封良好的方法（例如使用橡胶滚轮）将载板密封严实。
    3. 为使酵母细胞粘附于玻璃表面的刀豆蛋白 A 上，将载板置于离心机中，在其下方垫上无尘且防静电的擦拭布，以 411 × g 离心 2 分钟。
    4. 在显微镜处，用无尘且防静电的擦拭布擦拭载板的顶部和底部，并用压缩空气吹扫以去除碎屑。
    5. 将载板放置于显微镜载物台上，确保其水平放置，并使 A1 孔位于左上角。

4. 延时显微镜生长速率测量

注意：在延时显微成像过程中，以下参数由计算机控制：x、y 和 z 方向的位置、快门以及荧光滤光片。建议使用基于硬件的自动对焦系统，以防止延时成像期间焦平面漂移；也可采用基于软件的自动对焦循环。为维持显微镜培养室内的湿度，建议在整个实验过程中于培养室内放置一个盛有纯水的烧杯。

  1. 创建一个成像位置列表（x, y），以确保每个显微镜板孔都被完整成像。避免图像重叠，以防同一细胞被多次分析。
  2. 使用透射明场照明（DIA）以15倍放大倍数进行成像，曝光时间设置为约5 ms。
  3. 对图像进行数字放大，使细胞清晰可见。使用调焦旋钮确定板上四个角落孔和中心一个孔的最佳焦平面。调焦时应使细胞对比度最大化。
  4. 将实验的z轴位置（或自动对焦位置）设置为上述各孔所确定的z轴/自动对焦位置的平均值。如果显微镜板制作良好且玻璃底无缺陷，则每个孔的最佳对焦位置应相近。
    注意：在使用Processing Images Easily（PIE）图像分析流程11, 12分析图像时，将细胞在显微镜下略微失焦是有帮助的，这样细胞外部会呈现暗边，内部颜色较亮，有助于准确识别菌落并估算其大小。
  5. 若使用荧光菌株，需确定成像所用的荧光通道及曝光参数，确保无像素过曝。在设置荧光通道的曝光时间时，应关闭显微镜上的"实时预览"模式，以避免细胞长时间暴露于荧光激发光下，从而防止光漂白和细胞应激。
  6. 设置时间序列采集程序，以在所需时间段内按设定的时间间隔捕获图像。
  7. 运行实验。

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结果

本方案的创新之处在于，通过延时成像追踪单个细胞在群体中生长形成微菌落的过程，可计算每个细胞的生长速率（图2A）。由于存在刀豆蛋白A，微菌落在生长过程中呈平面扩展并持续数小时，因此可在整个实验过程中追踪其面积变化，并通过对面积自然对数随时间变化的线性拟合，计算每个被观察微菌落的生长速率7,9,10,13。在相同环境中，单个同基因型细胞之间微菌落生长速率的差异可被清晰记录（图2A，2B）。应使用图像分析软件自动追踪微菌落大小和荧光信号的变化（图2C）；图2A中所示的菌落追踪是使用PIE软件完成的11,

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讨论

本文所述的实验方案是一种多功能检测方法，可同时在单个微菌落水平上监测细胞生长和基因表达。结合这两种检测模式能够获得独特的生物学见解。例如，先前的研究利用该方法同时测量了同基因型野生型细胞中TSL1基因的表达水平与微菌落生长速率，发现二者呈负相关关系7,10。此外，该检测方法还可用于监测生长速率与荧光标记蛋白亚细胞定位动态之间的关系。例如，在启动生长检测前，每分钟对细胞进行一次荧光成像，持续30分钟，由此发现生长速率与RFP标记的转录因子Msn2 在细胞核中的占据程度之间存在负相关关系10。最后，本方案还允许监测细胞对环境胁迫和干扰的响应。例如，可在生长检测进行到中途时施加热激等处理。此类研究已发现，高表达Tsl1且生长缓慢的细胞对热激具有更强的耐受性7,10。

除了代表性结果...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Naomi Ziv、Sasha Levy和Shuang Li在本实验方案开发过程中的贡献，感谢David Gresham提供共享设备，以及Marissa Knoll在视频制作方面的帮助。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目R35GM118170支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
通用材料
500 mL 瓶顶滤器，0.22 µm PES，无菌，低蛋白结合，带45 mm 接口FisherCLS431154用于过滤培养基
BD Falcon* 组织培养板，微孔U型底Fisher08-772-5496孔培养管，用于细胞冻存、预培养及稀释
BD 无针注射器，50 mLFisher13-689-8用于过滤刀豆蛋白A（Concanavalin A）
Costar 一次性无菌试剂储液槽Fisher07-200-127试剂储液槽，用于多通道移液器加样
Costar Thermowell 铝箔密封膜Fisher07-200-684用于预培养和冻存的96孔板密封膜
无尘且防静电Kimwipes擦拭纸Fisher06-666A无尘防静电擦拭纸，用于保持显微镜用培养板底部无碎屑和划痕
Nalgene 注射式滤器ThermoFisher Scientific199-2020孔径0.2 μm，直径25 mm；用于过滤刀豆蛋白A溶液
培养基组分
最低化学成分定义培养基（MD；含2%葡萄糖）用于酵母预培养及显微镜观察期间生长的替代显微镜培养基
合成完全培养基（SC；含2%葡萄糖）用于酵母预培养及显微镜观察期间生长的显微镜培养基
酵母提取物-蛋白胨-右旋糖（YEPD；含2%葡萄糖）培养基在冻存随机化培养板前用于细胞生长
显微镜材料
Breathe-Easy 透气密封膜Millipore SigmaZ380059-1PAK用于显微镜实验期间密封培养板的透气膜。此阶段推荐使用透气膜，因其可防止孔内冷凝并获得更佳的显微图像
Brooks 96孔平底透明玻璃底显微镜培养板Dot ScientificMGB096-1-2-LG-L显微镜专用培养板
来自刀豆（Canavalia ensiformis，Jack Bean）的刀豆蛋白A（Concanavalin A），冻干粉末Millipore Sigma45-C2010-1G配制5倍浓度的刀豆蛋白A溶液，并将5 mL 5倍溶液分装至50 mL离心管中，于-80 °C冻存
所用菌株
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132实验室背景下的单倍体突变累积菌株，详见Hall和Joseph 2010年文献
EP026.2A-2C源自Hall和Joseph 2010年突变累积菌株的后代，转化了YFR054cΔ::Scw11P::GFP
设备
Misonix S-4000 超声仪，配备96针附件超声仪 https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E 配备完美聚焦系统（Perfect Focus System）带自动载物台和自动对焦系统的倒置显微镜

参考文献

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标签

Saccharomyces cerevisiae

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