通过高通量延时成像技术，对固定化的酵母细胞在微菌落生长过程中的生长表型进行精确测量。同时，可监测其胁迫耐受性、蛋白质表达及蛋白质定位，从而生成整合型数据集，用于研究环境差异、遗传差异以及同基因型细胞间基因表达异质性如何调控细胞生长。
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摘要
摘要
准确测量菌株间和菌株内微生物生长速率的异质性，对于理解遗传和环境因素对胁迫耐受性、致病性及其他适合度关键组分的影响至关重要。本文描述了一种基于显微镜的检测方法，每次实验可追踪约105 Saccharomyces cerevisiae微菌落。通过自动化的延时成像技术对固定在多孔板中的酵母进行成像后，可利用定制的图像分析软件轻松分析微菌落的生长速率。对于每个微菌落，还可同时监测荧光蛋白的表达与定位以及对急性胁迫的存活情况。该检测方法不仅能够精确估算菌株的平均生长速率，还可全面测量克隆群体内生长、基因表达和胁迫耐受性方面的异质性。
引言
生长表型对酵母适应性具有关键影响。自然选择能够有效区分生长速率差异达到有效种群大小倒数的谱系，而有效种群大小可超过108个个体1。此外，种群内个体间生长速率的变异性也是一个具有进化意义的参数，因为它可作为生存策略（如博弈对冲）的基础2,3,4,5,6。因此，能够高精度测量生长表型及其分布的实验方法对于微生物研究至关重要。本文所述的微菌落生长实验每轮可获得约105个微菌落的个体生长速率数据。该实验方法为研究酵母的进化遗传学与基因组学提供了强有力的工具，尤其适用于探究基因型相同的单细胞种群内部变异性的产生机制、维持方式及其对种群适应性的贡献7,8,9,10。
本文所述方法（....
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方案
1. 随机化平板的制备（实验日前）
- 规划将在生长实验中测试的菌株和培养条件。在此阶段，可将菌株和条件随机分配至任意孔中。
注意：在考虑板式设计时，建议在同一块板上为每种菌株和生长条件设置多个重复，以消除因孔间差异导致的测量噪声。详见“讨论”部分。 - 对将在不同日期运行的板重复实验，通过计算方法对每种菌株和环境条件的位置进行随机化处理。
- 将实验中使用的所有细胞在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YEPD；2% 葡萄糖）培养基中，于30 °C（或其他适当温度）摇床培养至饱和状态。
- 通过手动或液体处理机器人制备随机化的储备板。将指定的饱和培养细胞各10 µL加入无菌U型底组织培养板的每个孔中。若单个孔中需测试多个菌株，此时不要混合；这些菌株的混合应在实验当天进行细胞稀释前完成，以确保所有菌株在作为微菌落起始细胞点板时处于正确浓度。
- 向每块板的每个孔中加入10 µL的30%甘油。用移液器吹打混匀，使细胞与甘油充分混合。
- 用铝箔封膜密封每块板，并立即在-70 °C下冷冻保存，直至使用。
注意：务必在同一天制备所有随机化板并立即冷冻，以确保各板中细胞的预培养条件完全一致，避免在生长速率测定中引入技术性变异。
2. 酵母预培养
注意：通常在实验开始前进行，具体时间高度依....
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结果
本方案的创新之处在于，通过延时成像追踪单个细胞生长形成微菌落的过程，可计算出群体内每个细胞的生长速率（图2A）。由于存在刀豆球蛋白A（concanavalin A），微菌落在生长过程中呈平面扩展并持续数小时，因此可在整个实验过程中追踪其面积变化，并通过对面积自然对数随时间变化进行线性拟合，从而计算出每个被观察微菌落的生长速率7,9,10,13。在同一环境中，同基因型单个细胞的微菌落生长速率差异可被清晰记录（图2A、2B）。应使用图像分析软件自动追踪微菌落大小和荧光信号的变化（图2C）；图2A中所示的菌落追踪是使用PIE软件完成的11
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讨论
本文所述的实验方案是一种多功能检测方法，可同时在单个微菌落水平上监测细胞生长和基因表达。结合这两种检测模式能够获得独特的生物学见解。例如，先前的研究利用该方法同时测量了同基因型野生型细胞中TSL1基因的表达水平与微菌落生长速率，发现二者呈负相关关系7,10。此外，该检测方法还可用于监测生长速率与荧光标记蛋白亚细胞定位动态之间的关系。例如，在启动生长检测前，每分钟对细胞进行一次荧光成像，持续30分钟，由此发现生长速率与RFP标记的转录因子Msn2 在细胞核中的占据程度之间存在负相关关系10。最后，本方案还允许监测细胞对环境胁迫和干扰的响应。例如，可在生长检测进行到中途时施加热激等处理。此类研究已发现，高表达Tsl1且生长缓慢的细胞对热激具有更强的耐受性7,10。
除了代表性结果.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Naomi Ziv、Sasha Levy和Shuang Li在本实验方案开发过程中的贡献，感谢David Gresham提供共享设备，以及Marissa Knoll在视频制作方面的帮助。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目R35GM118170支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 通用材料 | |||
| 500 mL 瓶顶滤器，0.22 µm PES，无菌，低蛋白结合，带45 mm 接口 | Fisher | CLS431154 | 用于过滤培养基 |
| BD Falcon* 组织培养板，微孔U型底 | Fisher | 08-772-54 | 96孔培养管，用于细胞冻存、预培养及稀释 |
| BD 无针注射器，50 mL | Fisher | 13-689-8 | 用于过滤刀豆蛋白A（Concanavalin A） |
| Costar 一次性无菌试剂储液槽 | Fisher | 07-200-127 | 试剂储液槽，用于多通道移液器加样 |
| Costar Thermowell 铝箔密封膜 | Fisher | 07-200-684 | 用于预培养和冻存的96孔板密封膜 |
| 无尘且防静电Kimwipes擦拭纸 | Fisher | 06-666A | 无尘防静电擦拭纸，用于保持显微镜用培养板底部无碎屑和划痕 |
| Nalgene 注射式滤器 | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 孔径0.2 μm，直径25 mm；用于过滤刀豆蛋白A溶液 |
| 培养基组分 | |||
| 最低化学成分定义培养基（MD；含2%葡萄糖） | 用于酵母预培养及显微镜观察期间生长的替代显微镜培养基 | ||
| 合成完全培养基（SC；含2%葡萄糖） | 用于酵母预培养及显微镜观察期间生长的显微镜培养基 | ||
| 酵母提取物-蛋白胨-右旋糖（YEPD；含2%葡萄糖）培养基 | 在冻存随机化培养板前用于细胞生长 | ||
| 显微镜材料 | |||
| Breathe-Easy 透气密封膜 | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | 用于显微镜实验期间密封培养板的透气膜。此阶段推荐使用透气膜，因其可防止孔内冷凝并获得更佳的显微图像 |
| Brooks 96孔平底透明玻璃底显微镜培养板 | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | 显微镜专用培养板 |
| 来自刀豆（Canavalia ensiformis，Jack Bean）的刀豆蛋白A（Concanavalin A），冻干粉末 | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | 配制5倍浓度的刀豆蛋白A溶液，并将5 mL 5倍溶液分装至50 mL离心管中，于-80 °C冻存 |
| 所用菌株 | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | 实验室背景下的单倍体突变累积菌株，详见Hall和Joseph 2010年文献 | ||
| EP026.2A-2C | 源自Hall和Joseph 2010年突变累积菌株的后代，转化了YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| 设备 | |||
| Misonix S-4000 超声仪，配备96针附件 | 超声仪 https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E 配备完美聚焦系统（Perfect Focus System） | 带自动载物台和自动对焦系统的倒置显微镜 |
参考文献
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320(2013).
- Kussell, E., Leibler, S.
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重印与许可
