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方法文章

利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序

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DOI：

10.3791/62041

⸱

2021年6月16日

 ,  ,  , 
1Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 2Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 3Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

本文内容

摘要

本方案描述了一种报告基因检测方法，用于研究单个卵母细胞中mRNA翻译的调控过程 体外 成熟

摘要

与卵母细胞核成熟相关的事件已有详尽描述。然而，关于为受精和获得全能性做准备过程中细胞质内发生的分子通路和生物学过程，目前了解仍较为有限。在卵母细胞成熟过程中，基因表达的变化完全依赖于母源信使RNA（mRNAs）的翻译与降解，而非转录活动。因此，翻译程序的正确执行对于建立卵母细胞支持胚胎发育的发育潜能至关重要。本文属于一系列致力于阐明减数成熟过程及卵母细胞向合子转变期间母源mRNA翻译程序的研究之一。本方法学论文介绍了一种研究特定mRNA在 体外 卵母细胞成熟。在此，将Ypet报告基因融合至目的基因的3'非翻译区（UTR），并与编码mCherry的多聚腺苷酸化mRNA共同显微注射入卵母细胞，以mCherry信号校正注射体积。通过延时显微成像检测报告基因的累积量，计算卵母细胞减数分裂成熟过程中不同阶段的翻译速率。本文以Ypet/白细胞介素-7（IL-7）-3' UTR报告系统为例，详细描述了卵母细胞分离与注射、延时成像记录及数据分析的实验方案。

引言

一个完全成熟的哺乳动物卵母细胞在受精准备及获得全能性过程中会经历快速变化。这些变化对于受精后胚胎发育的维持至关重要。尽管与核成熟相关事件已有相对清晰的描述，但关于卵母细胞胞质中的分子过程和通路仍知之甚少。在卵母细胞成熟的最后阶段，细胞处于转录沉默状态，基因表达完全依赖于mRNA的翻译与降解。1,2因此，对发育能力至关重要的蛋白质合成依赖于在卵母细胞生长期较早合成的长寿命mRNA的定时翻译程序。1,3作为研究减数成熟期及卵母细胞向合子转变过程中母源mRNA翻译程序的一部分，本文介绍了一种在单个卵母细胞中研究靶标母源mRNA翻译激活与抑制的策略 体外 减数成熟

在此方法中，将 YPet 的开放阅读框克隆至目的转录本 3' 非翻译区（3' UTR）的上游。随后，将编码该报告基因的 mRNA 与编码 mCherry 的多聚腺苷酸化 mRNA 共同显微注射到卵母细胞中，以校正注射体积。在实验过程中检测报告基因的累积情况 体外 使用延时显微镜观察卵母细胞减数分裂成熟过程。在单个卵母细胞中记录黄色荧光蛋白（YFP）和mCherry的累积情况，并利用共注射的mCherry达到平台期的水平对YFP信号进行校正。数据采集后，计算不同时间区间内的翻译速率。 体外 通过曲线拟合所得曲线的斜率计算卵母细胞减数分裂成熟过程。

该方法为实验性验证所选内源性mRNA翻译水平的变化提供了工具。此外，通过操控靶mRNA 3'非翻译区（3' UTR）的顺式调控元件，该方法有助于表征调控卵母细胞减数成熟过程中翻译的调控元件4,5,6。对poly(A)尾长度的操控还可揭示卵母细胞中腺苷酸化酶/去腺苷酸化酶的活性5。通过顺式作用元件的定点突变或RNA免疫共沉淀技术，可研究其与相应RNA结合蛋白的相互作用6,7。此外，通过在卵母细胞质量下降的相关模型中检测靶标3' UTR的翻译情况，该方法还可用于鉴定对卵母细胞发育潜能至关重要的翻译程序核心组分8,9,10。本文提供了一个代表性实验，其中将21日龄C57/BL6小鼠的去丘卵母细胞显微注射携带IL-7 3' UTR序列的Ypet报告基因。文中详细描述了卵母细胞注射、延时成像及数据分析的实验设置与操作流程。

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方案

涉及动物的实验程序已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号 AN182026）。

1. 培养基的制备

  1. 按照表1所述，加入所有组分以配制基础卵母细胞采集培养基和卵母细胞成熟培养基。对于基础采集培养基，将pH值调节至7.4。在使用当天，向采集和成熟培养基中均添加3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和1 µM西洛他唑（cilostamide）。

2. 编码Ypet-3' UTR和mCherry的mRNA的制备

  1. 获取目的mRNA的3′非翻译区序列。
    注意：本研究中所用序列此前已从小鼠卵母细胞cDNA中获得。
  2. 设计引物以从卵母细胞cDNA中扩增目标3'非翻译区，以及pcDNA 3.1载体中含有Ypet编码序列、V5表位标签和T7启动子的部分。
  3. 使用高保真DNA聚合酶试剂盒进行扩增。将聚合酶链式反应（PCR）产物在琼脂糖凝胶上电泳，检测片段大小是否正确，切下目标条带，并根据试剂盒说明书使用凝胶回收试剂盒从凝胶中提取DNA。
  4. 使用PCR克隆试剂盒将PCR片段连接至载体。
    注意：PCR 片段在冰上孵育 4 小时，以促进更高效的重组反应。这与制造商推荐的仅孵育 45 分钟的说明相反。
  5. 将PCR片段转染至感受态细胞中 5-α 大肠杆菌 细菌
    1. 将混合物和质粒加入细菌中，冰上孵育 30 分钟。
    2. 将混合物放入42 °C水浴中热激45秒，随后立即置于冰上冷却3分钟。
    3. 加入 500 µL 含分解代谢抑制的超级优化肉汤（SOC） 培养基中37 °C孵育1小时。
    4. 7000 × g 离心 g 2 分钟后，去除大部分上清液。重悬沉淀，并涂布于含有适当选择性抗生素的LB（Luria Broth）琼脂平板上。
      注意：本研究中使用了羧苄青霉素。
    5. 37 °C 过夜培养。用移液器枪头轻轻接触其中一个菌落，并将菌落转移至含有 100 µg/mL 羧苄青霉素的 3 mL LB 培养基中，进行菌落分离。在 37 °C 培养 12–24 小时。
    6. 使用质粒DNA提取试剂盒，按照生产商说明书提取质粒DNA，并通过DNA测序验证序列。
  6. 对于 Ypet/3' UTR：
    1. 生成线性PCR模板 体外 转录。使用位于Ypet序列上游的正向引物，以及含有20个额外胸腺嘧啶残基的反向引物。参见 表2 Ypet/IL-7 3'非翻译区序列以及正向和反向引物的序列。
      注意：这些额外的胸腺嘧啶残基将在线性化mRNA的3'末端添加寡聚(A)尾 体外 转录.
    2. 体外 使用T7转录试剂盒，按照制造商说明书将PCR产物转录。
    3. 使用转录纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化所得的互补RNA（cRNA）。
    4. 用无RNA酶的水洗脱纯化的cRNA，并测定 浓度 并进行评估 通过琼脂糖凝胶电泳检测完整性。于 −80 °C 保存。
  7. 对于 mCherry：
    1. 生成线性PCR模板 体外 使用高保真限制性内切酶进行转录；若重复本示例，请使用限制性内切酶 mfEI-HF。在消化缓冲液中于 37 °C 过夜消化。
    2. 运行凝胶以纯化样品，并根据制造商说明书使用凝胶回收试剂盒提取线性DNA。
    3. 体外 使用T7转录试剂盒，按照制造商说明书将PCR产物转录。
    4. 使用 poly(A) 加尾试剂盒，按照制造商说明书对 cRNA（150-200 个核苷酸）进行多聚腺苷酸化。
    5. 使用转录纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化所得的cRNA。
    6. 用无RNase的水洗脱纯化的cRNA，测定mRNA浓度，并通过凝胶电泳评估其完整性。于−80 °C保存。

3. 实验步骤

注意：卵母细胞显微注射及后续延时显微镜观察的示意图如下所示 图1.

  1. 第1天
    1. 向21日龄小鼠腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素，以促进卵泡发育至有腔卵泡阶段11。
  2. 第3天
    1. 卵母细胞采集
      1. 在初次处理后44–48小时处死小鼠以收集卵巢，并将其置于含有基础卵母细胞采集培养基的塑料培养皿中。
      2. 使用26 G针头在卵泡壁上做微小切口，小心打开有腔卵泡。用口控玻璃移液管分离出被多层卵丘细胞完整包裹的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。
      3. 使用较小的移液管（直径略大于卵母细胞），通过反复吹打机械去除COCs的卵丘细胞。
        注：也可对完整的COCs进行显微注射。
      4. 使用较大的移液管吸取去卵丘的卵母细胞，并将其转移至含有成熟培养基的培养皿中，该培养基中添加1 µM磷酸二酯酶抑制剂西洛他唑，以防止减数成熟过程的恢复12。将培养皿放入培养箱中孵育2小时，使卵母细胞从从卵泡中分离所造成的应激中恢复。
    2. 卵母细胞显微注射
      1. 将一根10 cm长的硼硅酸盐玻璃毛细管放入机械拉针仪中制备注射针。为获得最佳注射效果，使用加热丝将针尖弯成45°角。
      2. 准备聚苯乙烯培养皿，内含20 µL基础卵母细胞采集培养基液滴，并用轻质矿物油覆盖液滴。
      3. 通过加入12.5 µg/µL Ypet-3' UTR和12.5 µg/µL mCherry制备报告基因混合物。建议配制较大体积并分装保存，以确保后续实验中报告基因浓度一致。将分装样品储存在-80 °C。解冻后，先以20,000 x g离心2分钟，然后转移至新的微量离心管中。
        注：此离心步骤可防止报告基因混合物中的潜在聚集体堵塞注射针。
      4. 通过毛细作用将约0.5 µL报告基因混合物吸入注射针中。
      5. 将持卵针和已装液的注射针插入相应夹持器中，并置于卵母细胞采集培养基液滴内。向持卵针中吸入部分培养基。
      6. 轻轻敲击注射针与持卵针接触，以打开注射针。
      7. 将卵母细胞置于基础采集培养基液滴中，每枚注射5–10 pL报告基因混合物。
      8. 将注射后的卵母细胞在含1 µM西洛他唑的成熟培养基中孵育16小时，使mCherry信号达到平台期。
      9. 准备一个用于延时显微成像的培养皿，为每种注射的报告基因至少设置两个20 µL成熟培养基液滴：一个含1 µM西洛他唑，用于对照组（前期I阻滞卵母细胞）；另一个不含西洛他唑，用于成熟中的卵母细胞。用轻质矿物油覆盖液滴后放入培养箱。
    3. 延时显微成像
      1. 预孵育后，从培养箱中取出已注射的卵母细胞，在不含西洛他唑的成熟培养基中清洗四次。保留部分卵母细胞于含1 µM西洛他唑的成熟培养基中，作为前期I阻滞的对照组。
      2. 将注射后的卵母细胞转移至预先准备好的延时显微成像培养皿中的相应液滴中。使用封闭的玻璃移液管将卵母细胞聚集在一起（可通过将移液管尖端在火焰中加热数秒制备封闭移液管）。
        注：聚集卵母细胞有助于防止其在记录过程中移动。
      3. 将培养皿置于配备发光二极管照明系统、带环境控制腔室的电动载物台的显微镜下，腔室维持在37 °C和5% CO2。为重复本研究，请使用以下参数：滤光片组：YFP/CFP/mCherry二向色镜69008BS；YFP通道（激发（Ex）：S500/20 × 49057；发射（Em）：D535/30 m 47281），mCherry通道（Ex：580/25 × 49829；Em：632/60 m）。
      4. 输入延时实验的适当设置（参见材料表中本研究所用软件）：点击Apps | Multi Dimensional Acquisition。选择第一个标签页Main，并选择timelapse, multiple stage positions和multiple wavelengths。
      5. 选择Saving标签页，输入实验数据的保存位置。
      6. 选择Timelapse标签页，输入时间点数量、总时长和时间间隔。
        注：延时实验的持续时间取决于所研究的动物物种，因为不同物种卵母细胞减数成熟的时间存在差异。在本小鼠卵母细胞实验中，每15分钟记录一次，持续16小时。
      7. 选择Stage标签页。打开明场，通过选择Acquire | Acquire | Show Live打开新窗口来定位卵母细胞。找到卵母细胞后，切换回Multi Dimensional Acquisition窗口，按+号设定卵母细胞的位置。
      8. 选择Wavelengths标签页，设置三种不同波长：明场（曝光15 ms）、YFP（Ypet/IL7 3' UTR，曝光150 ms）和mCherry（Ypet/IL7 3' UTR，曝光75 ms）。
        注：根据每种Ypet/3' UTR报告基因的积累水平和注射体积调整曝光时间。确保实验开始时YFP信号处于检测范围的中心，以避免翻译激活时信号低估或饱和。对于mCherry，应根据每批mCherry在多聚腺苷酸化过程中添加的腺嘌呤核苷酸数量调整曝光时间。由于多聚腺苷酸化效率存在差异，建议在不同实验中使用同一批次的mCherry，以便更准确地比较实验结果。
      9. 点击Acquire开始延时实验。参见图2和补充文件，了解单个卵母细胞延时记录的示例。
    4. Ypet-3' UTR翻译分析
      1. 进行此分析时（参见材料表中本研究所用软件），对每个卵母细胞进行两个区域测量：卵母细胞本身——点击ellipse region并围绕卵母细胞绘制椭圆区域——以及靠近卵母细胞的一个小区域，用于背景扣除——点击rectangular region。
        注：确保在延时记录期间卵母细胞未移出所选区域。特别注意在第一极体排出前后区域测量的放置，因为此过程会引起卵母细胞移动，可能干扰记录结果。
      2. 通过先点击Open Log，再点击Log Data，将区域测量数据导出至电子表格中。
      3. 对每个卵母细胞及所有测量时间点，分别从卵母细胞区域测量值中减去背景区域测量值。YFP和mCherry波长的数据需分别处理。
      4. 记录生发泡破裂（GVBD）和第一极体排出（PBE）的时间，以供后续参考。
        注：若小鼠卵母细胞的GVBD时间超过2小时，则将其排除。
      5. 绘制每个卵母细胞随时间变化的YFP和mCherry表达曲线，以检查是否存在异常值。
        注：曲线应平滑，若不平滑，可能表明卵母细胞在记录过程中发生了移动。
      6. 对每个卵母细胞，计算记录中最后十个时间点的平均mCherry表达量。对每个时间点，将YFP表达量除以平均mCherry表达量，以校正注射体积，从而获得每个卵母细胞在每个时间点的YFP/mCherry比值。
      7. 通过线性回归拟合曲线斜率，计算特定时间间隔内的翻译速率。使用统计推断方法评估翻译速率的差异。

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结果

将21日龄C57/BL6小鼠的去颗粒细胞的前期I期阻滞卵母细胞注射含有编码Ypet报告基因与IL-7 3'非翻译区（3' UTR）融合的mRNA以及编码mCherry的mRNA的报告系统混合物。共记录了39个卵母细胞中YFP和mCherry的表达，其中30个进入成熟阶段，9个保持在前期I期作为阴性对照。有3个正在成熟的卵母细胞因出现生发泡破裂（GVBD）延迟（N=2）或在记录过程中发生位移（N=1）而被排除在分析之外。图3展示了前期I期和正在成熟的卵母细胞中mCherry与YFP的表达情况。图4展示了对成熟中卵母细胞YFP表达进行校正后的结果，校正方法为以mCherry表达达到平台期后的平均值（最后10个时间点的mCherry平均表达量）来消除注射体积差异的影响。通过曲线拟合（线性回归）对前期I期及在去除cilostamide后0–2小时或8–10小时内成熟卵母细胞的YFP/mCherry比值进行分析，从而测定报告基因的翻译速率（图5A）。报告基因的累积并不呈...

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讨论

本文所述方法介绍了一种在不同转变阶段研究目标mRNA翻译激活与抑制的策略 体外 卵母细胞减数分裂成熟。IL-7 是由卵母细胞释放的一种细胞因子，可能参与卵母细胞与卵丘细胞之间的通讯8,13，选择该方法用于描述。已知IL-7在卵母细胞成熟过程中翻译水平逐渐升高8 并且能够通过该方法良好地观察翻译激活现象。然而，如果在整个实验过程中翻译以恒定速率进行，则报告蛋白的累积将呈现线性模式，实验开始与结束时的翻译速率将相近。此结论可通过整个记录区间内线性回归的拟合优度（R）进行验证。报告蛋白翻译受到抑制时，YFP信号将表现为平台期。 

Luong 等人.5的研究中提供了3'非翻译区（UTR）翻译抑制的一个实例，该研究报道了在卵母细胞减数分裂成熟过程中卵母细胞分泌蛋白2（Oosp2）的翻译受到抑制。这些数据已被重新分析，并展示于

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM097165、GM116926项目以及尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所（Eunice Kennedy Shriver NICHD）国家生殖与不孕症转化研究研究中心（P50 HD055764）资助，资助对象为Marco Conti。Enrico M. Daldello获得了Lalor基金会奖学金的支持，Natasja G. J. Costermans获得了荷兰科学研究组织（Netherlands Organisation for Scientific Research，NWO）Rubicon奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养基的制备
牛血清白蛋白粉末 BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
西洛他唑EMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
最低必需培养基 Eagle Sigma-AldrichM2645
青霉素-链霉素 100 倍溶液，无菌过滤Genesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
碳酸氢钠 JT-Baker3506-1
丙酮酸钠Gibco 11360-070
超纯蒸馏水Invitrogen10977-015
编码 YFP/3' UTR 和 mCherry 的 mRNA 制备
琼脂糖Apex Biomedical 20-102QD
羧苄青霉素二钠盐Sigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo 克隆试剂盒McLabCCK-20
CutSmart 缓冲液 (10x)New England BiolabsB7204
DNA 上样染料 (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP 溶液New England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA 标准物Thermo FisherSM1333
含 100 µg/mL 羧苄青霉素的 LB 琼脂平板，Teknova TeknovaL1010
LB 培养基（胶囊）MP Biomedicals3002-021
MEGAclear 转录纯化试剂盒Life TechnologiesAM1908
MfeI-HF 限制性内切酶New England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 转录试剂盒InvitrogenAM1344
Phusion 高保真 DNA 聚合酶New England BiolabsM0530
多聚(A)加尾试剂盒InvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 Qiagen27106
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
S.O.C. 培养基Thermo Fisher15544034
TAE 缓冲液 Apex Biomedical 20-193
超纯溴化乙锭溶液Life Technologies15585011
卵母细胞采集
用于校准微量移液器的抽吸管组件Sigma-AldrichA5177-5EA
校准微量移液器Drummond Scientific Company2-000-025 
PMSG-5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide 针头 26 G x 1/2BD305111
1 ml 注射器BD309659
卵母细胞显微注射
35 mm 培养皿 | 0 号盖玻片 | 20 mm 玻璃直径 | 未包被MatTekP35G-0-20-C用于延时显微成像
含丝硼硅酸盐玻璃毛细管Sutter InstrumentBF100-78-10
胚胎培养用油Irvine Scientific9305
培养皿Falcon351006用于显微注射
组织培养皿Falcon353001用于卵母细胞孵育
VacuTip 持卵毛细管Eppendorf5195000036
软件
BiorenderBioRender图 1S 的制备
MetaMorph，版本 7.8.13.0 Molecular Devices 用于延时显微成像、3' UTR 翻译分析 

参考文献

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卵母细胞成熟单卵母细胞检测报告基因积累延时显微成像卵母细胞注射卵丘-卵母细胞复合体翻译调控YFP/mCherry比值
利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序
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