本方案描述了一种报告基因检测方法，用于研究单个卵母细胞中mRNA翻译的调控过程 体外 成熟
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摘要
摘要
与卵母细胞核成熟相关的事件已有详尽描述。然而，关于为受精和获得全能性做准备过程中细胞质内发生的分子通路和生物学过程，目前了解仍较为有限。在卵母细胞成熟过程中，基因表达的变化完全依赖于母源信使RNA（mRNAs）的翻译与降解，而非转录活动。因此，翻译程序的正确执行对于建立卵母细胞支持胚胎发育的发育潜能至关重要。本文属于一系列致力于阐明减数成熟过程及卵母细胞向合子转变期间母源mRNA翻译程序的研究之一。本方法学论文介绍了一种研究特定mRNA在 体外 卵母细胞成熟。在此，将Ypet报告基因融合至目的基因的3'非翻译区（UTR），并与编码mCherry的多聚腺苷酸化mRNA共同显微注射入卵母细胞，以mCherry信号校正注射体积。通过延时显微成像检测报告基因的累积量，计算卵母细胞减数分裂成熟过程中不同阶段的翻译速率。本文以Ypet/白细胞介素-7（IL-7）-3' UTR报告系统为例，详细描述了卵母细胞分离与注射、延时成像记录及数据分析的实验方案。
引言
一个完全成熟的哺乳动物卵母细胞在受精准备及获得全能性过程中会经历快速变化。这些变化对于受精后胚胎发育的维持至关重要。尽管与核成熟相关事件已有相对清晰的描述，但关于卵母细胞胞质中的分子过程和通路仍知之甚少。在卵母细胞成熟的最后阶段，细胞处于转录沉默状态，基因表达完全依赖于mRNA的翻译与降解。1,2因此，对发育能力至关重要的蛋白质合成依赖于在卵母细胞生长期较早合成的长寿命mRNA的定时翻译程序。1,3作为研究减数成熟期及卵母细胞向合子转变过程中母源mRNA翻译程序的一部分，本文介绍了一种在单个卵母细胞中研究靶标母源mRNA翻译激活与抑制的策略 体外 减数成熟
在此方法中，将 YPet 的开放阅读框克隆至目的转录本 3' 非翻译区（3' UTR）的上游。随后，将编码该报告基因的 mRNA 与编码 mCherry 的多聚腺苷酸化 mRNA 共同显微注射到卵母细胞中，以校正注射体积。在实验过程中检测报告基因的累积情况 体外 使用延时显微镜观察卵母细胞减数分裂成熟过程。在单个卵母细胞中记录黄色荧光蛋白（YFP）和mCherry的累积情况，并利用共注射的mCherry达到平台期的水平对YFP信号进行校正。数据采集后，计算....
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方案
涉及动物的实验程序已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号 AN182026）。
1. 培养基的制备
- 按照表1所述，加入所有组分以配制基础卵母细胞采集培养基和卵母细胞成熟培养基。对于基础采集培养基，将pH值调节至7.4。在使用当天，向采集和成熟培养基中均添加3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和1 µM西洛他唑（cilostamide）。
2. 编码Ypet-3' UTR和mCherry的mRNA的制备
- 获取目的mRNA的3′非翻译区序列。
注意：本研究中所用序列此前已从小鼠卵母细胞cDNA中获得。 - 设计引物以从卵母细胞cDNA中扩增目标3'非翻译区，以及pcDNA 3.1载体中含有Ypet编码序列、V5表位标签和T7启动子的部分。
- 使用高保真DNA聚合酶试剂盒进行扩增。将聚合酶链式反应（PCR）产物在琼脂糖凝胶上电泳，检测片段大小是否正确，切下目标条带，并根据试剂盒说明书使用凝胶回收试剂盒从凝胶中提取DNA。
- 使用PCR克隆试剂盒将PCR片段连接至载体。
注意：PCR 片段在冰上孵育 4 小时，以促进更高效的重组反应。这与制造商推荐的仅孵育 45 分钟的说明相反。 - 将PCR片段转染至感受态细胞中....
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结果
将21日龄C57/BL6小鼠的去颗粒细胞的前期I期阻滞卵母细胞注射含有编码Ypet报告基因与IL-7 3'非翻译区（3' UTR）融合的mRNA以及编码mCherry的mRNA的报告系统混合物。共记录了39个卵母细胞中YFP和mCherry的表达，其中30个进入成熟阶段，9个保持在前期I期作为阴性对照。有3个正在成熟的卵母细胞因出现生发泡破裂（GVBD）延迟（N=2）或在记录过程中发生位移（N=1）而被排除在分析之外。图3展示了前期I期和正在成熟的卵母细胞中mCherry与YFP的表达情况。图4展示了对成熟中卵母细胞YFP表达进行校正后的结果，校正方法为以mCherry表达达到平台期后的平均值（最后10个时间点的mCherry平均表达量）来消除注射体积差异的影响。通过曲线拟合（线性回归）对前期I期及在去除cilostamide后0–2小时或8–10小时内成熟卵母细胞的YFP/mCherry比值进行分析，从而测定报告基因的翻译速率（图5A）。报告基因的累积并不呈.......
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讨论
本文所述方法介绍了一种在不同转变阶段研究目标mRNA翻译激活与抑制的策略 体外 卵母细胞减数分裂成熟。IL-7 是由卵母细胞释放的一种细胞因子，可能参与卵母细胞与卵丘细胞之间的通讯8,13，选择该方法用于描述。已知IL-7在卵母细胞成熟过程中翻译水平逐渐升高8 并且能够通过该方法良好地观察翻译激活现象。然而，如果在整个实验过程中翻译以恒定速率进行，则报告蛋白的累积将呈现线性模式，实验开始与结束时的翻译速率将相近。此结论可通过整个记录区间内线性回归的拟合优度（R）进行验证。报告蛋白翻译受到抑制时，YFP信号将表现为平台期。
Luong 等人.5的研究中提供了3'非翻译区（UTR）翻译抑制的一个实例，该研究报道了在卵母细胞减数分裂成熟过程中卵母细胞分泌蛋白2（Oosp2）的翻译受到抑制。这些数据已被重新分析，并展示于
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM097165、GM116926项目以及尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所（Eunice Kennedy Shriver NICHD）国家生殖与不孕症转化研究研究中心（P50 HD055764）资助，资助对象为Marco Conti。Enrico M. Daldello获得了Lalor基金会奖学金的支持，Natasja G. J. Costermans获得了荷兰科学研究组织（Netherlands Organisation for Scientific Research，NWO）Rubicon奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基的制备 | |||
| 牛血清白蛋白粉末 Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| 西洛他唑 | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 最低必需培养基 Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| 青霉素-链霉素 100 倍溶液，无菌过滤 | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| 碳酸氢钠 | JT-Baker | 3506-1 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | |
| 超纯蒸馏水 | Invitrogen | 10977-015 | |
| 编码 YFP/3' UTR 和 mCherry 的 mRNA 制备 | |||
| 琼脂糖 | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| 羧苄青霉素二钠盐 | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo 克隆试剂盒 | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart 缓冲液 (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA 上样染料 (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP 溶液 | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA 标准物 | Thermo Fisher | SM1333 | |
| 含 100 µg/mL 羧苄青霉素的 LB 琼脂平板，Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB 培养基（胶囊） | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear 转录纯化试剂盒 | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF 限制性内切酶 | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 转录试剂盒 | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0530 | |
| 多聚(A)加尾试剂盒 | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. 培养基 | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE 缓冲液 | Apex Biomedical | 20-193 | |
| 超纯溴化乙锭溶液 | Life Technologies | 15585011 | |
| 卵母细胞采集 | |||
| 用于校准微量移液器的抽吸管组件 | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| 校准微量移液器 | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG-5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide 针头 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| 1 ml 注射器 | BD | 309659 | |
| 卵母细胞显微注射 | |||
| 35 mm 培养皿 | 0 号盖玻片 | 20 mm 玻璃直径 | 未包被 | MatTek | P35G-0-20-C | 用于延时显微成像 |
| 含丝硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| 胚胎培养用油 | Irvine Scientific | 9305 | |
| 培养皿 | Falcon | 351006 | 用于显微注射 |
| 组织培养皿 | Falcon | 353001 | 用于卵母细胞孵育 |
| VacuTip 持卵毛细管 | Eppendorf | 5195000036 | |
| 软件 | |||
| Biorender | BioRender | 图 1S 的制备 | |
| MetaMorph，版本 7.8.13.0 | Molecular Devices | 用于延时显微成像、3' UTR 翻译分析 |
参考文献
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigati....
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重印与许可
