本研究旨在开发一种新型的人类类器官视网膜培养（HORC）模型，以防止在移植体操作过程中破坏视网膜的完整性。该目标通过将视网膜与其上方的玻璃体以及下方的视网膜色素 上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜共同培养来实现。
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摘要
摘要
既往的人类器官型视网膜培养（HORC）模型采用的是分离的视网膜；然而，由于缺乏视网膜色素上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜提供的结构支持，脆弱的视网膜完整性容易受到破坏。本研究旨在建立一种新型的HORC模型，该模型包含视网膜、RPE-脉络膜和巩膜，以在培养视网膜外植体时维持视网膜的完整性。
在沿角膜缘环形剪开以去除虹膜和晶状体后，进行四次深部切口以展平眼球杯。与以往的 HORC 方案不同，本实验使用环钻不仅切割视网膜，还穿透视网膜色素上皮层-脉络膜及巩膜。所得的三层结构外植体被培养 72 小时。采用苏木精和伊红染色（H&E）评估组织解剖结构，并通过免疫组织化学（IHC）进一步表征视网膜外植体的细胞凋亡、Müller 细胞完整性以及视网膜炎症情况。为验证疾病诱导的可能性，将外植体暴露于高葡萄糖（HG）和促炎性细胞因子（Cyt）环境中，以模拟糖尿病视网膜病变（DR）。使用 Luminex 磁珠法检测培养基中释放的与 DR 相关的细胞因子。
H&E 染色显示，保留下方 RPE-脉络膜和巩膜的视网膜外植体具有明显的视网膜层状结构和致密的细胞核，而缺乏下方结构的视网膜则表现出厚度减少和严重的细胞核丢失。免疫组化结果表明，无细胞凋亡和视网膜炎症，且 Müller 细胞完整性得以保持。Luminex 检测显示，与基线水平相比，暴露于高糖+细胞因子（HG + Cyt）24 小时的视网膜外植体中与糖尿病视网膜病变（DR）相关的促炎细胞因子分泌显著增加。
我们成功开发并表征了一种新型的HORC方案，在该方案中，视网膜完整性得以保持，且无细胞凋亡或视网膜炎症发生。此外，当视网膜外植体暴露于高糖加细胞因子（HG + Cyt）时，可诱导糖尿病视网膜病变（DR）相关促炎生物标志物的分泌，表明该模型可用于具有临床转化价值的视网膜疾病研究。
引言
视网膜是一种高度特化的ocular结构，负责将入射的光能转化为电信号，随后由大脑处理以实现视觉感知。人类视网膜包含多种动态变化的细胞类型，这些细胞在独特的层状结构中高度有序排列，形成两个突触层和三个核层1（图1）。视网膜稳态依赖于神经视网膜细胞、血管、神经、结缔组织以及视网膜色素上皮（RPE）之间复杂的相互连接1。由于视网膜结构和生理功能的高度复杂性，许多视网膜疾病的发病机制至今仍不甚清楚2,3,4,5。为了更深入地研究视网膜疾病，研究人员已开发出人眼视网膜类器官（HORC）模型6,7,8,9。与动物实验和体外培养相比，HORC模型具有优势，因其能够在原位保留动态的细胞环境和复杂的神经血管相互作用，从而为临床转化研究提供了一个良好的模型。
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方案
人眼供体眼杯取自新西兰国家眼库，在角膜被切除用于移植后获得，并经北区B健康与残疾伦理委员会（NTX/06/19/CPD/AM07）批准。
注意：培养操作应在II级生物安全柜中进行，以确保无菌的组织培养条件。组织必须在死亡后24小时内进行培养，以避免视网膜完整性显著丧失。
图2：显示获取夹心式视网膜外植体操作步骤的图像。 用于组织块制备时，应使用一端尖锐、一端钝头的解剖剪，操作时将钝端朝向眼球内部，以减少切口过程中对组织的损伤。同时使用钝头镊子，避免在操作过程中刮伤眼内组织。使用手术剪沿角膜缘环形剪切，钝端朝向眼球内部，以去除虹膜和晶状体（A-C）。如果直接观察打开的眼杯，便可找到视神经乳头（ONH）。D）。使用钝头镊子夹住巩膜以固定眼球（E）。通过做两个向视神经乳头（....
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结果
该 HORC 模型中视网膜结构完整性得以保留。在培养的夹心式视网膜外植体中，视网膜结构完整性得以维持，而在无邻近结构共培养的视网膜中则丧失。通过 H&E 染色检测培养 72 小时后切片的夹心式视网膜外植体的结构完整性。夹心式视网膜外植体显示出良好的完整性，从神经节细胞层（GCL）到外核层（ONL）具有清晰的层状结构，且内核层（INL）和 ONL 的细胞核排列紧密（图 4A）。然而，在同一标本的边缘区域发现视网膜完整性遭到破坏，此处视网膜已从下方的视网膜色素上皮-脉络膜（RPE-choroid）及巩膜脱离，表现为视网膜厚度减小，且 INL 与 ONL 中细胞核严重丢失（图 4B）。
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讨论
HORC 目前是临床前视网膜研究中最具临床转化潜力的模型。与体外细胞培养模型相比，HORC 能够更好地保留人类视网膜在体内的解剖结构，包括动态的视网膜细胞类型及其与神经元、血管系统以及细胞外环境的连接19。与动物模型相比，由于物种间存在差异（例如不同的视网膜细胞类型以及光感受器密度和比例的差异），HORC 在研究人类视网膜疾病的病理生理机制及设计药物治疗方案方面更具优势；这些物种差异可能导致动物模型中获得阳性结果，但在临床试验中却失败19。然而，在以往的 HORC 操作方案中，视网膜被有意地从 RPE-脉络膜和巩膜上分离。由于缺乏坚韧的巩膜支撑，脆弱的视网膜在操作时难以处理，若直接使用镊子夹持，可能损害视网膜完整性6,7,8,9。这一点已有证据支持：先前使用分离视网膜的研究报道，在培养 7.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢慷慨捐赠眼组织的 donors 以及新西兰国家眼库团队的支持。本研究得到了 Maurice 和 Phyllis Paykel 信托基金和奥克兰医学研究基金会（项目编号：1117015）的项目资助。IDR 的主任职位由 Buchanan 慈善基金会提供支持。CK 的奖学金由新西兰验光师协会教育与研究基金（编号：CC36812）提供，HHL 的奖学金由 Buchanan 慈善基金会提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一次性活检打孔器（5 mm） | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | 本文中称为手术环钻 |
| 人重组 IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | 工作浓度：10 ng/mL |
| 人重组 TNF-α | Peprotech, USA | 300-01A | 工作浓度：10 ng/mL |
| DAPI（1 µg/mL） | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | 细胞核染色剂，工作稀释比例为 1:1000 |
| DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂 | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | 含 GlutaMAX 的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）营养混合物 F-12，包含 1× 抗生素和抗真菌剂混合液（AA，100× 储存液） |
| 精细剪刀——尖端一端锋利、一端钝 | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | 尖端类型：一端锋利一端钝，刃口长度：27 mm，总长：10 cm，合金/材料：不锈钢，是否带齿：否，尖端形状：直型 |
| Graefe 镊子 | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | 长度：10 cm，尖端形状：直型，尖端类型：带齿，尖端宽度：0.8 mm，尖端尺寸：0.8 × 0.7 mm，合金/材料：不锈钢 |
| 小鼠单克隆 GFAP-Cy3 抗体 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | 与 Cy3 偶联的一抗，工作稀释比例为 1:1000 |
| 小鼠单克隆 Vimentin-Cy3 抗体 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | 与 Cy3 偶联的一抗，工作稀释比例为 1:50 |
| 兔多克隆 TUNEL 抗体（原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素标记） | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | 与荧光素-dUTP 偶联的一抗，使用酶-缓冲液溶液按 1:10 比例稀释后使用 |
参考文献
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
- Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.<....
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