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方法文章

通过使用辐照后的血沉棕黄层来源的饲养细胞分离和培养T淋巴细胞研究主动脉瓣钙化 T淋巴细胞，血沉棕黄层，主动脉瓣钙化，细胞培养，饲养细胞，免疫细胞分离

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DOI：

10.3791/62059

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2021年2月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Campus Benjamin Franklin, Charité Universitätsmedizin Berlin and German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), 2Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Berlin Institute of Health, 4Department of Cardiology, German Heart Centre Berlin (DHZB), 5Sod of Interdisciplinary Internal Medicine, Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi (AOUC), 6Department of General and Interventional Cardiology, Helios Klinikum Erfurt

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究中，我们描述了从钙化主动脉瓣新鲜样本中分离T淋巴细胞的过程，以及利用流式细胞术分析对T细胞克隆进行分析的步骤，以表征适应性白细胞亚群。

摘要

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是一种主动脉瓣从轻度增厚到重度钙化的进行性疾病，尽管已有经导管主动脉瓣置换术（TAVR）等新的治疗手段，该病仍与高死亡率相关。

从瓣膜钙化开始并最终导致重度主动脉瓣狭窄的完整通路目前仍未完全阐明。通过在体外紧密模拟主动脉瓣细胞在体内的状态，对狭窄瓣膜组织中的T淋巴细胞进行检测可能是明确其在钙化发展过程中作用的有效方法。手术切除后，将新鲜的主动脉瓣样本切成小块，分离T淋巴细胞进行培养、克隆，并利用荧光激活细胞分选技术（FACS）进行分析。

染色步骤简单，染色后的样本管还可使用0.5%多聚甲醛固定，并可在15天内进行后续分析。通过该染色方案获得的结果可用于追踪T细胞浓度随干预措施发生的时间依赖性变化，并可进一步拓展以评估特定T细胞亚群的活化状态。在本研究中，我们展示了从新鲜的钙化主动脉瓣样本中分离T细胞的过程，并利用流式细胞术分析T细胞克隆的步骤，以进一步阐明适应性免疫在钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）病理生理学中的作用。

引言

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是最常见的心脏瓣膜疾病之一，对医疗保健系统造成重大影响。近年来，主动脉瓣置换术的实施频率急剧上升，且随着老年人口的持续增长，预计未来还将进一步增加1。

CAVD 的潜在病理生理学机制尚未完全明确，目前的治疗策略仅限于保守治疗或通过外科手术或经皮手术进行主动脉瓣置换。迄今为止，尚无有效的药物治疗方法能够阻止或逆转 CAVD 的进展，且早期出现症状的患者死亡率较高，除非实施主动脉瓣置换术（AVR）2。在重度有症状主动脉瓣狭窄患者中，报道的3年无症状生存率低至20%3。经导管主动脉瓣置换术（TAVR）作为一种新兴治疗选择，彻底改变了高风险患者（尤其是老年患者）的治疗格局，并显著降低了该人群原本较高的死亡率4,5,6。尽管 TAVR 取得了令人鼓舞的成果，但仍需进一步研究以阐明 CAVD 的病理生理机制，从而识别新的早期治疗靶点7,8,9。

既往认为是一种被动的退行性过程，主动脉瓣钙化病（CAVD）如今被认识到是一种主动进展性疾病，其特征是主动脉瓣间质细胞发生成骨细胞样表型转换10。该疾病涉及主动脉瓣叶的进行性钙化、纤维钙化改变以及活动能力下降（硬化），最终导致血流受阻，引起主动脉瓣开口狭窄11。

炎症被认为是钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）病理生理学中的关键过程，类似于血管动脉粥样硬化的过程。内皮损伤导致脂质成分的沉积和积聚，尤其是在主动脉瓣中氧化脂蛋白的沉积12。这些氧化脂蛋白具有细胞毒性，可引发炎症反应，而炎症活动进一步导致钙化。先天性和适应性免疫在CAVD发生及疾病进展中的作用近年来受到关注13。在CAVD患者以及钙化主动脉瓣叶中，已观察到特定记忆T细胞亚群的活化和克隆扩增，因此推测炎症过程至少参与了CAVD的发生，也可能参与疾病的进展14。事实上，尽管抗原呈递细胞和巨噬细胞在健康和病变瓣膜中均存在，但T淋巴细胞的存在通常提示主动脉瓣已老化并发生病变。这种淋巴细胞浸润，伴随新生血管形成增加和化生现象，是CAVD典型的组织学特征15。

我们推测主动脉瓣间质细胞与免疫系统的活化之间存在相互作用，这种相互作用可能触发主动脉瓣内慢性炎症过程的启动。检测狭窄性主动脉瓣组织中的T细胞可能是阐明其在钙化发展过程中作用的有效方法，因为这能够较为真实地反映体内主动脉瓣细胞的状态。在本研究中，我们利用主动脉瓣组织分离T淋巴细胞，对其进行培养和克隆，并随后通过荧光激活细胞分选技术（FACS）对其进行表征。新鲜的主动脉瓣样本取自因重度主动脉瓣狭窄而接受外科瓣膜置换术的CAVD患者。手术切除后，将新鲜瓣膜样本切成小块，随后培养T细胞，进行克隆，并通过流式细胞术进行分析。染色步骤简便，染色后的样本管可用0.5%多聚甲醛固定，并在15天内完成检测。通过该染色方案获得的数据可用于追踪干预措施下T淋巴细胞分布随时间的变化情况，并可进一步拓展用于评估特定T细胞亚群的活化状态。

由于存在自发荧光等问题，钙化组织的提取、从钙化组织中分离白细胞，尤其是对该类组织进行流式细胞术分析均具有较大挑战性。目前针对这一特定目的的实验方案在文献中极为少见16,17,18。本文介绍了一种专门用于直接从人主动脉瓣样本中分离和培养T淋巴细胞的实验方案。淋巴细胞的克隆扩增是适应性免疫的典型特征，体外研究该过程可深入揭示淋巴细胞异质性的水平19。经过三周的培养后，各克隆已获得足够数量的T细胞，可用于表型和功能研究，此时T细胞克隆已具备传代条件。随后通过流式细胞术对T细胞克隆的表型进行分析。

本免疫学实验方案改编自 Amedei 等人先前建立的人体组织中T细胞分离与表征方法，特别适用于钙化的人体组织，例如钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）20,21,22。本文所述利用辐照过的血沉棕黄层（buffy coat）分离外周血单个核细胞（PBMCs）的方案，提供了一种高效获取饲养细胞（FC）的方法，专为从瓣膜间质细胞中分离的T淋巴细胞克隆阶段而优化。饲养层由生长停滞但仍具有活力和生物活性的细胞组成。饲养细胞在支持从瓣膜间质细胞中分离的T淋巴细胞体外存活与增殖方面发挥着重要作用23。为防止饲养细胞在培养过程中增殖，必须使其进入生长停滞状态。该目的可通过两种方式实现：物理方法（如辐照）或使用细胞毒性化学试剂处理，例如丝裂霉素C（MMC）——一种可直接应用于培养表面的抗肿瘤抗生素24。本文展示的是通过细胞辐照实现饲养细胞生长停滞的方法。

该方法提供了一种高效且经济的方式，用于从主动脉瓣组织中分离和表征T细胞，有助于拓宽探索钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）病理生理学的免疫学方法范围。

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方案

本研究根据夏里特医院（Charité）确保良好科研实践的章程进行，并遵守了有关隐私和伦理的法律法规。所有人体实验均获得伦理委员会批准，且依据伦理申请表中报告的规定，维护了患者的隐私和匿名性。

注意：以下方案中使用的是新鲜的人类狭窄瓣膜样本。

1. 试剂准备

  1. 通过在RPMI 1640培养基中添加非必需氨基酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和青霉素-链霉素（Pen/Strep）来制备富集型RPMI完全培养基。使用前过滤，于+4 °C保存，并在两个月内使用完毕。
  2. 在克隆阶段使用富集型RPMI 1640完全培养基，并加入热灭活的胎牛血清（FBS）、HB基础培养基、50 U白细胞介素2（IL-2）和人血清（HS），配制细胞培养基（CCM）。过滤后当日使用，不得保存。
  3. 在换液阶段使用富集型RPMI 1640完全培养基，并加入FBS、HB基础培养基、30 U IL-2和HS，配制细胞培养基。过滤后当日使用，不得保存。
  4. 制备含有250 mL RPMI和5 mL青霉素-链霉素（Pen/Strep）的洗涤缓冲液。于+4 °C保存，两个月内使用完毕。

2. 人T淋巴细胞的分离及T-25培养瓶培养

  1. 将狭窄瓣膜样本放入盛有洗涤缓冲液的无菌培养皿中，确保整个瓣膜样本均被液体覆盖，静置15分钟。
  2. 使用解剖刀将狭窄瓣膜切成小块，再次静置10分钟。
  3. 按照先前所述方法配制含50 U IL-2的细胞培养基，并进行过滤。
  4. 将CCM加入T25培养瓶中，使用无菌塑料镊子将瓣膜组织块放入培养瓶内。
  5. 将培养瓶垂直置于CO2培养箱中培养一周，期间需定期在显微镜下观察培养瓶状态。T细胞克隆通常在培养后约三天可见；为便于观察，建议在显微镜检查前将培养瓶水平放置20分钟。
    ​注意：细胞培养基的用量取决于样本量及所用T25培养瓶的数量。考虑到每块瓣膜组织在培养瓶中需要10 mL CCM，因此每个T25培养瓶中加入25 mL CCM可容纳3块瓣膜组织。

3. 克隆阶段

注意：进行T细胞克隆阶段时，必须按照外周血单个核细胞（PBMCs）实验方案，从经辐照的血沉棕黄层（BC）中开始分离饲养细胞。

  1. 在超净工作台内，使用带无针阀门的袋装穿刺器打开 BC 袋 将50 mL血液转移至T150培养瓶中，加入70 mL PBS稀释瓶内血液。
  2. 取四个50 mL锥形管，每管中加入20 mL密度梯度介质，然后小心地将30 mL血液覆盖于其上。
  3. 离心25分钟 800 × g，20 °C，关闭离心刹车。
  4. 小心吸除上清液，并作为废液丢弃。将PBMC环收集至新的50 ml锥形管中，加入PBS溶液至终体积50 ml。
  5. 在 400 × g 和 20 °C 条件下离心 10 分钟。
  6. 弃去上清液，加入PBS溶液至终体积为50 mL，重悬沉淀。在400 × g、20 °C条件下离心10分钟，重复离心步骤。
  7. 弃去上清液，将FCs重悬于10 mL细胞培养基中。
  8. 取一个新的收集管，加入9.9 mL PBS和来自含FCs及细胞培养基管中的100 µL样本，将FCs以1:10的比例用PBS稀释。用移液器充分混匀后，从此稀释液中取出7 µL，在显微镜下进行细胞计数。
  9. 准备克隆阶段的细胞培养基：将70 mL培养基加入50 U IL-2，然后分装至两个50 mL锥形管中，每管含25 mL细胞培养基，具体如下所示：
    • 1号管：25 mL CCM + FCs + 0.6% 植物血凝素（PHA）
    • 2号管：25 mL CCM + T淋巴细胞
      注意：PBMCs 方法的目的是获得 2 x 106 每毫升所需细胞数，因此需相应计算所制备的25 mL CCM（试管1）。通用计算公式为：计数得到的细胞数 × 106：1 mL = CCM × 106X

4. 多孔板中T淋巴细胞的培养

  1. 使用电子移液器收集烧瓶内的所有细胞培养基，并转移至一个 50 mL 圆锥管中。空烧瓶可丢弃。
  2. 在 400 × g、20 °C 条件下离心 10 分钟，使细胞沉淀。
  3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 50 mL PBS 中，并在 400 × g、20 °C 条件下离心 10 分钟以收集细胞。重复此步骤两次。
  4. 弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL CCM 中。从此稀释液中取 7 µL，在显微镜下进行细胞计数。
    注意：显微镜下计得的细胞数需乘以计数室体积和稀释倍数。
  5. 将计数后的细胞用细胞培养基从 105 稀释至 103，然后从 103 稀释液中取 500 µL 加入 2 号管中。
  6. 将 1 号管中的 25 mL 细胞培养基倒入一个 100 mm × 15 mm 的塑料培养皿中。
  7. 取四个 96 孔 U 型底多孔板，使用设定为 100 µL 的多通道移液器向每孔接种 FCs。
  8. 取 2 号管，将其中的细胞培养基倒入一个培养皿中。使用设定为 100 µL 的多通道移液器，向每孔接种 T 细胞。
  9. 将多孔板置于 CO2 培养箱中孵育一周。

5. 首次再喂养阶段

  1. 使用经辐照的血沉棕黄层袋，按照前述方法中的PBMCs方法获取FCs。
  2. 准备适量不含PHA的CCM，并进行过滤。
  3. 使用多通道移液器，从每个孔中移除100 µL液体，注意不要触碰孔底。
  4. 向所有孔中加入100 µL FCs作为饲养层，以提供细胞培养所需的营养并更换培养基。
    ​注意：每个多孔板建议使用6 mL CCM，因此4个多孔板所需的推荐总量约为30 mL。每两周需向CCM中添加一次PHA（PHAs量为CCM总体积的0.4%）。

6. 第二次重新喂养阶段

  1. 按照上述传代方法重复进行再喂养阶段，需向细胞培养基中添加0.4% PHA。

7. 第一次分种阶段：从每样本1孔变为每样本2孔

  1. 在显微镜下检查所有四个多孔板，对含有T细胞克隆（TCCs）的孔进行传代操作。
  2. 按照PBMCs操作流程，从经辐照处理的血沉棕黄层血袋中分离饲养细胞（FCs）。
  3. 配制含30 U IL-2的细胞培养基。加入饲养细胞，并取一个新的U型底96孔多孔板备用。
  4. 将移液器设定为100 µL，冲洗所选样本孔的内壁，并将每孔原有的200 µL体积均分至新多孔板中的两个新孔，使每个新孔的终体积为100 µL。
  5. 向所有新孔中各加入100 µL饲养细胞，确保每孔总体积为200 µL。
  6. 将移液器设定为100 µL，额外向两个仅含饲养细胞的孔中各加入100 µL，作为对照。
    ​注意：使用光学显微镜观察所有多孔板，以确定哪些孔中T细胞克隆（TCC）已成功生长。为便于克隆筛选，可与对照孔（仅含饲养细胞的两个孔）进行比较，克隆孔中的细胞通常比对照孔颜色更深、体积更大。应选择含有大而清晰、圆形且淋巴细胞密集聚集的克隆的孔。若在两次换液两周后仍未见T细胞克隆生长，建议再等待一周并进行一次额外的换液操作。

8. 第二轮分样：从每样本2孔到每样本4孔

  1. 将移液器调至 100 µL，用其充分冲洗每个样本的两个孔，并为每个样本接种两个新的含 100 µL 培养基的孔。
  2. 准备含有 30 U IL-2 的细胞培养基，按照 PBMCs 技术从血沉棕黄层袋中分离 FCs，并将 FCs 置入 CCM 中。
  3. 将移液器调至 100 µL，将 FCs 接种至所有孔中。将多孔板置于 CO2 培养箱中培养一周。

9. 第三轮分样阶段：从每样本4孔到每样本8孔：

  1. 使用多通道移液器吸取100 µL，冲洗每个样本的四个孔内壁，然后向新96孔板中的四个新孔每孔接种100 µL。
  2. 制备细胞培养基，并按照PBMCs技术从经辐照的血沉棕黄层袋中分离FCs。
  3. 将FCs放入CCM中。将移液器设定为100 µL，向所有孔中接种FCs。将多孔板置于CO2培养箱中培养一周。

10. 流式细胞术分析

  1. 从 CO2 培养箱中取出日期最早的多孔板，并找出需分析样品编号对应的收集管。
  2. 使用多通道移液器（设定体积为 200 µL，装有 2 个吸头），彻底冲洗同一样品的两个孔内，然后将液体全部转移至同一个收集管中。对所有样品重复此步骤。
    ​注意：FCs 样品不进行分析，因其仅作为对照使用。

11. 流式细胞术分析用抗体染色方案的制备

  1. 每管加入 1 mL PBS 溶液，在 400 × g 和 20 °C 条件下离心 10 分钟。
  2. 离心结束后弃去上清液。
    注意：抗体染色组合见表 1。每种单个抗体的计算用量约为 2 µL/样本。建议在使用前短暂离心抗体管。为防止荧光素偶联抗体见光降解，所有操作步骤均需避光进行。
  3. 在 1.5 mL 离心管中配制抗体混合液，并涡旋混匀。
  4. 将抗体加入各样本中，避光、室温孵育 15 分钟。
  5. 每份样本中加入 1 mL PBS 溶液，在 400 × g 和 20 °C 条件下离心 10 分钟。
  6. 弃去上清液，用 500 µL PBS 溶液重悬沉淀。
  7. 进行流式细胞仪分析（FACS 分析，表 1）。
    注意：染色后的样本可用 PBS 溶液稀释的 0.5% 多聚甲醛（PFA）固定，并可在 15 天内进行分析。
    ​警告：PFA 具有毒性，操作时需谨慎。
标记物荧光染料
CD3PE/Cy7
CD4Alexa Fluor 488
CD8Brilliant violet 510
CD14Brilliant violet 421
CD25PE
CD45Brilliant violet 711

表1. 用于检测钙化性主动脉瓣疾病中T淋巴细胞群体的抗体染色组合。

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结果

我们采用一种简单且经济有效的方法，对来自严重主动脉瓣狭窄患者的新鲜主动脉瓣样本中的白细胞群体进行表征（参见实验方案）。分离外周血单个核细胞（PBMCs）的方法是获得饲养细胞的关键步骤，这些饲养细胞在实验的每个阶段（克隆、换液和传代阶段）均被使用，并可用于检测和表征主动脉瓣样本中浸润的白细胞。该方法的关键步骤如图1所示。

显示样品管、组分分离和细胞培养结果的离心过程示意图
图1．从血沉棕黄层中分离FCs。（A）血液覆盖于密度梯度介质上（B）离心后获得的白细...

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讨论

本文介绍了一种利用流式细胞术对从狭窄的主动脉瓣样本中分离出的T淋巴细胞亚群进行表征的方法。该方法需要使用经辐照的血沉棕黄层（buffy coat）来分离外周血单个核细胞（PBMCs）。血沉棕黄层袋必须接受9000 Rad/90 Gray (Gy) 的辐射剂量，这是阻止饲养细胞增殖的关键步骤。来自血沉棕黄层袋的细胞仅作为饲养细胞，为从瓣膜中分离出的T细胞提供营养支持。若使用未经辐照的血沉棕黄层袋，则会促进PBMCs在培养中的增殖，这一点在以往研究中已有报道25。当辐射剂量低于90 Gy时，也观察到PBMCs在培养中发生增殖，因此我们建议必须使用恰好90 Gy的辐射剂量。值得注意的是，建议在辐照当天或最迟次日使用辐照后的血沉棕黄层，并将其置于持续振荡的装置中保存。该方法的另一个关键步骤可能是淋巴细胞克隆阶段，该阶段可能受到人为因素的影响；为避免此类情况，我们对新鲜的主动脉瓣样本进行FACS分析。T淋巴细胞的克隆步骤相较于仅分析一份新鲜样本，能够获得更多的T细胞克隆（平均每瓣膜可获得约15个T细胞克隆），从而更有利于进行表型和功能分析。本研究团队已多年应用该克隆技术，且根据所分析组织类型的不同，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本方案所使用的所有血沉棕黄层袋均由Charité Benjamin Franklin放射科的Peter Rosenthal博士、Dirk Böhmer博士及整个团队提供并进行辐照处理。本研究由德国心脏病学会（DGK）提供奖学金资助，奖学金获得者为Mary Roxana Christopher。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 塑料注射器Fisherbrand9000701
96孔U型底多孔板Greiner Bio-One10638441
袋装穿刺器（无针）SigmaP6148用 PBS 稀释至 4%
CD14 Brilliant Violet 421 Biolegend560349
CD25 PE Biolegend302621
CD3 PE/Cy7 Biolegend300316
CD4 Alexa Fluor 488 Biolegend317419
CD45 Brilliant Violet 711 Biolegend304137
CD8 Brilliant Violet 510 Biolegend301047
Eppendorf管 1.5 mLEppendorf13094697
Eppendorf管 0.5 mL赛默飞世尔科技AB0533
Falcon 15 mL 圆锥形离心管Falcon10136120
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Falcon10788561
Falcon 圆底聚苯乙烯管BD2300E
快速读取102塑料计数室KOVA 国际630-1893
250 mL 培养基滤器NalgeneThermo Fisher Scientific168-0045
500 mL 培养基滤器NalgeneThermo Fisher Scientific166-0045
HB 101 冻干补充剂Irvine ScientificT151
HB基础培养基Irvine ScientificT000
热灭活胎牛血清（Fetal Bovine Serum）EurocloneECS0180L
人血清（HS）Sigma AldrichH3667
人IL-2 ISMiltenyi Biotec130-097-744
L-谷氨酰胺Gibco11140050
LymphoprepFalcon352057
非必需氨基酸溶液Sigma11082132001
多聚甲醛赛默飞世尔科技10538931
PBS（磷酸盐缓冲液）赛默飞世尔科技10010023
青霉素/链霉素Gibco1507006310000 U/mL
PHA（植物血凝素）干细胞技术7811
塑料培养皿赛默飞世尔科技R80115TS10 mm × 15 mm
RPMI 1640 培养基HyClone15-040-CV
丙酮酸钠Gibco（生命技术公司）11360070
0.45 微米注射器滤器µlRotilabo 注射器滤器P667.1
T-25 细胞培养瓶InvitrogenThermo Fisher ScientificAM9625
T-75 细胞培养瓶赛默飞世尔科技10232771
β- 巯基乙醇GibcoA2916801

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