通过使用辐照后的血沉棕黄层来源的饲养细胞分离和培养T淋巴细胞研究主动脉瓣钙化 T淋巴细胞，血沉棕黄层，主动脉瓣钙化，细胞培养，饲养细胞，免疫细胞分离

摘要

本研究中，我们描述了从钙化主动脉瓣新鲜样本中分离T淋巴细胞的过程，以及利用流式细胞术分析对T细胞克隆进行分析的步骤，以表征适应性白细胞亚群。

摘要

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是一种主动脉瓣从轻度增厚到重度钙化的进行性疾病，尽管已有经导管主动脉瓣置换术（TAVR）等新的治疗手段，该病仍与高死亡率相关。

从瓣膜钙化开始并最终导致重度主动脉瓣狭窄的完整通路目前仍未完全阐明。通过在体外紧密模拟主动脉瓣细胞在体内的状态，对狭窄瓣膜组织中的T淋巴细胞进行检测可能是明确其在钙化发展过程中作用的有效方法。手术切除后，将新鲜的主动脉瓣样本切成小块，分离T淋巴细胞进行培养、克隆，并利用荧光激活细胞分选技术（FACS）进行分析。

染色步骤简单，染色后的样本管还可使用0.5%多聚甲醛固定，并可在15天内进行后续分析。通过该染色方案获得的结果可用于追踪T细胞浓度随干预措施发生的时间依赖性变化，并可进一步拓展以评估特定T细胞亚群的活化状态。在本研究中，我们展示了从新鲜的钙化主动脉瓣样本中分离T细胞的过程，并利用流式细胞术分析T细胞克隆的步骤，以进一步阐明适应性免疫在钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）病理生理学中的作用。

引言

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是最常见的心脏瓣膜疾病之一，对医疗保健系统造成重大影响。近年来，主动脉瓣置换术的实施频率急剧上升，且随着老年人口的持续增长，预计未来还将进一步增加¹。

CAVD 的潜在病理生理学机制尚未完全明确，目前的治疗策略仅限于保守治疗或通过外科手术或经皮手术进行主动脉瓣置换。迄今为止，尚无有效的药物治疗方法能够阻止或逆转 CAVD 的进展，且早期出现症状的患者死亡率较高，除非实施主动脉瓣置换术（AVR）²。在重度有症状主动脉瓣狭窄患者中，报道的3年无症状生存率低至20%³。经导管主动脉瓣置换术（TAVR）作为一种新兴治疗选择，彻底改变了高风险患者（尤其是老年患者）的治疗格局，并显著降低了该人群原本较高的死亡率^4,5,6。尽管 TAVR 取得了令人鼓舞的成果，但仍需进一步研究以阐明 CAVD 的病理生理机制，从而识别新的早期治疗靶点^7,8,9。

方案

本研究根据夏里特医院（Charité）确保良好科研实践的章程进行，并遵守了有关隐私和伦理的法律法规。所有人体实验均获得伦理委员会批准，且依据伦理申请表中报告的规定，维护了患者的隐私和匿名性。

注意：以下方案中使用的是新鲜的人类狭窄瓣膜样本。

1. 试剂准备

1. 通过在RPMI 1640培养基中添加非必需氨基酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和青霉素-链霉素（Pen/Strep）来制备富集型RPMI完全培养基。使用前过滤，于+4 °C保存，并在两个月内使用完毕。
2. 在克隆阶段使用富集型RPMI 1640完全培养基，并加入热灭活的胎牛血清（FBS）、HB基础培养基、50 U白细胞介素2（IL-2）和人血清（HS），配制细胞培养基（CCM）。过滤后当日使用，不得保存。
3. 在换液阶段使用富集型RPMI 1640完全培养基，并加入FBS、HB基础培养基、30 U IL-2和HS，配制细胞培养基。过滤后当日使用，不得保存。
4. 制备含有250 mL RPMI和5 mL青霉素-链霉素（Pen/Strep）的洗涤缓冲液。于+4 °C保存，两个月内使用完毕。

2. 人T淋巴细胞的分离及T-25培养瓶培养

1. 将狭窄瓣膜样本放入盛有洗涤缓冲液的无菌培养皿中，确保整个瓣膜样本均....

结果

我们采用一种简单且经济有效的方法，对来自严重主动脉瓣狭窄患者的新鲜主动脉瓣样本中的白细胞群体进行表征（参见实验方案）。分离外周血单个核细胞（PBMCs）的方法是获得饲养细胞的关键步骤，这些饲养细胞在实验的每个阶段（克隆、换液和传代阶段）均被使用，并可用于检测和表征主动脉瓣样本中浸润的白细胞。该方法的关键步骤如图1所示。

图1．从血沉棕黄层中分离FCs。（A）血液覆盖于密度梯度介质上（B）离心后获得的白细.......

讨论

本文介绍了一种利用流式细胞术对从狭窄的主动脉瓣样本中分离出的T淋巴细胞亚群进行表征的方法。该方法需要使用经辐照的血沉棕黄层（buffy coat）来分离外周血单个核细胞（PBMCs）。血沉棕黄层袋必须接受9000 Rad/90 Gray (Gy) 的辐射剂量，这是阻止饲养细胞增殖的关键步骤。来自血沉棕黄层袋的细胞仅作为饲养细胞，为从瓣膜中分离出的T细胞提供营养支持。若使用未经辐照的血沉棕黄层袋，则会促进PBMCs在培养中的增殖，这一点在以往研究中已有报道²⁵。当辐射剂量低于90 Gy时，也观察到PBMCs在培养中发生增殖，因此我们建议必须使用恰好90 Gy的辐射剂量。值得注意的是，建议在辐照当天或最迟次日使用辐照后的血沉棕黄层，并将其置于持续振荡的装置中保存。该方法的另一个关键步骤可能是淋巴细胞克隆阶段，该阶段可能受到人为因素的影响；为避免此类情况，我们对新鲜的主动脉瓣样本进行FACS分析。T淋巴细胞的克隆步骤相较于仅分析一份新鲜样本，能够获得更多的T细胞克隆（平均每瓣膜可获得约15个T细胞克隆），从而更有利于进行表型和功能分析。本研究团队已多年应用该克隆技术，且根据所分析组织类型的不同，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 塑料注射器	Fisherbrand	9000701
96孔U型底多孔板	Greiner Bio-One	10638441
袋装穿刺器（无针）	Sigma	P6148	用 PBS 稀释至 4%
CD14 Brilliant Violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant Violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant Violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf管 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf管 0.5 mL	赛默飞世尔科技	AB0533
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Falcon	10136120
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Falcon	10788561
Falcon 圆底聚苯乙烯管	BD	2300E
快速读取102塑料计数室	KOVA 国际	630-1893
250 mL 培养基滤器	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
500 mL 培养基滤器	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 冻干补充剂	Irvine Scientific	T151
HB基础培养基	Irvine Scientific	T000
热灭活胎牛血清（Fetal Bovine Serum）	Euroclone	ECS0180L
人血清（HS）	Sigma Aldrich	H3667
人IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-谷氨酰胺	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
非必需氨基酸溶液	Sigma	11082132001
多聚甲醛	赛默飞世尔科技	10538931
PBS（磷酸盐缓冲液）	赛默飞世尔科技	10010023
青霉素/链霉素	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA（植物血凝素）	干细胞技术	7811
塑料培养皿	赛默飞世尔科技	R80115TS	10 mm × 15 mm
RPMI 1640 培养基	HyClone	15-040-CV
丙酮酸钠	Gibco（生命技术公司）	11360070
0.45 微米注射器滤器µl	Rotilabo 注射器滤器	P667.1
T-25 细胞培养瓶	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 细胞培养瓶	赛默飞世尔科技	10232771
β- 巯基乙醇	Gibco	A2916801