在此，我们介绍一种简单的方法，该方法结合了RNA荧光原位杂交 将RNA原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光结合，用于可视化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该方案可能有助于加深理解SARS-CoV-2 RNA与宿主相互作用的分子特征，达到单细胞水平。
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本文内容
摘要
摘要
本论文提供了一种原位杂交链式反应（HCR）与免疫荧光联合使用的实验方案，用于在细胞系 及人呼吸道上皮三维（3D）培养模型中可视化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的RNA。该方法依赖于探针定位后启动HCR，从而实现对病毒RNA的高度特异性和高灵敏度成像。分裂引发探针可借助荧光标记的放大分子增强信号，使共聚焦显微镜下的背景荧光几乎可忽略不计。使用不同荧光染料标记放大分子，可实现多种靶标的同步识别。这有助于在组织中绘制感染分布图谱，从而在单细胞水平上更深入地理解病毒的致病机制和复制过程。将该方法与免疫荧光技术结合，有助于进一步阐明宿主与病毒之间的相互作用，包括宿主表观基因组及免疫应答通路的变化。得益于HCR技术的高灵敏度和高特异性，本方案亦可用作诊断工具。还需注意的是，该技术可轻松改造，以适用于检测任何RNA，包括非编码RNA以及未来可能出现的RNA病毒。
引言
SARS-CoV-2 是一种新型的人类β冠状病毒，于2019年底出现，并在数月后引发了一场前所未有的大流行。由于该病毒对科学界而言是全新的，其许多生物学特性及其对宿主细胞的影响仍不明确。因此，若要理解该病毒的基本生物学特征及其对宿主的作用，绘制病毒感染过程中病毒与细胞及组织的嗜性图谱显得尤为重要。目前有多种技术可用于研究病毒与宿主之间的相互作用，包括生化、生物学和物理检测方法。原位杂交是一种常用方法，该方法使用标记的互补DNA、RNA或修饰的核酸探针，使其定位到细胞或组织中的特定DNA或RNA序列。
一种新的RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）方法已被开发出来，该方法通过杂交链式反应（HCR1）放大信噪比，从而提高检测灵敏度。HCR技术可用于在单细胞水平上研究RNA的定位。由于其高特异性、高灵敏度和高分辨率，该方法不仅适用于基础科学研究，也适用于应用型项目，例如疾病诊断。最近，该方法已被成功用于检测定位于完全分化的三维人呼吸道上皮（HAE）培养物中纤毛细胞内的SARS-CoV-2 RNA2。HAE培养物是目前用于在“自然感染""”微环境中研究病毒感染的最先进工具之一3,4。
多篇关于人类冠状病....
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方案
1. 缓冲液的配制
- 配制500 mL 2×PHEM缓冲液，加入18.14 g哌嗪-N,N′-二(2-乙烷磺酸) (PIPES)、6.5 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸 (HEPES)、3.8 g 乙二醇四乙酸 (EGTA) 和 0.99 g 硫酸镁 (MgSO₄)4）。用蒸馏水（dH₂O）定容至约 400 mL2O），搅拌，并使用10 M氢氧化钾（KOH）或氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.0。定容至500 mL，分装为每份50 mL。如需使用，于-20 °C保存。
注意：缓冲液在 pH 达到 7.0 之前不会变澄清。 - 配制37% w/v的多聚甲醛（PFA）储备液。配制50 mL时，称取18.5 g PFA，加入35 mL去离子水2O 置于玻璃瓶中。将瓶子放在带加热的磁力搅拌器上，加入 900 µL 1 M KOH 或 NaOH，搅拌至溶液澄清。冷却后转移至 50 mL 锥形离心管中，用 dH₂O 定容至 50 mL。2O. 该溶液可保存在 -20 °C，直至使用时。
注意：甲醛应在通风橱中操作，并佩戴防护手套和实验服。 - 配制固定液（3.7% PFA，以PHEM缓冲）。配制50 mL时，混合5 mL 37% PFA溶液、25 mL 2× PHEM缓冲液和20 mL dH₂O。2在50 mL锥形离心管中。于....
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结果
本研究中描述的免疫RNA-FISH方案使用了两种细胞体系：Vero细胞系和三维人源化气道上皮（3D HAE）培养物。两种细胞模型的主要步骤如表2所示。在HAE培养物中用于可视化SARS-CoV-2的RNA-FISH方案包含适用于组织样本的典型步骤，即使用100%甲醇进行通透化处理，并通过梯度甲醇-PBS及含0.1% Tween的溶液进行再水化。在完成RNA-FISH后进行免疫荧光染色。采集并处理Z轴层扫图像。
图1显示了模拟接种的对照Vero细胞或感染SARS-CoV-2的细胞中的免疫RNA荧光原位杂交结果。图2显示了模拟接种的对照HAE培养物或感染SARS-CoV-2的培养物中的免疫RNA荧光原位杂交结果。图3展示了Vero细胞中通透化方案.......
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讨论
免疫-RNA-FISH 是一种用于 RNA 与细胞蛋白双重染色的可靠方法。本文描述了一种改良的免疫-RNA-FISH 实验方案，可用于在细胞系和人源气道上皮（HAE）培养物中检测 SARS-CoV-2 RNA 及细胞蛋白。该方案可适用于不同的细胞模型，包括单层细胞或特定组织。该方法基于由特异性探针定位引发的杂交链式反应（HCR）原理。随后，利用分裂引发探针启动荧光标记扩增子对信号进行扩增，在共聚焦显微镜下观察时几乎不产生背景荧光。扩增子可标记不同的荧光染料，并可与针对不同靶标的探针兼容，因此可同时使用。本方案所述操作步骤较为简便，但耗时较长（3–4 天）。然而，其结果具有较低的信噪比，优于使用直接标记荧光探针的其他实验方案。
本研究使用了 Vero 细胞和 HAE 培养物。对于载玻片上的细胞和组织培养中的细胞，需要采用不同的实验方案。主要差异体现在细胞处理方式（无论是在载玻片上还是在膜上）以及所用试剂的用量方面。常规的 RNA-FISH 实验方案需要使用乙醇或甲醇溶液进行通透化处理，并在 -20 °C 下孵育过夜。重要的是，使用去污剂进行通透化处理对免疫荧光更为有利，可将实验流程缩.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了科学与高等教育部对SARS-CoV-2研究的支持，以及国家科学中心资助项目（资助号 UMO2017/27/B/NZ6/02488 致 K.P.，资助号 UMO-2018/30/E/NZ1/00874 致 A.K.-P.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 设备 | |||
| 共聚焦显微镜 LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio 微型摇床-振荡器 | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Galaxy170R 型培养箱 | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort 恒温混匀仪 | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| 材料 | |||
| 15 mm × 15 mm 1号盖玻片 | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL 离心管 | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12孔板 | TTP | 92412 | |
| 锥形离心管 | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| 封口膜（parafilm） | Sigma | P7793-1EA | |
| 移液管（serological pipets） | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| 载玻片（slide glass） | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts 细胞培养小室 | Grainer bio-one | 665641 | |
| 试剂 | |||
| Alexa Fluor 488 标记的二抗 | Invitrogen | ||
| β5-微管蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR 扩增缓冲液 | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | 缓冲液也可自行配制，参见 doi:10.1242/dev.165753：补充信息 |
| HCR 放大剂 B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR 放大剂 B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR 探针杂交缓冲液 | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | 缓冲液也可自行配制，参见 doi:10.1242/dev.165753：补充信息 |
| 针对 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的 HCR 探针组 | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR 探针洗涤缓冲液 | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | 缓冲液也可自行配制，参见 doi:10.1242/dev.165753：补充信息 |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| 七水合硫酸镁 | Sigma | 63138-250G | |
| 甲醇 | Sigma | 32213-1L-M | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | P5655-100G | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| 氯化钾 | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36970 | |
| 氯化钠 | BioShop | SOD001.5 | |
| 二水合柠檬酸三钠 | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| 软件 | |||
| 荧光光谱查看器（Fluorescence Spectraviewer） | 光谱参数建模 | ||
| ImageJ Fiji | 获取和处理 z-stack 图像 |
参考文献
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al.
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