胚胎显微注射及CRISPR/Cas9基因组编辑棉铃虫（Helicoverpa armigera）（Hübner）敲除突变体的鉴定

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对棉铃虫（Helicoverpa armigera (Hübner)）进行胚胎显微注射及敲除突变体鉴定的实验方案。突变体昆虫可用于进一步研究基因功能以及不同基因在体内的相互作用。

摘要

棉铃虫（Helicoverpa armigera）是全球最具破坏性的害虫之一。分子遗传学、生理学、功能基因组学和行为学研究的结合，使H. armigera成为鳞翅目夜蛾科中的模式物种。为了研究不同基因在体内的功能及其相互作用，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/相关蛋白9（Cas9）基因组编辑技术是一种用于开展功能基因组研究的便捷且有效的方法。本研究提供了一套逐步系统的操作流程，以利用CRISPR/Cas9系统在H. armigera中完成基因敲除。文中详细描述了向导RNA（gRNA）的设计与合成过程，随后总结了用于构建向导RNA（gRNA）的基因特异性引物设计、胚胎收集、显微注射、昆虫饲养以及突变体检测等后续步骤。最后，提供了提高基因编辑效率的故障排除建议和注意事项。本方法可为CRISPR/Cas9基因组编辑技术在H. armigera及其他鳞翅目蛾类中的应用提供参考。

引言

基因组编辑技术的应用为在多种物种中获得靶基因突变体提供了高效的工具。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/相关蛋白9（Cas9）系统的出现，为基因组操作提供了一种新方法¹。CRISPR/Cas9系统由引导RNA（gRNA）和Cas9核酸内切酶组成^2,3，其中gRNA可进一步分为两个部分：与靶标互补的CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。gRNA与Cas9核酸内切酶结合形成核糖核蛋白复合物（RNP）。在gRNA引导下，Cas9核酸内切酶通过碱基互补配对被导向基因组的特定位点。Cas9蛋白中的RuvC和HNH结构域在原间隔序列邻近基序（PAM）序列上游三个碱基处切割基因组靶位点，产生双链断裂（DSB）。随后，DNA断裂可通过两种机制进行修复：非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）⁴。双链断裂的修复过程常引入插入或缺失突变，从而失活靶基因，可能导致基因功能完全丧失。因此，CRISPR/Cas9系统具有可遗传性和高特异性，成为在体内鉴定基因功能和分析基因互作的强有力方法⁵。

CRISPR/Cas9 系统具有诸多优势，已被应用于包括生物医学

方案

1. 基因特异性引物的设计与sgRNA的制备

1. 通过PCR扩增和测序分析验证目标基因中的保守基因组区域。从棉铃虫（H. armigera）的基因组DNA中扩增目标基因，并区分外显子与内含子。
   注意：引导序列位点的序列特异性对于避免脱靶基因编辑至关重要。应在靠近基因5'非翻译区（5' UTR）的外显子中搜索可能的引导位点。随后需确保该基因完全丧失功能。sgRNA制备流程的概要如图1所示。
2. 选择sgRNA靶点。使用CRISPR在线工具CRISPOR（版本4.97）(http://crispor.tefor.net/crispor.py) ，在基因的5' UTR附近外显子区域搜索可能的引导位点。将外显子序列输入文本框，并将目标基因组选择为棉铃虫（Helicoverpa armigera，Harm_1.0）。选择PAM（原间隔序列邻近基序）为"20 bp-NGG"，其余参数按照网站用户手册设置为默认值。
3. 比较软件预测的引导序列，选择预测效率最高且错配最少的引导序列，以提高编辑效率并减少脱靶编辑。推荐选用在5' UTR端包含一个或两个G的20 bp引导序列，因其可提高切割效率。
   注意：为获得较大片段的缺失，便于后续步骤中的突变体检测，建议选择跨越外显子区域的一对gRNA。确保两个选定引导序列之间的间距至少为100 bp....

结果

本方案提供了利用CRISPR/Cas9技术获得棉铃虫（H. armigera）基因敲除品系的详细步骤。方案中总结了gDNA筛选、胚胎收集与显微注射、昆虫饲养以及突变体检测等代表性实验结果。

本研究中，目的基因的靶位点位于其第二外显子（图2A）。该位点高度保守，通过琼脂糖凝胶电泳验证了合成的sgRNA的靶向条带片段（图2B、C、D）。

雄性和雌性成虫蛾最初分别饲养在不同的网箱中，以防止提前交配，并尽可能获得足量的胚胎。通常，共收集约300个受精卵，并在单细胞阶段立即注射sgRNA/Cas9蛋白混合物（sgRNA浓度为300-500 ng/µL，Cas9蛋白浓度为20.......

讨论

CRISPR/Cas9 系统的应用为基因功能分析及多个基因间的相互作用研究提供了强有力的技术支持。本文所展示的详细实验方案，演示了通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术在中国棉铃虫（H. armigera）中产生纯合突变体的方法。该可靠的操作流程为在中国棉铃虫（H. armigera）中进行靶向基因突变提供了简便有效的途径。

CRISPR 靶位点的选择可能影响诱变效率³⁷。在本方案中，我们通过比较和分析在线网站 CRISPOR 的多个结果，以获得合适的靶位点。 在计算机模拟中，gRNA 预测具有一些优势。首先，在设计 sgRNA 时，它们可分析棉铃虫（H. armigera）的全基因组，以最小化脱靶效应。上述在线资源以及 CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/） 支持多种鳞翅目昆虫的基因组，这可能有助于其他鳞翅目蛾类的基因编辑。其次，候选 sgRNA 的排序可直接比较其可行性，但不同算法可能导致排序存在一定差异。在两个列表.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2kb DNA ladder	TransGen Biotech	BM101
毛细玻璃管	World Precision Instruments	504949	称为 "毛细玻璃管" 在实验方案中
双面胶带	明尼苏达矿业及制造公司	665
Eppendorf FemtoJet 4i 微注射仪	Eppendorf 公司	E5252000021
Eppendorf InjectMan 4 显微操作仪	Eppendorf 公司	5192000051
Eppendorf Microloader 吸头	Eppendorf 公司	G2835241
GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒	赛默飞世尔科技	A29377
显微镜载玻片	Sail Brand	7105
奥林巴斯显微镜	奥林巴斯株式会社	SZX16
PrimeSTAR HS（预混液）	Takara 生物医学技术	R040	用于突变检测
Sutter 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Company	P-1000
TIANamp 基因组DNA试剂盒	天根生化科技公司	DP304-03
TrueCut Cas9 蛋白 v2	赛默飞世尔科技	A36499