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方法文章

胚胎显微注射及CRISPR/Cas9基因组编辑棉铃虫（Helicoverpa armigera）（Hübner）敲除突变体的鉴定

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DOI：

10.3791/62068

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2021年7月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Shenzhen; Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对棉铃虫（Helicoverpa armigera (Hübner)）进行胚胎显微注射及敲除突变体鉴定的实验方案。突变体昆虫可用于进一步研究基因功能以及不同基因在体内的相互作用。

摘要

棉铃虫（Helicoverpa armigera）是全球最具破坏性的害虫之一。分子遗传学、生理学、功能基因组学和行为学研究的结合，使H. armigera成为鳞翅目夜蛾科中的模式物种。为了研究不同基因在体内的功能及其相互作用，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/相关蛋白9（Cas9）基因组编辑技术是一种用于开展功能基因组研究的便捷且有效的方法。本研究提供了一套逐步系统的操作流程，以利用CRISPR/Cas9系统在H. armigera中完成基因敲除。文中详细描述了向导RNA（gRNA）的设计与合成过程，随后总结了用于构建向导RNA（gRNA）的基因特异性引物设计、胚胎收集、显微注射、昆虫饲养以及突变体检测等后续步骤。最后，提供了提高基因编辑效率的故障排除建议和注意事项。本方法可为CRISPR/Cas9基因组编辑技术在H. armigera及其他鳞翅目蛾类中的应用提供参考。

引言

基因组编辑技术的应用为在多种物种中获得靶基因突变体提供了高效的工具。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/相关蛋白9（Cas9）系统的出现，为基因组操作提供了一种新方法1。CRISPR/Cas9系统由引导RNA（gRNA）和Cas9核酸内切酶组成2,3，其中gRNA可进一步分为两个部分：与靶标互补的CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。gRNA与Cas9核酸内切酶结合形成核糖核蛋白复合物（RNP）。在gRNA引导下，Cas9核酸内切酶通过碱基互补配对被导向基因组的特定位点。Cas9蛋白中的RuvC和HNH结构域在原间隔序列邻近基序（PAM）序列上游三个碱基处切割基因组靶位点，产生双链断裂（DSB）。随后，DNA断裂可通过两种机制进行修复：非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）4。双链断裂的修复过程常引入插入或缺失突变，从而失活靶基因，可能导致基因功能完全丧失。因此，CRISPR/Cas9系统具有可遗传性和高特异性，成为在体内鉴定基因功能和分析基因互作的强有力方法5。

CRISPR/Cas9 系统具有诸多优势，已被应用于包括生物医学6,7、基因治疗8,9和农业10,11,12在内的多个领域，并已在多种生物系统中得到应用，包括微生物13、植物14,15、线虫16和哺乳动物17。在无脊椎动物中，许多昆虫物种已接受 CRISPR/Cas9 基因组编辑，如果蝇 Drosophila melanogaster 及其他多种昆虫18,19,20,21,22。

Helicoverpa armigera 是全球最具破坏性的害虫之一23，可危害多种作物，包括棉花、大豆和高粱24,25。随着测序技术的发展，H. armigera 以及多种鳞翅目昆虫的基因组已被完整测序26,27,28,29。近年来，已从这些昆虫中鉴定并表征了大量抗性基因和嗅觉受体基因19,27,28,29。在 H. armigera 中已鉴定出一些与抗性相关的基因，例如编码钙黏蛋白的基因30、ATP结合盒转运蛋白基因31,32，以及 HaTSPAN133。利用 CRISPR/Cas9 技术敲除这些基因可使敏感品系对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，BT）毒素产生高水平抗性。此外，Chang 等人（2017）敲除了一种信息素受体，验证了其在交配时间调控中的重要作用19。这些研究结果表明，CRISPR/Cas9 可作为在昆虫体系中体内研究基因功能的有效工具。然而，目前昆虫体系中 CRISPR/Cas9 基因编辑的详细操作流程仍不完善，限制了其在昆虫功能基因组学中的应用范围。

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在H. armigera中敲除功能基因的实验方案。提供了详细的操作步骤，包括针对gRNA合成的基因特异性引物的设计与制备、胚胎收集、显微注射、昆虫饲养以及突变体鉴定。该方案可作为操控H. armigera中任意功能基因的宝贵参考，并可推广至其他鳞翅目物种。

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方案

1. 基因特异性引物的设计与sgRNA的制备

  1. 通过PCR扩增和测序分析验证目标基因中的保守基因组区域。从棉铃虫（H. armigera）的基因组DNA中扩增目标基因，并区分外显子与内含子。
    注意：引导序列位点的序列特异性对于避免脱靶基因编辑至关重要。应在靠近基因5'非翻译区（5' UTR）的外显子中搜索可能的引导位点。随后需确保该基因完全丧失功能。sgRNA制备流程的概要如图1所示。
  2. 选择sgRNA靶点。使用CRISPR在线工具CRISPOR（版本4.97）(http://crispor.tefor.net/crispor.py) ，在基因的5' UTR附近外显子区域搜索可能的引导位点。将外显子序列输入文本框，并将目标基因组选择为棉铃虫（Helicoverpa armigera，Harm_1.0）。选择PAM（原间隔序列邻近基序）为"20 bp-NGG"，其余参数按照网站用户手册设置为默认值。
  3. 比较软件预测的引导序列，选择预测效率最高且错配最少的引导序列，以提高编辑效率并减少脱靶编辑。推荐选用在5' UTR端包含一个或两个G的20 bp引导序列，因其可提高切割效率。
    注意：为获得较大片段的缺失，便于后续步骤中的突变体检测，建议选择跨越外显子区域的一对gRNA。确保两个选定引导序列之间的间距至少为100 bp。本方案中选用常用的SpCas9蛋白，其识别NGG基序。根据试剂盒说明书，若使用T7启动子，则引导序列前端无需G亦可接受，因为该启动子会在序列5' UTR端添加一个G。
  4. 设计正向与反向寡核苷酸。将序列顺序设为5'-20 bp引导序列-NGG-3'，并对引导序列取其反向互补链。根据gRNA合成试剂盒的使用说明，分别在正向和反向链的引导序列前端添加T7启动子序列。
    注意：寡核苷酸序列中不应包含PAM序列NGG。
  5. 使用gRNA合成试剂盒生成sgRNA。该过程包括三个步骤：DNA模板组装、体外转录以及sgRNA纯化（图2）。每一步均需严格按照试剂盒说明书操作。

2. 胚胎制备与收集

  1. 按照 Hongtao 等人34所述方法分离雄性和雌性蛹，并将它们分别置于两个不同的网笼中。羽化后，在培养皿中用吸水棉提供约 30 mL 的 10% (w/v) 白砂糖溶液喂养成虫。
    注意：将 3 g 白砂糖溶解于 30 mL 无菌水中，配制 10% (w/v) 白砂糖溶液。
  2. 分别从 3 日龄雄虫和 2 日龄雌虫中选取 50 只健康个体，混合放入一个洁净的网笼中。在笼内放置一块浸有 10% (w/v) 糖溶液的棉絮，并保持棉絮湿润。用纱布覆盖网笼，并用橡皮筋固定纱布。向纱布喷水以维持湿润状态。
  3. 让步骤 2 中选出的雌雄成虫充分交配，并观察产卵量。
    注意：H. armigera 的产卵高峰期出现在晚上 9:00 之后。因此，应合理安排交配时间，以确保后续步骤中有足够数量的卵。在产卵高峰期，将纱布替换为黑色布片，让成虫自由产卵 30 分钟。每 30 分钟更换一次黑布以收集新鲜卵粒（图 3A）。
  4. 将黑布剪成大小约为 3 mm 的不规则小片，确保每片上附着较多卵粒。
    注意：避免选择皱缩的卵，因其通常未受精。
  5. 在载玻片（25 mm × 75 mm）上粘贴双面胶（图 3B）。使用镊子将带卵的小布片依次排列粘贴在双面胶表面。按压每片布的边缘，确保其牢固粘附。每张载玻片收集 50–100 粒卵（图 3C）。
    注意：布片需覆盖双面胶的整个表面，否则孵化后的幼虫可能难以爬出。
  6. 显微注射前，将载玻片置于冰上，以延缓胚胎发育。

3. 胚胎显微注射

  1. 使用显微拉针仪制备针头（图4A）。将Heat设为540，Pull设为80，Vel设为75，Time设为170，Pressure设为450。使用微型研磨器对针尖进行打磨。理想的针头应具有锋利的边缘（图4B）。
  2. 配制注射溶液。在PCR管中加入2 µL市售Cas9蛋白（1 mg/mL）和sgRNA（终浓度为300–500 ng/µL），用无RNase水补足至总体积10 µL。sgRNA的加入体积根据其浓度确定。用移液器充分混匀后置于冰上。
    注意：本步骤中使用的所有移液器吸头和PCR管均需为无RNase产品。
  3. 设置电子显微注射仪参数。将注射压力（pi）设为1,500 hPa，注射时间（ti）设为0.1 s，补偿压力（pc）设为30 hPa。
  4. 使用微量加样吸头将2 µL混合液装入针头中。应尽可能排出针尖内的残留空气。
  5. 将注射针头连接至显微操作器，并确保两部分之间连接紧密。
  6. 将载玻片放入培养皿（100 mm）中，并将其置于显微镜载物台上（图5A）。
  7. 在光学显微镜下调整针尖位置，直至显微镜下可同时清晰观察到针尖和胚胎（图5B）。
  8. 调节液滴体积。踩下脚踏开关，观察针尖处形成的液滴。调节显微注射仪的注射压力，使单个液滴体积约为胚胎体积的十分之一。
    注意：注射针头的质量对胚胎存活率至关重要。
  9. 以45度角小心将针尖插入胚胎的上半球区域（图5C）。踩下脚踏开关，将混合液注入胚胎内。注射会导致胚胎轻微膨胀。立即从胚胎中撤出针头，并用一只手移动培养皿，使下一个胚胎靠近针尖，重复相同操作进行后续注射。
    注意：针孔处出现少量胞质外流属正常现象。若胞质泄漏过多，可调整针头角度至更陡的角度，直至控制住液体外流。
  10. 至少注射300个胚胎，以确保获得足够的孵化数量。注射完成后盖上培养皿盖子。
    ​注意：从产卵到完成50–100个胚胎的注射时间应控制在2小时内。在此时间段内，大多数胚胎仍处于单细胞阶段。通常建议在注射过程中重复进行产卵操作，以提高实验效率。

4. 注射后昆虫的饲养

  1. G0 胚胎的培育。
    1. 将胚胎置于人工气候箱中，在相对湿度 60%、温度 28°C、14 小时光照/10 小时黑暗的条件下培养。
    2. 注射后每日观察胚胎发育情况。当胚胎表面颜色变深时，在培养皿中显微镜载玻片周围加入人工饲料，并每 12 小时检查一次胚胎发育情况。
      ​注意：人工饲料的制备方法如 Wu 等35 和 Jha 等36 所述。
    3. 准备 24 孔培养板，向每孔中加入相当于其体积三分之一的人工饲料。
    4. 用小号画笔挑出孵化的幼虫（图 5D），转移至 24 孔培养板中，每孔放入一只幼虫，以确保每只幼虫有足够的食物维持生存。
      ​注意：H. armigera 幼虫通常具有相互捕食的习性，因此需在每孔中单独饲养。
  2. G0 幼虫的饲养
    1. 将幼虫置于与胚胎相同的条件下饲养。
    2. 每日检查孵化出的幼虫。当幼虫生长至三龄阶段时，将每只幼虫转移至新的玻璃指形管中，并加入相当于管体积五分之一的人工饲料。
    3. 孵化后约 12 天，成熟幼虫应开始化蛹。
    4. 根据性别区分 G0 成熟蛹，并在羽化前分别放入不同笼中。同时准备同龄的野生型蛹。
  3. G0 成虫的饲养
    1. 每日检查野生型和突变型蛹的羽化情况。
    2. 将新羽化的 G0 雄性成虫与野生型雌性成虫转移至新的网笼中，使 G0 与野生型个体的比例约为 1:1，并提供浸有 10% (w/v) 蔗糖溶液的棉球作为食物。
    3. 按照上述常规方法继续饲养昆虫，直至第一代（G1）化蛹。
    4. 使用指形管将新羽化的一对 G1 成虫转移至塑料罐（13 cm × 12 cm × 12 cm）中，并提供 10% (w/v) 蔗糖溶液，罐口用纱布覆盖。共取约 50 对 G1 成虫。
      ​注意：雌蛾羽化时间早于雄蛾。通常，3 日龄雄蛾与 2 日龄雌蛾已达到性成熟并具备交配能力。新羽化的成虫若未进食，则在其首个光照周期内不会交配。
    5. 在 G1 成虫产卵后，将其收集至塑料罐中，并将每只成虫蛾放入 1.5 mL 离心管中。

5. 基因敲除突变体检测

  1. 设计一对跨越预测截短位点的引物。引物应设置在目标位点上下游两侧，距离至少50 bp。
    注意：用于鉴定目标序列的引物通常覆盖较长片段，以实现高效扩增。
  2. 使用第1部分提取的基因组DNA和基因分型引物进行PCR反应。PCR扩增条件为：95 °C 预变性20 s；进行35个循环（95 °C 变性20 s，55 °C 退火20 s，72 °C 延伸1 min）；72 °C 最终延伸5 min，然后4 °C 保存。通过1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。根据PCR产物的质量确认所选检测引物的有效性。若条带清晰且特异，可根据扩增片段大小进一步用于突变体检测。
  3. 筛选潜在的编辑个体。使用镊子小心取下后肢，并将每条后肢分别放入裂解基质管中。裂解基质管的编号需与玻璃指管上的编号一致。
  4. 使用组织匀浆器匀浆后肢组织。设置匀浆速度为6.0 m/s，时间为60 s。按照试剂盒说明书，使用商用基因组DNA提取试剂盒提取匀浆样品中的基因组DNA。
  5. 使用基因分型引物及与步骤2相同的PCR反应条件扩增目标基因片段。通过基因测序服务确认基因型。一旦在同一容器中检测到G1代突变基因型（靶向相同位点），保留该G1后代，并将其重新命名为第二代（G2）。
  6. 将相同基因型的G1个体放入同一个网笼中。对G1后代进行自交，并继续使用相同方法进行筛选。
  7. 扩增目标基因片段，并按照步骤2所述相同流程确认基因型。获得G2代纯合品系，并维持基因敲除突变体品系。

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结果

本方案提供了利用CRISPR/Cas9技术获得棉铃虫（H. armigera）基因敲除品系的详细步骤。方案中总结了gDNA筛选、胚胎收集与显微注射、昆虫饲养以及突变体检测等代表性实验结果。

本研究中，目的基因的靶位点位于其第二外显子（图2A）。该位点高度保守，通过琼脂糖凝胶电泳验证了合成的sgRNA的靶向条带片段（图2B、C、D）。

雄性和雌性成虫蛾最初分别饲养在不同的网箱中，以防止提前交配，并尽可能获得足量的胚胎。通常，共收集约300个受精卵，并在单细胞阶段立即注射sgRNA/Cas9蛋白混合物（sgRNA浓度为300-500 ng/µL，Cas9蛋白浓度为20...

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讨论

CRISPR/Cas9 系统的应用为基因功能分析及多个基因间的相互作用研究提供了强有力的技术支持。本文所展示的详细实验方案，演示了通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术在中国棉铃虫（H. armigera）中产生纯合突变体的方法。该可靠的操作流程为在中国棉铃虫（H. armigera）中进行靶向基因突变提供了简便有效的途径。

CRISPR 靶位点的选择可能影响诱变效率37。在本方案中，我们通过比较和分析在线网站 CRISPOR 的多个结果，以获得合适的靶位点。 在计算机模拟中，gRNA 预测具有一些优势。首先，在设计 sgRNA 时，它们可分析棉铃虫（H. armigera）的全基因组，以最小化脱靶效应。上述在线资源以及 CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/） 支持多种鳞翅目昆虫的基因组，这可能有助于其他鳞翅目蛾类的基因编辑。其次，候选 sgRNA 的排序可直接比较其可行性，但不同算法可能导致排序存在一定差异。在两个列表...

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披露

作者不存在任何利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（31725023、31861133019 资助 GW，31171912 资助 CY）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2kb DNA ladderTransGen BiotechBM101
毛细玻璃管World Precision Instruments504949称为 "毛细玻璃管" 在实验方案中
双面胶带明尼苏达矿业及制造公司665
Eppendorf FemtoJet 4i 微注射仪Eppendorf 公司E5252000021
Eppendorf InjectMan 4 显微操作仪Eppendorf 公司5192000051
Eppendorf Microloader 吸头Eppendorf 公司G2835241
GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒赛默飞世尔科技A29377
显微镜载玻片Sail Brand7105
奥林巴斯显微镜奥林巴斯株式会社SZX16
PrimeSTAR HS（预混液）Takara 生物医学技术R040用于突变检测
Sutter 微量移液器拉制仪Sutter Instrument CompanyP-1000
TIANamp 基因组DNA试剂盒天根生化科技公司DP304-03
TrueCut Cas9 蛋白 v2赛默飞世尔科技A36499

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CRISPR Cas9 基因编辑向导 RNA 设计基因组编辑突变检测基因功能分析琼脂糖凝胶电泳基因组 DNA 提取
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