Method Article

通过斑点印迹法进行 R 环分析

DOI:

10.3791/62069

⸱

January 22nd, 2021

 ,  ,  , 
1Life Sciences Institute, University of Michigan, Ann Arbor, 2Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 3Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 4Howard Hughes Medical Institute, 5Neurogenetics Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议详细介绍了一种量化 R 环的简单方法，R 环是一种由 RNA-DNA 杂交体和置换的 DNA 链组成的三链核酸结构。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

三链核酸结构 R-loop 因其在基因调控中的作用而日益得到认可。最初，R 环被认为是转录的副产品;但最近发现患病细胞中较少的 R 环清楚地表明 R 环在各种人类细胞中具有功能作用。接下来，了解 R 环的作用以及细胞如何平衡其丰度至关重要。该领域的一个挑战是 R 环的定量，因为大部分工作都依赖于 S9.6 单克隆抗体，其对 RNA-DNA 杂交体的特异性受到质疑。在这里，我们使用 S9.6 抗体的斑点印迹来定量 R 环，并展示该测定法的灵敏度和特异性，其中 RNase H、RNase T1 和 RNase III 分别裂解 RNA-DNA 杂交体、单链 RNA 和双链 RNA。该方法具有高度可重复性，使用通用实验室设备和试剂，并在两天内提供结果。该测定可用于研究和临床环境，以量化 R 环并评估 senataxin 等基因突变对 R 环丰度的影响。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案提供了斑点印迹测定的分步指南，允许对 R-loop（一种三链核酸结构）的丰度进行快速比较评估。当 RNA 侵入双链 DNA 以产生 RNA-DNA 杂交体并取代另一条 DNA 链时，就会形成 R 环。R 环存在于 RNA 生命周期的不同阶段。在转录复合物中，新生 RNA 合成与模板 DNA 互补，非模板链被取代。短 RNA-DNA 杂交体 （<10 bp） 被分离以释放新生 RNA，使其可以通过出口通道离开 RNA 聚合酶复合物 1,2。在转录复合物之外，新生的 RNA 靠近其 DNA 模板，该模板仍因被复制而略微解开，因此 RNA 可以与其模板 DNA 重新杂交，形成 R 环3。此外，当复制和转录复合体碰撞4 和反义转录5 时，会形成 R 环。鉴于 R 环的形成机会很多，它们并不罕见，可以在 3-5% 的人类基因组中找到6，具体取决于细胞的转录状态。R 环存在于 mRNA 的基因启动子7 和终止5 位点，以及核糖体 RNA8 和转移 RNA9 中。R 环也位于染色体的端粒区域。

R 环起着调节作用。它们通过影响启动子10,11 的转录、介导类别转换重组12 和促进基于 CRISPR 的基因组编辑来调节基因表达 13,14,15。与许多细胞事件一样，R 环丰度是紧密滴定的;R 环过多或过少都会影响正常的细胞功能16,17。R 环受多种蛋白质的调节，包括 RNase H、senataxin 和其他解旋酶，这些解旋酶可解开 RNA-DNA 杂交体 18,19,20,21,22。

为了监测 R 环的丰度，全基因组方法首先使用抗体 S9.6 8,23,24 或其他核酸酶25（包括 RNase H 10,26,27）富集 R 环，然后通过测序评估富集的 R 环的数量。这些基于测序的方法的早期版本没有实现足够的序列覆盖度，无法进行精确定量，但测序技术的快速改进现在允许逐个基因座 R 环分析。免疫荧光技术也已用于定量和定位 R 环10,17。这些方法很全面，但在许多临床环境中或不作为初步评估不实用，因为它们需要昂贵的设备和专门的分析。

需要一种可以在临床环境中跨实验室统一完成的程序。点印迹提供了这样的选择，因为它们可以在没有任何特定设备或计算分析的情况下进行。作为评估突变对 R 环影响的初步步骤或在临床环境中，这些点印迹必须提供敏感和特异性的结果。在这里，我们描述了专门识别 R 环的测定法;它排除了来自双链 （DS） DNA、双链 RNA 和单链 RNA 的信号。我们的方案使用 S9.6 抗体27 来识别 R 环中的 RNA-DNA 杂交体，并掺入 RNase H，这是一种裂解的核糖核酸内切酶，因此导致 RNA-DNA 杂交体20,28 中的降解，以确保检测到的信号是杂交体的信号。我们还掺入了在鸟嘌呤29,30 处切割单链 RNA 的 RNase T1 和切割双链 RNA（包括茎环31,32）以检查非特异性信号的 RNase III。S9.6 抗体可识别不同长度的 RNA-DNA 杂交体，甚至包括那些只有 8 个核苷酸长的杂交体33。

在这里，我们提出了从核酸分离开始的方案，然后是斑点印迹制备，并使用 S9.6 抗体进行 R 环检测。我们的协议包括确保加载相同数量的样品并且信号具有特异性的步骤。它提供寡核苷酸作为阳性和阴性对照。这是一种快速、简单且用户友好的 R 环丰度方法。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 用于核分级分离的细胞裂解

  1. 用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞两次。使用标准细胞解离技术（如胰蛋白酶）从组织培养皿中去除细胞。使用血细胞计数器计数细胞。
    注:下面描述的步骤用于分析原代人皮肤成纤维细胞，尽管可以分析一系列细胞类型。成纤维细胞在含有 10% 胎牛血清的基础培养基中生长。或者，洗涤后可以将细胞裂解缓冲液（表 1）直接添加到细胞培养物中。
  2. 将细胞悬液转移至 1.5 mL 试管中以沉淀细胞。
  3. 将样品在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 吸出介质。
  4. 使用步骤 1.3 中的离心设置，用冰冷的 1x PBS 洗涤两次。
  5. 向细胞沉淀中加入冷细胞裂解缓冲液（表 1）（每 2 x 106 个细胞 300 μL）。上下移液以重悬沉淀。
  6. 在冰上孵育 10 分钟。
  7. 以 500 x g 旋转 5 分钟以沉淀细胞核。
  8. 弃去上清液，将核沉淀重悬于 400 μL 冷核裂解缓冲液中（表 1）。
  9. 在冰上孵育 10 分钟。
    注:细胞核和细胞质区室的分级分离可确保信号特异性。在继续之前，可以评估细胞核和细胞质分离的质量（表 2）。
  10. 加入 3 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K，并在 55 °C 下孵育 3-5 小时。
    注意:所示体积适用于 2 x 106 个单元，可根据需要放大或缩小。

2. 纯化基因组 DNA（包括 RNA-DNA 杂交体）

  1. 如果 DNA 是粘性的，则进行超声处理以降低粘度（例如，在高功率输出下超声处理，30 秒开/30 秒关，使用 4 °C 水浴 2 分钟）。
  2. 加入 400 μL 洗脱缓冲液（表 1）和 400 μL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH 8.0）。
  3. 涡旋 10 秒。
  4. 在 4 °C 下以 12,000 x g 旋转 5 分钟。
  5. 将水相（约 350 μL）转移到新试管中。
  6. 使用 1 体积的氯仿提取一次，涡旋 10 秒，然后在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟。 将水相转移到新试管（约 300 μL）中。
  7. 加入 35 μL 3 M 乙酸钠 （pH 5.2）、1 μL 糖原和 700 μL 冰冷的 100% 乙醇。
  8. 涡旋 10 秒，并在 4 °C 下以 12,000 x g 旋转 30 分钟。
  9. 用 1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀。
  10. 涡旋 10 秒，并在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
  11. 弃去上清液，让沉淀风干。
  12. 加入 12 μL 洗脱缓冲液并涡旋 10 秒以重悬。将样品在 37 °C 下搅拌孵育 30 分钟，或在 4 °C 下孵育过夜以重新悬浮沉淀。
  13. 使用标准分光光度法测量 DNA 浓度。
    注意:所示体积适用于 2 x 106 个单元，可根据需要放大或缩小。如果需要，DNA（含 RNA-DNA 杂交体）可储存在 -20 °C 下。

3. 将 DNA 样品（包括 RNA-DNA 杂交体）印迹到尼龙膜上

  1. 在洗脱缓冲液中制备所需浓度的核酸稀释液（即 50 ng/μL、25 ng/μL 或 12.5 ng/μL）。这些浓度范围（200、100、50、25、12.5 ng）的样品可确保在线性范围内存在信号。
    注:确保为技术和生物学重复准备足够的样品，对于各种 RNase 处理，请参见步骤 5。
  2. 准备带正电荷的尼龙膜，以便每个 2 μL 样品占据 0.5 cm2 的面积。
  3. 将 2 μL 每个样品点样到 2 个膜上:一个用于 S9.6 抗体，另一个用于 dsDNA 抗体。或者，可以使用允许加载更大体积样品的斑点印迹或狭缝印迹仪。
  4. 让样品浸透到膜中。等待至少 2 分钟，然后再用紫外线将膜交联。
  5. 将膜置于 UV 装置的中心，并使用 UV 交联剂使用"自动交联"设置 （1,200 μJ x 100） 交联膜。

4. 使用 S9.6 抗体进行 RNA-DNA 杂交检测

  1. 在室温下，在摇床上将膜在封闭溶液（5% 牛奶在 Tris 缓冲盐水和 0.05% 吐温-20 （TBST） 中孵育 1 小时。
    注意:应该有足够的封闭溶液覆盖膜。
  2. 将膜在一抗（在 TBST 中的 5% 牛奶中）于 4 °C 下摇动孵育过夜。将抗 dsDNA 抗体（1:10,000 稀释度）添加到一个膜上。向第二层膜上添加 1 μg/mL S9.6 抗体（1:1,000 稀释）。
    注:S9.6 抗体可在市场上购买，也可从美国国立卫生研究院 NIAID 的 S. Leppla 博士处获得。
  3. 去除一抗并用 TBST 洗涤 3 次。每次洗涤 5-10 分钟，在室温下摇动。
  4. 与 5% 牛奶中的 TBST 中辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗（抗小鼠，1:5,000 稀释）一起孵育，并在室温下振荡。
    注:抗 dsDNA 和抗 RNA-DNA 杂交体都是小鼠抗体。
  5. 取出二抗，用 TBST 洗涤 3 次，在室温下摇动 5-10 分钟。
  6. 使用增强化学发光 （ECL） 试剂进行显影，以获取用于成像的信号。
  7. 使用标准图像处理工具（如 ImageJ）量化信号强度。
    注意: 表 2 中详细介绍了故障排除。

5. 核糖核酸酶治疗以评估信号特异性

注:应对核酸样品进行 RNase 处理，以证明 S9.6 结合的特异性。用 RNase H 而不是 RNase T1 或 RNase III 处理应导致 S9.6 免疫染色减少。

  1. 通过在四个单独的试管中制备含有 RNA-DNA 杂交体的样品来消化它们。用 5 U RNase H、1000 U RNase T1、0.5 U RNase III 或模拟处理 4 个样品中的每一个。将样品在 37 °C 下以 20 μL 体积孵育 15 分钟。
  2. 如第 3 节所述，将每个样品 2 μL 加载到膜上。

6. 制备寡核苷酸对照以评估信号特异性

注:寡核苷酸对照可用于证明 S9.6 结合的特异性。S9.6 识别 RNA-DNA 杂交体，但不能识别 dsDNA 或 dsRNA 对照，正如以前报道的那样34。

  1. 将寡核苷酸（表 3）溶解在退火缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0;50 mM NaCl，1 mM EDTA）中至 100 μM。
  2. 准备 4 个反应管
    1. RNA-DNA 杂交体 #1:将 10 μL ssRNA 上链与 10 μL ssDNA 下链和 80 μL 退火缓冲液混合。
    2. RNA-DNA 杂交体 #2:将 10 μL ssDNA 上链与 10 μL ssRNA 下链和 80 μL 退火缓冲液混合。
    3. dsRNA:将 10 μL ssRNA 上链与 10 μL ssRNA 下链和 80 μL 退火缓冲液混合。
    4. dsDNA:将 10 μL ssDNA 上链与 10 μL ssDNA 下链和 80 μL 退火缓冲液混合。
  3. 将步骤 6.2 中的 4 种混合物在 95 °C 下加热 10 分钟。
  4. 让试管缓慢冷却至室温，以允许股线重新退火。退火标准品可储存在 -20 °C 以备后用。
    注意:应通过非变性凝胶电泳检查退火效率。双链体的迁移速度比未退火的寡核苷酸慢（表 2）。
  5. 如第 3 节所述，将每个样品的 2 μL 加载到 2 个膜上，一个用于 S9.6 抗体，一个用于 dsDNA 抗体。
  6. 执行第 4 节中描述的步骤。

7. 使用 ImageJ 对 S9.6 R 环信号强度进行定量和归一化。

  1. 以 TIFF 格式保存 S9.6、dsDNA 染色的图像，并使用 ImageJ 软件 （https://imagej.nih.gov/ij/） 对其进行分析。
  2. 选择图像反转选项（编辑 |反转）。反转后，每个点将在深色背景下显示为白色。
  3. 使用椭圆图像选择工具选择一个足够大的椭圆，以包围图像上的最大点。
  4. 使用 ROI 管理器添加所选区域进行量化。确保选中 "Show All" 和 "Labels" 选项，以便可以可视化感兴趣的区域。
  5. 使用步骤 7.3 中使用的相同椭圆选择区域，在每个要定量的点周围添加其他感兴趣的区域。使用 Command + Shift + E 快捷键将步骤 7.3 中的选定区域复制到每个后续点。
  6. 测量每个感兴趣区域的积分密度。
  7. 将每个样品的 S9.6 信号强度除以 dsDNA 的测量值，得到 S9.6/dsDNA 信号比。通过重复实验来验证结果（S9.6 和 dsDNA 信号采集至少一式三份）。平均值的标准误差可以根据 S9.6/dsDNA 信号比值计算。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

酶处理以评估 S9.6 （RNA-DNA） 抗体的特异性。
原代人皮肤成纤维细胞生长17 个。分离并定量 DNA 与 RNA-DNA 杂交体。将 2 μg 样品用 RNase T1、RNase H 或 RNase III 在 37 °C 下消化 15 分钟。 还分析了模拟样品，以便与 RNase 处理的样品进行比较。如第 3 节所述，将样品（200、100、50、25、12.5 或 6.25 ng）印迹到两种不同的膜上。膜交联、封闭，用 S9.6 抗体探测其中一个膜（图 1A）。

结果表明，S9.6 信号与加载样品的丰度相关。用 RNase H 而不是 RNase T1 或 RNase III 处理导致 S9.6 染色减少。

用 dsDNA 抗体探测第二个膜（图 1B）以进行标准化。图像 J 用于分析信号强度。选择 50 ng 样品进行定量，因为 S9.6 和 dsDNA 抗体的信号强度在动态范围内。将信号强度归一化为模拟样本中的信号强度。数据如图 2 所示。

使用合成核苷酸对照的 S9.6 抗体斑点印迹。
为了评估 S9.6 抗体的特异性，我们使用了对应于 dsRNA 、 dsDNA 和 RNA-DNA 的寡核苷酸，如第 6 节所述。制备一系列稀释的 RNA-DNA、dsRNA 和 dsDNA 核苷酸，并如第 3 节所述印迹到尼龙膜上。用 S9.6 抗体探测膜（图 3）。结果表明，S9.6 抗体以剂量依赖性方式与 RNA-DNA 杂交体特异性结合，并且与 dsRNA 和 dsDNA 的交叉反应性最小。

RNA-DNA杂交点印迹测定与RNase酶，分析核酸存在。
图 1:S9.6 的特异性，如载有来自人成纤维细胞的核酸的斑点印迹所示。 对人成纤维细胞的核酸样品进行模拟处理或用 RNase T1、RNase H 或 RNase III 处理，然后以 200、100、50、25、12.5 和 6.25 ng/2 μL 点的稀释系列加载到尼龙膜上。然后用 S9.6 抗体 （A） 或 dsDNA 抗体 （B） 探测膜。 请单击此处查看此图的较大版本。

条形图显示了RNase酶对归一化S9.6/dsDNA信号的影响;模拟与 RNase III 的比较。
图 2:S9.6 R 环染色的定量。 从 图 1 中选择 50 ng 样品，用 ImageJ 进行定量。将 S9.6 信号除以 dsDNA 信号强度，然后按照第 7 节中概述的步骤归一化为模拟样品。 请单击此处查看此图的较大版本。

电泳结果显示不同浓度（10 至 0.1 μM）的 RNA/DNA 杂交检测。
图 3:使用寡核苷酸对照的 S9.6 斑点印迹。 针对一系列稀释的合成寡核苷酸（dsRNA、dsDNA 或 RNA-DNA 杂交体）的 S9.6 抗体斑点印迹。S9.6 以剂量依赖性方式与 RNA-DNA 杂交体特异性结合。请单击此处查看此图的较大版本。

细胞裂解缓冲液10 毫升200 毫升最终浓度
水，无核酸酶9 毫升180 毫升-
10% NP-400.5 毫升10 毫升0.5%
2M 氯化钾0.4 毫升8 毫升80 毫米
0.5M 管道 （pH 8.0）100 微升2 毫升5 毫米
细胞核裂解缓冲液10 毫升200 毫升最终浓度
水，无核酸酶8.65 毫升173 毫升-
10% 安全数据表1 毫升20 毫升1%
1M Tris-HCl （pH 值 8.0）0.25 毫升5 毫升25 毫米
0.5M 乙二胺四乙酸100 微升2 毫升5 毫米
洗脱缓冲液10 毫升200 毫升最终浓度
1M Tris-Cl，pH 值 8.50.1 毫升2 毫升10 毫米
水，无核酸酶9.9 毫升198 毫升-

表 1.缓冲液的制备

步问题可能的原因溶液
1.9不适用验证细胞组分可以通过向细胞和细胞核裂解缓冲液中添加标准蛋白酶抑制剂混合物来评估细胞核和细胞质分离的质量（表 1）。 细胞质和细胞核组分可以通过蛋白质印迹分析进行评估，以确认在细胞质组分中使用细胞质标志物（例如，GAPDH 或 HSP90）标记和在细胞核组分中使用核标志物（例如，HDAC1 或组蛋白 H3）标记的充分限制。线粒体污染对细胞核组分的贡献可以通过使用线粒体 DNA 特异性探针的 qPCR 分析来评估。
2.1样品太粘稠细胞数量太高。将 DNA 减半并继续超声处理步骤 2.1
2.12无可见颗粒起始材料不足或提取过程中的损失。从头开始使用更多单元格。
2.13DNA 浓度低
3.1DNA 不足，无法稀释
3.4样品不会浸透到膜中将膜浸泡在 1x TBST 中。让多余的缓冲液干燥并从步骤 3.4 开始
4.6检测到斑驳或斑点状图案向样品中加入 0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS），并继续执行步骤 3.1
4.6这些点具有"咖啡环"外观向样品中加入 0.01% Sarkosyl 并继续步骤 3.1
5.2RNaseH 对照显示信号无减弱核糖核酸酶消化不完全。增加孵育或增加酶浓度。
6.5寡核苷酸对照无信号Duplex 没有形成。寡核苷酸没有正确退火。验证寡核苷酸和退火缓冲液的比例。
6.5S9.6 信号并非特定于混合动力车S9.6 抗体批次具有非特异性结合使用 RNase 酶处理或合成寡核苷酸分析验证新批次 S9.6 抗体的灵敏度和特异性。

表 2:故障排除

ssRNA，上链5'-UGGGGGCUCGUCCGGGAUAUGGGAACCACUGAUCCC-3'
ssDNA，上链5'-TGGGGGCTCGTCCGGGATATGGGAACCACTGATCCC-3'
ssRNA，下链5'-GGGAUCAGUGGUUCCCAUCCCGGACGAGCCCCCA-3'
ssDNA，下链5'-GGGATCAGTGGTTCCCATATCCCGGACGAGCCCCCA-3'

表 3.控制寡核苷酸序列

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3 链核酸 R 环在 RNA 生命周期的不同阶段形成，并且越来越多地被发现可以调节细胞过程。为了充分理解 R 环，需要可靠的 R 环检测技术。在这里，我们描述了一种使用 S9.6抗体 8,23,24 询问 R 环丰度的方法。该方法允许快速评估细胞和组织培养样品的 R 环丰度。它不需要特殊设备，也不需要大量的起始材料。它使用 RNase 处理的组合确保特异性和可重现的结果。

一些人报告了对 S9.6 抗体特异性的担忧。与任何试剂一样，S9.6 抗体可能存在批次间差异。我们的方案包括 RNase H、RNase T1 和 RNase III，用于检查信号特异性。此外，我们使用合成寡核苷酸来确保每批 S9.6 抗体的特异性。

R 环生物学是一个不断发展的领域;可靠的检测和定量方法（如本文介绍的方法）的开发将有助于机理研究，以阐明 R 环何时形成、它们如何被调节以及它们调节什么。通过适当的对照，这种斑点印迹检测是在临床和研究环境中筛选 R 环丰度的一种简单方法。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可披露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了霍华德休斯医学研究所和美国国家神经疾病和中风研究所校内研究的支持。

我们感谢 Stephen Leppla 博士提供 S9.6 抗体批次用于分析。我们还感谢 Dongjun Li 博士在核糖核酸酶治疗方面的帮助。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗 dsDNA 抗体Abcamab27156
抗 RNA-DNA 杂交抗体 （S9.6）KerafastENH001
Biorupter 超声仪DiagenodeUCD-200
EB 缓冲液Qiagen19086
EDTA （0.5M）InvitrogenAM9261
Hybond N+ 尼龙膜GE 医疗保健 生活科学RPN203B
KCl （2M）InvitrogenAM9640G
NP-40 （Igepal CA-630）SigmaI8896
PBSInvitrogen10010-023
苯酚：氯仿：异戊醇Invitrogen15593031
PIPES （0.5M， pH 8.0）VWRAAJ61406-AE
蛋白酶 KQiagen19131
RNase IIIInvitrogenAM2290
RNase HNew England BiolabsM0297
RNase T1ThermoFisher Sci.EN0541
SDS （10%）Invitrogen15553027
乙酸钠 （3M， pH 5.2）InvitrogenAM9740
Tris-缓冲盐水 （10X）康宁46-012-CM
Tris-HCl （1M， pH 8.0）KD 医用RGF-3360
TrypLEInvitrogen12605010
Tween-20SigmaP9416
UV Stratalinker 2400StratageneStratalinker 2400
Whatman 记号笔SigmaWHA10499001

References

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