通过胆管TNBS灌注建立小鼠慢性胰腺炎模型

摘要

慢性胰腺炎（CP）是一种以胰腺炎症和纤维化为特征的疾病，常伴有难以缓解的腹痛。本文重点优化通过胆管输注2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）建立小鼠CP模型的技术。

摘要

慢性胰腺炎（CP）是一种复杂的疾病，涉及胰腺炎症和纤维化、腺体萎缩、腹痛及其他症状。已有多种啮齿类动物模型被用于研究CP，其中胆管内输注2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）的模型可模拟CP中出现的神经病理性疼痛特征。然而，在小鼠中进行胆管给药在技术上具有挑战性。本方案展示了通过胆管输注TNBS建立CP小鼠模型的操作步骤。TNBS通过十二指肠乳头（Vater壶腹）注入胰腺。本方案对药物体积、手术技术以及操作过程中的药物处理进行了优化。经TNBS处理的小鼠表现出CP的典型特征，包括体重和胰腺重量下降、与疼痛相关的行为改变以及胰腺形态异常。通过这些改进，TNBS注射相关的死亡率极低。该操作不仅对于构建胰腺疾病模型至关重要，也适用于胰腺局部药物递送。

引言

慢性胰腺炎（CP）是一种慢性炎症性疾病，其特征为胰腺萎缩、纤维化、腹痛以及外分泌和内分泌功能的最终丧失¹。目前的药物和外科治疗手段均无法根治该病，仅用于缓解由疾病引起的症状，如难治性腹痛、内分泌和外分泌功能障碍。因此，迫切需要更有效的治疗方法²。动物模型是深入理解该疾病机制并探索潜在治疗策略的重要工具³。目前已建立多种小鼠CP模型，其中胆囊收缩素（cerulein）模型和/或酒精模型应用较为广泛。胆囊收缩素是一种可刺激胰腺分泌的寡肽，已被证实能够稳定诱导出具有胰腺萎缩、纤维化等特征的CP模型⁴。另一种常用模型是连续注射L-精氨酸，可导致类似于人类患者所见的外分泌功能不全⁵。此外，通过完全或部分结扎胰管以及诱发胰管高压也可诱导CP的发生^6,7。尽管已有多种可用于研究CP的动物模型，但目前尚无一种模型能有效模拟CP患者所经历的腹痛症状⁸。

既往研究表明，局部胰腺注射2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）可复制慢性胰腺炎（CP）患者所经历的持续性疼痛^9,10,11。经TNBS处理的小鼠表现出腹部痛觉过敏、疼痛相关行为增加，以及对疼痛刺激的"广泛性高敏感性"，这一现象在CP患者中亦有观察到¹⁰。除了能准确模拟CP相关的疼痛外，TNBS模型还能复制人类疾病中的其他病理特征，如纤维化、单核细胞浸润以及腺泡细胞被脂肪组织替代^10,12。然而，通过胆管输注TNBS在小鼠中是一项技术上具有挑战性的操作，可能引起动物死亡。据我们所知，目前尚无可视化操作流程展示胆管输注的具体实施方法。本文中，我们演示了通过胆管输注TNBS以建立CP小鼠模型的操作步骤。该技术将有助于生成用于研究CP及其他胰腺疾病的重要动物模型，并可用于向胰腺输注其他物质（如病毒、细胞）¹³。

方案

所有实验程序均经南卡罗来纳医科大学和拉尔夫·H·约翰逊医疗中心的机构动物护理与使用委员会批准。本研究使用8至10周龄的C57BL/6J雄性小鼠。小鼠饲养于标准的12小时光照/12小时黑暗循环环境中，可自由获取食物和水。

1. 注射用TNBS溶液的制备

1. 配制含10%乙醇的0.9%生理盐水。将TNBS储备液（见材料表）溶于10%乙醇中，终浓度为7.5 mM，方法是将7.5 µL TNBS加入1 mL 10%乙醇中。
   注意：TNBS具有化学危害性。应在通风橱内配制该溶液，并使用个人防护装备（如手套、护目镜和实验服），避免直接接触TNBS。
2. 用31号针头的胰岛素注射器吸取50 µL 0.75% TNBS溶液。另取相同规格的注射器，吸取50 µL含10%乙醇的生理盐水作为溶剂对照。将注射器置于冰上，并避光保存，直至使用。

2. 小鼠准备与手术

1. 剃除腹部手术区域的毛发。
2. 术前注射一次镇痛剂（例如，腹腔注射布托啡诺 0.1 mg/kg）。
3. 使用 1.5–2% 异氟烷和 1 L/min 氧气诱导并维持小鼠全身麻醉。通过轻捏脚趾并观察动物是否无反射反应来确认麻醉效果。
4. 手术期间将小鼠置于加热的手术垫上。当小鼠处于麻醉状态时，在每只眼睛上涂抹兽用眼膏。
5. 用 2% 碘伏擦拭手术区域 3 次，再用 70% 酒精脱碘，对手术部位进行消毒（材料表）。
6. 使用显微剪刀行剖腹手术，制作 0.5–1 cm 的切口。
7. 轻柔地暴露十二指肠，并使用棉签定位胆总管（材料表）。
8. 在近端胆总管上方放置一个直型显微止血夹（材料表），以防止 TNBS 或溶剂溶液流入肝脏和胆囊（图 1A、B）。
9. 轻柔地暴露十二指肠，并通过乏特氏壶腹将针头插入胰管。
10. 当针头进入导管后，在针头周围的十二指肠部位放置一个弯型显微止血夹（材料表）（图 1A），以固定针头位置，并防止注射液进入十二指肠。
11. 在 1 分钟内缓慢将溶液（TNBS 或溶剂）注入胰管。
    注意：TNBS 需在 1 分钟内缓慢注入，使用带有 5/16 英寸、31G 针头的胰岛素注射器灌注胰腺时，较易控制注射速度。操作时尽量保持手部稳定，避免刺破胆管。若 TNBS 注射成功，可在胰腺内观察到黄色着色。
12. 注射完成后，先小心移除靠近肝脏侧的微型夹子，再移除固定针头和十二指肠的微型夹子。
13. 小心地将十二指肠复位至原始解剖位置。
14. 在关闭腹腔前，向腹腔内留置 0.5 mL 温热的无菌生理盐水（36–37 °C），以帮助十二指肠复位并促进蠕动功能恢复。
15. 使用 5-0 缝线连续缝合肌肉层，再使用 4-0 缝线间断缝合皮肤。
16. 将装有小鼠的笼子放置在加热垫上，以便其从麻醉中恢复。
17. 确认小鼠体温正常且能够自主活动后，再将其送回饲养室。
18. 术后 48 小时内每 12 小时给予一次镇痛剂（例如，腹腔注射布托啡诺 0.1 mg/kg），并持续提供辅助加热。

3. 监测小鼠行为

1. 术后第7天拆除缝线。
2. 术后第一周内每天监测小鼠的健康状况和行为，观察是否存在痛苦迹象，如发声、弓背姿势或活动减少。每隔一天测量一次体重。
3. 使用Von Frey单丝纤维（VFFs）在术前以及术后2周和3周检测腹部机械性痛觉过敏，方法如下^9,14。
   1. 按照施加力由小到大的顺序，将不同强度的VFFs以1–2秒间隔在上腹部区域各刺激10次。若出现腹部抬起、回缩或舔舐（缩腹反应），则视为阳性反应。
   2. 若未观察到阳性反应，则改用更强的刺激；若观察到阳性反应，则改用更弱的刺激。缩腹阈值定义为小鼠在50%的刺激次数中产生反应时所对应的力值。

4. 胰腺组织的采集与组织学分析

1. 在麻醉条件下通过颈椎脱位处死小鼠，并小心地从肠道及其他器官中分离胰腺。
2. 将胰腺置于10%多聚甲醛中固定24小时，经石蜡包埋后切成5 µm厚的组织切片，并置于载玻片上用于染色。
3. 采用已有文献报道的标准方法进行苏木精-伊红染色和马松三色染色⁴。

结果

为了降低与该操作相关的实验小鼠死亡率，对胆管灌注步骤进行了优化¹⁰。TNBS 首先以 35 μL 或 50 μL 的总体积给予。使用 50 μL 体积注射 TNBS 可以覆盖整个胰腺，并诱导出更为均一的疾病表型（图 1B）。此外，使用配备 31G 针头的胰岛素注射器注射 TNBS 相较于常规注射器和针头能够更精确地控制灌注速度。相较于配制超过一小时的 TNBS，新鲜配制并在冰上保存、一小时内使用的 TNBS 可获得更佳的实验效果。通过上述改进，受体小鼠的死亡率得以控制，始终低于 10%。

体重减轻是慢性胰腺炎（CP）的特征之一。对照组小鼠在术后前3天内体重减少了约6%，随后逐渐恢复（第21天时达到原始体重的104.6%）（图1C）。相比之下，接受TNBS处理的小鼠在前5天平均体重减轻约15%，之后体重逐渐回升（第21天时为原始体重的99.8%）（图1C）。此...

讨论

经胆管灌注TNBS诱导小鼠慢性胰腺炎在技术上具有挑战性，因为药物灌注后3-4天内最多可达22.5%的小鼠死亡¹⁰本研究在先前研究的基础上优化了实验步骤，显著降低了小鼠的早期死亡率 <10%。例如，增加药物体积（从35 μL增至50 μL）可确保药物到达 整个胰腺。使用胰岛素注射器和较小的针头（31G）可减少对胰管的潜在损伤，以及胆汁泄漏至胆囊或腹腔的风险，后者极有可能导致小鼠在术后最初几天内死亡。夹闭胆管两端可防止TNBS泄漏至胆囊和肠道，从而避免可能的死亡风险。血管夹可将TNBS限制在注射的胰腺内，提高造模效率的同时减少对其他组织的损伤。此外，TNBS在高于0 °C的温度下不稳定，因此使用新鲜配制的TNBS可使慢性胰腺炎（CP）的诱导获得稳定的结果。

该方案可有效诱导8至12周龄雄性C57BL/6J小鼠产生CP 并生成一种模拟慢性胰腺炎主要症状的模型，包括体重减轻、胰腺萎缩、纤维化以及可能的腹痛。与其他慢性胰腺炎小鼠模型相比，TNBS模型除用于评估炎症外，还被广泛用于评估镇痛效果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林（v/v）	Fisher Scientific	23426796
酒精消毒片，无菌	Fisher Scientific	22-363-750
动物麻醉系统	VetEquip, Inc.	901806
盐酸布托啡诺注射液	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
离心管，15 mL	Fisher Scientific	0553859A
无水乙醇（200 proof），分子生物学级	Fisher Scientific	BP2818500
超细显微解剖剪，4” 直头尖锐	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe 镊子，4” 超精细尖端	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
加热垫	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner 持针器，5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
胰岛素注射器，带 31 号针头	BD	324909
碘伏消毒片	Fisher Scientific	19-027048
异氟烷	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
微型夹施加镊，5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
微型夹，直型强弯，1×6 mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
微型夹，直型，夹宽 0.75 mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
苦味酸磺酸溶液（TNBS），H2O 中 1 M	Millipore Sigma	92822-1ML
聚丙烯缝线 4-0	Med-Vet International	MV-8683
聚丙烯缝线 5-0	Med-Vet International	MV-8661
氯化钠，0.9% 静脉注射液	VWR	2B1322Q
手术巾，无菌	Med-Vet International	DR1826
组织包埋盒	Fisher Scientific	22-272416
von Frey 纤维丝	Bioseb	EB2-VFF