慢性胰腺炎（CP）是一种以胰腺炎症和纤维化为特征的疾病，常伴有难以缓解的腹痛。本文重点优化通过胆管输注2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）建立小鼠CP模型的技术。
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摘要
摘要
慢性胰腺炎（CP）是一种复杂的疾病，涉及胰腺炎症和纤维化、腺体萎缩、腹痛及其他症状。已有多种啮齿类动物模型被用于研究CP，其中胆管内输注2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）的模型可模拟CP中出现的神经病理性疼痛特征。然而，在小鼠中进行胆管给药在技术上具有挑战性。本方案展示了通过胆管输注TNBS建立CP小鼠模型的操作步骤。TNBS通过十二指肠乳头（Vater壶腹）注入胰腺。本方案对药物体积、手术技术以及操作过程中的药物处理进行了优化。经TNBS处理的小鼠表现出CP的典型特征，包括体重和胰腺重量下降、与疼痛相关的行为改变以及胰腺形态异常。通过这些改进，TNBS注射相关的死亡率极低。该操作不仅对于构建胰腺疾病模型至关重要，也适用于胰腺局部药物递送。
引言
慢性胰腺炎（CP）是一种慢性炎症性疾病，其特征为胰腺萎缩、纤维化、腹痛以及外分泌和内分泌功能的最终丧失1。目前的药物和外科治疗手段均无法根治该病，仅用于缓解由疾病引起的症状，如难治性腹痛、内分泌和外分泌功能障碍。因此，迫切需要更有效的治疗方法2。动物模型是深入理解该疾病机制并探索潜在治疗策略的重要工具3。目前已建立多种小鼠CP模型，其中胆囊收缩素（cerulein）模型和/或酒精模型应用较为广泛。胆囊收缩素是一种可刺激胰腺分泌的寡肽，已被证实能够稳定诱导出具有胰腺萎缩、纤维化等特征的CP模型4。另一种常用模型是连续注射L-精氨酸，可导致类似于人类患者所见的外分泌功能不全5。此外，通过完全或部分结扎胰管以及诱发胰管高压也可诱导CP的发生6,7。尽管已有多种可用于研究CP的动物模型，但目前尚无一种模型能有效模拟CP患者所经历的腹痛症状8。
既往研究表明，局部胰腺注射2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）可复制慢性胰腺炎（CP）患者所经历的持续性疼痛....
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方案
所有实验程序均经南卡罗来纳医科大学和拉尔夫·H·约翰逊医疗中心的机构动物护理与使用委员会批准。本研究使用8至10周龄的C57BL/6J雄性小鼠。小鼠饲养于标准的12小时光照/12小时黑暗循环环境中，可自由获取食物和水。
1. 注射用TNBS溶液的制备
- 配制含10%乙醇的0.9%生理盐水。将TNBS储备液（见材料表）溶于10%乙醇中，终浓度为7.5 mM，方法是将7.5 µL TNBS加入1 mL 10%乙醇中。
注意：TNBS具有化学危害性。应在通风橱内配制该溶液，并使用个人防护装备（如手套、护目镜和实验服），避免直接接触TNBS。 - 用31号针头的胰岛素注射器吸取50 µL 0.75% TNBS溶液。另取相同规格的注射器，吸取50 µL含10%乙醇的生理盐水作为溶剂对照。将注射器置于冰上，并避光保存，直至使用。
2. 小鼠准备与手术
- 剃除腹部手术区域的毛发。
- 术前注射一次镇痛剂（例如，腹腔注射布托啡诺 0.1 mg/kg）。
- 使用 1.5–2% 异氟烷和 1 L/min 氧气诱导并维持小鼠全身麻醉。通过轻捏脚趾并观察动物是否无反射反应来确认麻醉效果。
- 手术期间将小鼠置于加热的手术垫上。当小鼠处于麻醉状态时，在每只眼睛上涂抹兽用眼膏。<....
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结果
为了降低与该操作相关的实验小鼠死亡率，对胆管灌注步骤进行了优化10。TNBS 首先以 35 μL 或 50 μL 的总体积给予。使用 50 μL 体积注射 TNBS 可以覆盖整个胰腺，并诱导出更为均一的疾病表型（图 1B）。此外，使用配备 31G 针头的胰岛素注射器注射 TNBS 相较于常规注射器和针头能够更精确地控制灌注速度。相较于配制超过一小时的 TNBS，新鲜配制并在冰上保存、一小时内使用的 TNBS 可获得更佳的实验效果。通过上述改进，受体小鼠的死亡率得以控制，始终低于 10%。
体重减轻是慢性胰腺炎（CP）的特征之一。对照组小鼠在术后前3天内体重减少了约6%，随后逐渐恢复（第21天时达到原始体重的104.6%）（图1C）。相比之下，接受TNBS处理的小鼠在前5天平均体重减轻约15%，之后体重逐渐回升（第21天时为原始体重的99.8%）（图1C）。此.......
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讨论
经胆管灌注TNBS诱导小鼠慢性胰腺炎在技术上具有挑战性，因为药物灌注后3-4天内最多可达22.5%的小鼠死亡10本研究在先前研究的基础上优化了实验步骤，显著降低了小鼠的早期死亡率 <10%。例如，增加药物体积（从35 μL增至50 μL）可确保药物到达 整个胰腺。使用胰岛素注射器和较小的针头（31G）可减少对胰管的潜在损伤，以及胆汁泄漏至胆囊或腹腔的风险，后者极有可能导致小鼠在术后最初几天内死亡。夹闭胆管两端可防止TNBS泄漏至胆囊和肠道，从而避免可能的死亡风险。血管夹可将TNBS限制在注射的胰腺内，提高造模效率的同时减少对其他组织的损伤。此外，TNBS在高于0 °C的温度下不稳定，因此使用新鲜配制的TNBS可使慢性胰腺炎（CP）的诱导获得稳定的结果。
该方案可有效诱导8至12周龄雄性C57BL/6J小鼠产生CP 并生成一种模拟慢性胰腺炎主要症状的模型，包括体重减轻、胰腺萎缩、纤维化以及可能的腹痛。与其他慢性胰腺炎小鼠模型相比，TNBS模型除用于评估炎症外，还被广泛用于评估镇痛效果
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披露
所有作者均声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由美国退伍军人事务部（VA-ORD BLR&D 优秀奖 I01BX004536）以及美国国立卫生研究院资助项目 # 1R01DK105183、DK120394 和 DK118529（资助予 HW）支持。我们感谢吴红菊博士分享技术经验。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 中性缓冲福尔马林（v/v） | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 酒精消毒片，无菌 | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| 动物麻醉系统 | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| 盐酸布托啡诺注射液 | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| 离心管，15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| 无水乙醇（200 proof），分子生物学级 | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| 超细显微解剖剪，4” 直头尖锐 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe 镊子，4” 超精细尖端 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| 加热垫 | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner 持针器，5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| 胰岛素注射器，带 31 号针头 | BD | 324909 | |
| 碘伏消毒片 | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| 异氟烷 | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| 微型夹施加镊，5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| 微型夹，直型强弯，1×6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| 微型夹，直型，夹宽 0.75 mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| 苦味酸磺酸溶液（TNBS），H2O 中 1 M | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| 聚丙烯缝线 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| 聚丙烯缝线 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| 氯化钠，0.9% 静脉注射液 | VWR | 2B1322Q | |
| 手术巾，无菌 | Med-Vet International | DR1826 | |
| 组织包埋盒 | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| von Frey 纤维丝 | Bioseb | EB2-VFF |
参考文献
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al.
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