激光捕获显微切割手术组织以鉴定2型糖尿病中伤口愈合障碍相关的异常基因表达

摘要

该技术提供了对临床相关的人体组织进行ex vivo损伤、激光显微切割以及定量分析糖尿病中与伤口愈合不良过程相关的基因表达变化的指导。

摘要

2型糖尿病（T2DM）的全球患病率正迅速上升。T2DM患者常伴有多种并发症，其中一种是伤口愈合受损，可能导致难愈性溃疡或足部溃疡，最终甚至需要截肢。在健康个体中，伤口愈合是一个受控且各阶段相互重叠的过程，包括炎症期、增殖期和重塑期。而在T2DM患者中，其中一个或多个阶段会出现功能障碍。目前用于研究T2DM中伤口愈合障碍的模型包括体外划痕伤口实验、皮肤等效物模型或动物模型，以探究伤口愈合的分子机制和/或潜在治疗方案。然而，这些模型尚无法完全模拟T2DM患者体内复杂的伤口愈合过程， 离体 人体皮肤试验存在伦理问题，因为已知患者在接受穿刺活检后伤口愈合不良。本文介绍了一种技术，可利用2型糖尿病（T2DM）患者截肢或选择性整形手术后废弃的多余组织，检测参与（功能失调性）伤口愈合反应的特定细胞的表达谱。本方案中，收集捐赠的皮肤样本，制造伤口后进行培养 离体 在气液界面培养条件下，于不同时间点固定并进行切片。利用激光显微切割技术分离参与伤口愈合的特定细胞类型（如表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞（乳头层和网状层）、血管系统），并通过测序或微阵列分析其基因表达差异，感兴趣基因进一步采用qPCR验证。该方案可用于分析糖尿病患者与非糖尿病患者手术后常规废弃的难愈合皮肤与完整皮肤之间固有的基因表达差异，有助于深入理解2型糖尿病慢性伤口形成及下肢截肢相关的分子机制。

引言

2型糖尿病的发病率在全球范围内不断上升，主要由肥胖流行和体力活动不足所驱动。这些患者常伴有伤口愈合不良，高达25%的患者会发展为慢性难愈性伤口¹。导致这一问题的机制复杂且尚未完全阐明，限制了新疗法的研发进展。其中一个重要因素是缺乏适用于研究2型糖尿病患者伤口愈合的合适模型。因此，本方法旨在提供一种生理相关性强的离体（ex vivo）模型，用于研究具有慢性伤口风险个体的伤口愈合过程，并支持通过转录组学分析推动新治疗靶点的发现。

目前有多种可用于研究伤口愈合的模型，每种模型都有其优势与局限性。体内动物模型，如 db/db 小鼠² 或链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠³，被广泛使用；然而，啮齿类动物模型的伤口通过收缩愈合，这与人体内的愈合机制存在显著差异，因而其在临床试验中的转化应用效果有限^4,5。使用人体组织的优势已被广泛认可⁴，但由于在已知存在伤口愈合障碍的个体身上人为制造实验性伤口涉及伦理问题，使得此类研究较为复杂。因此，针对糖尿病患者的研究更多集中于炎症反应，而非对切除组织进行实验⁶。器官芯片⁷和人工皮肤模型⁸也已可用，这些模型的优势在于能够分析人类细胞的贡献，但难以反映患者间的个体差异。因此，建立具有临床相关性的模型，以研究脆弱人群伤口愈合的进展，有望加速该领域内机制的理解与药物发现。

ex vivo 伤口模型实验方案改编自 Stojadinovic 和 Tomic-Canic（2013）⁹。该方法适用于研究在 ex vivo 条件下对人类组织样本进行可控损伤后获得的转录组数据，也可应用于伤口愈合不良患者（如 2 型糖尿病患者、老年人）的临床样本，以增进对这些病理状态下伤口愈合机制受损情况的理解，并探索潜在的修复策略。

方案

本方案依赖于提供的人类外科手术组织。实验前已获得伦理批准和患者的知情同意，且本研究符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则。

1. 组织的采集与 离体 损伤

1. 将截肢或手术中获取的外科组织收集至含有含5%青霉素-链霉素-两性霉素B、2 mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FBS；完全培养基）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的无菌容器中。
   注意：以这种方式采集的组织可在 4 °C 下保存最多 24 小时，然后进行实验。为确保组织在后续实验中的活性 离体 实验时，建议尽快处理组织，或在采集与损伤之间保持固定的时间间隔，以标准化多次组织捐献间的实验条件。若组织需要储存一段时间，应向样本中添加RNA稳定溶液，以维持RNA的完整性。
2. 使用无菌镊子将组织转移至一个盛有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中，PBS中添加5%青霉素-链霉素-两性霉素B。用无菌手术刀和/或手术剪去除真皮层上的脂肪组织，并弃去。将组织转移至另一个盛有无菌PBS的新鲜培养皿中。
3. 将两片无菌刀片固定在一起，使两刀片之间保持1 mm的间隙。在表皮及乳头层真皮上部沿长轴方向划出两条平行的直线切口，间距约1 mm。^10,11.
4. 使用无菌镊子和手术剪在划痕线之间去除表皮，以形成线性伤口。
5. 使用手术刀将组织切成小矩形（最大尺寸为1 cm²) 包括伤口及其两侧完整的表皮。
   注意：为了保持组织及后续RNA的完整性，步骤1.2–1.5应尽快完成。
6. 使用体视显微镜在4倍放大倍数下拍摄损伤组织的图像，确保视野包含伤口的全部区域及周围完整的表皮组织。
7. 使用无菌镊子将组织块放置于6孔板中的组织培养插件上，然后用移液器轻轻加入2 mL完全培养基至孔中。这将确保样本在液-气界面条件下进行培养。
8. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 在空气中最长可达 120 小时。
   ​注意：应在孵育结束时，使用与步骤1.6相同放大倍数的显微解剖镜对组织进行成像。如有必要，可每24小时拍摄一次图像。

2. 组织固定与冷冻切片

1. 将组织置于液氮中快速冷冻。取少量适用于冷冻切片机的包埋介质置于冷冻切片机持片器上，并将组织包埋其中。将组织方向调整为与持片器垂直，以确保切面能贯穿皮肤所有层次，包括损伤区域。于 -80 °C 保存。
   注意：此步骤可暂停。
2. 在室温下使用 70% 乙醇和 RNase 去污染喷雾清洁冷冻切片机。将冷冻切片机温度设定为 -28 °C。
3. 检查持片器与冷冻切片机刀片的方向是否能够产生包含组织全层（包括损伤组织及下方真皮层）的切片。
4. 使用冷冻切片机，从每个伤口处切取最多十片 7 µm 厚的切片，并置于无 RNA 酶的显微切割载玻片上。
5. 将载玻片存放于显微切割载玻片原有的盒中，并在 -80 °C 保存，以确保无 RNase 环境。
   ​注意：此步骤可暂停，但需注意储存时间越长，RNA 降解程度越高。

3. 激光捕获显微切割

1. 将载有组织切片的显微切割载玻片置于干冰中，并转移至激光显微切割显微镜室。
2. 风干 1^st 将切片并立即使用无RNase的苏木精-伊红染色试剂盒进行苏木精染色，随后迅速进行激光显微切割。
3. 使用激光显微切割显微镜在10倍放大倍数下观察受损组织，并拍摄将进行激光切割的目标区域图像。
4. 用显微镜配套软件的操作指南，对目标区域（例如上皮舌、肉芽组织、微血管）进行轮廓描记，并将其收集至显微切割用的0.5 mL扩散隔离帽中。
5. 使用激光显微切割显微镜在10倍放大倍数下重新观察并成像已捕获的目标区域，以展示所切割组织的位置及其完整切除情况。
   注意：每份样品的激光捕获操作（最多10个切片）应控制在1小时内完成，以最大限度减少RNA降解。
6. 根据制造商说明书，向含有显微切割组织的离心管中加入RNA储存缓冲液，并将样本置于干冰中保存，直至可转移至-80℃超低温冰箱^°C 冷冻柜
   ​注意：此处可暂时暂停本实验方案。

4. 差异基因表达的定量分析

1. 将样品管以最大速度离心1分钟。
2. 根据制造商说明书，从显微切割的组织中提取RNA。
3. 用12 µL无RNase的水洗脱RNA，并根据制造商说明书，使用RNA扩增试剂盒和热循环仪进行RNA扩增。建议进行两轮扩增，以确保获得足够量的RNA用于后续分析。扩增条件见表1。

第一轮扩增			第二轮扩增
第一链合成			第一链合成
步骤	温度	时间	步骤	温度	时间
1	65 °C	5 min	1	65 °C	5 min
2	4 °C	hold	2	4 °C	hold
3	42 °C	45 min	3	25 °C	10 min
4	4 °C	hold	4	37 °C	45 min
5	37 °C	20 min	5	4 °C	hold
6	95 °C	5 min
7	4 °C	hold	第二链合成
			步骤	温度	时间
第二链合成			1	95 °C	2 min
步骤	温度	时间	2	4 °C	hold
1	95 °C	2 min	3	37 °C	15
2	4 °C	hold	4	70 °C	5 min
3	25 °C	5 min	5	4 °C	hold
4	37 °C	10 min
5	70 °C	5 min	In vitro 转录
6	4 °C	hold	步骤	温度	时间
			1	42 °C	6 h
In vitro 转录			2	4 °C	hold
步骤	温度	时间	3	37 °C	15 min
1	42 °C	3 h	4	4 °C	hold
2	4 °C	hold
3	37 °C	15 min
4	4 °C	hold

表1：扩增条件。

4. 定量测定扩增RNA的浓度和纯度。A260/230（纯度）和A260/280（污染物）的吸光度比值> 1.8时，适用于后续分析。
   注意：纯化的扩增RNA可用于靶向基因表达研究（步骤4.5–4.6），也可送样进行微阵列分析。
5. 根据制造商说明书，使用高容量cDNA反转录试剂盒合成cDNA。代表性反应条件如下：
   • 25 °C 反应10 min
   • 37 °C 反应2 h
   • 85 °C 反应5 min
   • 4 °C 保存
6. 按照制造商说明书，使用0.5 µL cDNA和1 µM引物（目的基因）进行定量PCR。代表性反应条件和引物序列如下：
   1. 定量PCR反应条件如下：95 °C 预变性10分钟；95 °C 变性15秒、62 °C 退火延伸1分钟，共40个循环；95 °C 5分钟；4 °C 保存。
   2. 使用以下引物序列：
      GAPDH
      正向引物    5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      反向引物    5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      正向引物    5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      反向引物    5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. 数据解读

1. 使用伤口愈合的图像计算愈合速率 离体 使用ImageJ分析步骤1.6–1.8中生成的组织。近年来有多篇文献报道了在ImageJ中自动分析创面面积的不同方法变体。^12,13,14.
2. 使用 ΔC 法量化基因表达_T 方法，通过比较目的基因与看家基因（例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GAPDH）的循环阈值（Ct）来进行分析。为此，记录目的基因和看家基因的Ct值_T 内参基因和目的基因的值。
   1. 计算两个C之间的差值_T 用于标准化 mRNA 含量，并校正不同提取样本间 RNA 提取浓度的差异：
      ΔC_T = C_T （目的基因）- C_T （看门人）
   2. 计算 C 之间的差异幅度_T 通过与内参基因的比值进行目的基因的相对定量，结果以内参基因的百分比形式表示：
      ​相对定量 = (2^-ΔCT) × 100
   3. 通过比较各样本中目标基因的相对定量，分析不同患者供体或疾病状态之间的差异。
      注意：整个技术的示意图可在 图1.

结果

根据实验方案，选择48小时时间点以获得代表性结果。在选择性整形手术中产生的多余组织上制造初始伤口，如图2A所示，切除后的伤口清晰可见。苏木精-伊红染色证实已形成全层伤口（图2B）。48小时后，在光学显微镜下可见伤口部分闭合（图2C）。组织学染色显示上皮舌正在向前延伸以修复伤口（图2D），表明该离体（ex vivo）伤口愈合模型是体内（in vivo）伤口愈合的有效替代模型。

经切片并用苏木精和伊红染色后，在激光捕获显微切割系统中观察愈合伤口，并选择伤口区域（图3A）。该区域已通过此方法被完整切割，如图3B所示。RNA的质量和纯度较为理想（通过RNA完整性数值（RIN）分析；

讨论

随着全球范围内2型糖尿病等慢性疾病发病率的上升，迫切需要能够促进病理生理学相关研究的技术。上述方案提供了一种利用人体组织分析离体（ex vivo）愈合伤口转录组数据的标准化方法。

本方案依赖于已获得相关机构伦理许可以及患者知情同意的剩余临床组织。这些组织通常来自接受截肢手术或选择性整形手术的患者。需要仔细考虑供体的临床人口学特征，但该方法的一个优势在于能够对来自健康对照个体（例如因事故而接受截肢手术或接受选择性整形手术者）以及患有慢性疾病（如2型糖尿病）患者的多种组织样本开展研究。此外，由于该方法可在多个步骤暂停（见实验方案），因此可在手术进行时随时制备ex vivo 伤口样本，并在获得足够数量的组织样本后，将其储存起来用于并行的RNA分析。

本方案中最关键的步骤是激光显微切割（方案第3部分）。尽管已有大量文献利用该技术进行转录组分析，但本报告是首个提供完整实验方案以应用于研究伤口愈合反应受损患者的人体组织的研究。激光显微切割操作必须尽快完成，且最长不得超过一小时。这是为了最大限度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Arcturus RiboAmp PLUS 试剂盒	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA 扩增试剂盒
Diffuser Caps 0.5 mL	MMI	K10028161	激光捕获显微切割帽；50 个装
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D6046	含 1000 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，无菌过滤，适用于细胞培养
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270106	细胞培养添加剂
H&E 染色试剂盒 Plus	MMI	K10028305	无 RNase 的苏木精和伊红染色试剂盒
高容量 cDNA 反转录试剂盒	Applied Biosystems	4368814	反转录试剂盒
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030149	细胞培养添加剂
MembraneSlides	MMI	K10028153	激光捕获显微切割载玻片；每盒 5 片
Netwell 网格插入式培养插件	Corning	3479	细胞培养插入式装置
青霉素-链霉素-两性霉素B混合液	Thermo Fisher Scientific	15070-063	细胞培养添加剂
15290-026
OCT 包埋剂	Tissue-Tek Sakura	4583	适用于冷冻切片机的切片介质
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	每 100 mL 无菌水中加入 5 片，溶解后高压灭菌用于细胞培养
RNeasy Micro 试剂盒	Qiagen	74004	RNA 提取试剂盒
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase 去除喷雾剂
无菌刀片	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	组织解剖工具
Support Slide	MMI	K10028159	激光捕获显微切割支撑载玻片，无 RNase
手术剪刀	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	组织解剖工具
手术镊子	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	组织解剖工具
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	定量 PCR 预混液