激光捕获显微切割手术组织以鉴定2型糖尿病中伤口愈合障碍相关的异常基因表达

摘要

该技术提供了对临床相关的人体组织进行ex vivo损伤、激光显微切割以及定量分析糖尿病中与伤口愈合不良过程相关的基因表达变化的指导。

摘要

2型糖尿病（T2DM）的全球患病率正迅速上升。T2DM患者常伴有多种并发症，其中一种是伤口愈合受损，可能导致难愈性溃疡或足部溃疡，最终甚至需要截肢。在健康个体中，伤口愈合是一个受控且各阶段相互重叠的过程，包括炎症期、增殖期和重塑期。而在T2DM患者中，其中一个或多个阶段会出现功能障碍。目前用于研究T2DM中伤口愈合障碍的模型包括体外划痕伤口实验、皮肤等效物模型或动物模型，以探究伤口愈合的分子机制和/或潜在治疗方案。然而，这些模型尚无法完全模拟T2DM患者体内复杂的伤口愈合过程， 离体 人体皮肤试验存在伦理问题，因为已知患者在接受穿刺活检后伤口愈合不良。本文介绍了一种技术，可利用2型糖尿病（T2DM）患者截肢或选择性整形手术后废弃的多余组织，检测参与（功能失调性）伤口愈合反应的特定细胞的表达谱。本方案中，收集捐赠的皮肤样本，制造伤口后进行培养 离体 在气液界面培养条件下，于不同时间点固定并进行切片。利用激光显微切割技术分离参与伤口愈合的特定细胞类型（如表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞（乳头层和网状层）、血管系统），并通过测序或微阵列分析其基因表达差异，感兴趣基因进一步采用qPCR验证。该方案可用于分析糖尿病患者与非糖尿病患者手术后常规废弃的难愈合皮肤与完整皮肤之间固有的基因表达差异，有助于深入理解2型糖尿病慢性伤口形成及下肢截肢相关的分子机制。

引言

2型糖尿病的发病率在全球范围内不断上升，主要由肥胖流行和体力活动不足所驱动。这些患者常伴有伤口愈合不良，高达25%的患者会发展为慢性难愈性伤口¹。导致这一问题的机制复杂且尚未完全阐明，限制了新疗法的研发进展。其中一个重要因素是缺乏适用于研究2型糖尿病患者伤口愈合的合适模型。因此，本方法旨在提供一种生理相关性强的离体（ex vivo）模型，用于研究具有慢性伤口风险个体的伤口愈合过程，并支持通过转录组学分析推动新治疗靶点的发现。

目前有多种可用于研究伤口愈合的模型，每种模型都有其优势与局限性。体内动物模型，如 db/db 小鼠² 或链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠³，被广泛使用；然而，啮齿类动物模型的伤口通过收缩愈合，这与人体内的愈合机制存在显著差异，因而其在临床试验中的转化应用效果有限^4,5。使用人体组织的优势已被广泛认可⁴，但由于在已知存在伤口愈合障碍的个体身上人为制造实验性伤口涉及伦理问题，使得此类研究较为复杂。因此，针对糖尿病患者的研究更多集中于炎症反应，而非对切除组织进行实验⁶。器官芯片<....

方案

本方案依赖于提供的人类外科手术组织。实验前已获得伦理批准和患者的知情同意，且本研究符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则。

1. 组织的采集与 离体 损伤

1. 将截肢或手术中获取的外科组织收集至含有含5%青霉素-链霉素-两性霉素B、2 mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FBS；完全培养基）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的无菌容器中。
   注意：以这种方式采集的组织可在 4 °C 下保存最多 24 小时，然后进行实验。为确保组织在后续实验中的活性 离体 实验时，建议尽快处理组织，或在采集与损伤之间保持固定的时间间隔，以标准化多次组织捐献间的实验条件。若组织需要储存一段时间，应向样本中添加RNA稳定溶液，以维持RNA的完整性。
2. 使用无菌镊子将组织转移至一个盛有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中，PBS中添加5%青霉素-链霉素-两性霉素B。用无菌手术刀和/或手术剪去除真皮层上的脂肪组织，并弃去。将组织转移至另一个盛有无菌PBS的新鲜培养皿中。
3. 将两片无菌刀片固定在一起，使两刀片之间保持1 mm的间隙。在表皮及乳头层真皮上部沿长轴方向划出两条平行的直线切口，间距约1 mm。^10,11.
4. 使用无菌镊子和手术剪在划痕线之间去除表皮，....

结果

根据实验方案，选择48小时时间点以获得代表性结果。在选择性整形手术中产生的多余组织上制造初始伤口，如图2A所示，切除后的伤口清晰可见。苏木精-伊红染色证实已形成全层伤口（图2B）。48小时后，在光学显微镜下可见伤口部分闭合（图2C）。组织学染色显示上皮舌正在向前延伸以修复伤口（图2D），表明该离体（ex vivo）伤口愈合模型是体内（in vivo）伤口愈合的有效替代模型。

经切片并用苏木精和伊红染色后，在激光捕获显微切割系统中观察愈合伤口，并选定伤口区域（图3A）。该区域通过此方法被完整切割下来，如图3B所示。RNA的质量和纯度良好（通过RNA完整性编号（RIN）分析；

讨论

随着全球范围内2型糖尿病等慢性疾病发病率的上升，迫切需要能够促进病理生理学相关研究的技术。上述方案提供了一种利用人体组织分析离体（ex vivo）愈合伤口转录组数据的标准化方法。

本方案依赖于已获得相关机构伦理许可以及患者知情同意的剩余临床组织。这些组织通常来自接受截肢手术或选择性整形手术的患者。需要仔细考虑供体的临床人口学特征，但该方法的一个优势在于能够对来自健康对照个体（例如因事故而接受截肢手术或接受选择性整形手术者）以及患有慢性疾病（如2型糖尿病）患者的多种组织样本开展研究。此外，由于该方法可在多个步骤暂停（见实验方案），因此可在手术进行时随时制备ex vivo 伤口样本，并在获得足够数量的组织样本后，将其储存起来用于并行的RNA分析。

本方案中最关键的步骤是激光显微切割（方案第3部分）。尽管已有大量文献利用该技术进行转录组分析，但本报告是首个提供完整实验方案以应用于研究伤口愈合反应受损患者的人体组织的研究。激光显微切割操作必须尽快完成，且最长不得超过一小时。这是为了最大限度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Arcturus RiboAmp PLUS 试剂盒	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA 扩增试剂盒
Diffuser Caps 0.5 mL	MMI	K10028161	激光捕获显微切割帽；50 个装
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D6046	含 1000 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，无菌过滤，适用于细胞培养
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270106	细胞培养添加剂
H&E 染色试剂盒 Plus	MMI	K10028305	无 RNase 的苏木精和伊红染色试剂盒
高容量 cDNA 反转录试剂盒	Applied Biosystems	4368814	反转录试剂盒
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030149	细胞培养添加剂
MembraneSlides	MMI	K10028153	激光捕获显微切割载玻片；每盒 5 片
Netwell 网格插入式培养插件	Corning	3479	细胞培养插入式装置
青霉素-链霉素-两性霉素B混合液	Thermo Fisher Scientific	15070-063	细胞培养添加剂
15290-026
OCT 包埋剂	Tissue-Tek Sakura	4583	适用于冷冻切片机的切片介质
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	每 100 mL 无菌水中加入 5 片，溶解后高压灭菌用于细胞培养
RNeasy Micro 试剂盒	Qiagen	74004	RNA 提取试剂盒
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase 去除喷雾剂
无菌刀片	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	组织解剖工具
Support Slide	MMI	K10028159	激光捕获显微切割支撑载玻片，无 RNase
手术剪刀	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	组织解剖工具
手术镊子	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	组织解剖工具
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	定量 PCR 预混液