利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估

摘要

肠道上皮屏障功能和免疫反应失调是炎症性肠病的特征，但由于缺乏生理相关模型，这些特征迄今研究尚不充分。本文介绍一种小鼠肠道环模型，该模型利用血供良好且外置于体外的肠段，在活体条件下研究黏膜通透性和白细胞募集。

摘要

肠道黏膜由单层上皮细胞构成，形成一种动态屏障，允许营养物质和水的旁细胞转运，同时阻止管腔细菌和外源性物质的通过。该屏障层的破坏会导致管腔内容物通透性增加以及免疫细胞的募集，这两者均为肠道病理状态的特征，包括炎症性肠病（IBD）。

由于缺乏可用于定量分析的体内实验方法，目前对调控上皮屏障功能以及多形核中性粒细胞（PMN）跨上皮迁移（TEpM）的机制仍不完全清楚。本文介绍了一种可靠的鼠类实验模型，该模型采用外置的小肠末端或近端结肠节段。这种外置的肠段（iLoop）具有完整的血管化，相较于常用于研究上皮细胞单层通透性和PMN迁移的离体腔室方法，具有更优的生理学优势。

我们详细展示了该模型的两种应用：（1）通过检测肠腔内注射后血清中荧光标记的葡聚糖来定量测量肠道通透性；（2）在肠腔内引入趋化因子后，定量评估迁移穿过肠上皮进入肠腔的中性粒细胞（PMN）。我们验证了该模型的可行性，并展示了在缺乏上皮紧密连接相关蛋白JAM-A的小鼠中使用iLoop所获得的结果，与对照组进行比较。已有研究证明，JAM-A在炎症反应过程中可调控上皮屏障功能以及中性粒细胞的跨上皮迁移（PMN TEpM）。我们利用iLoop所得的结果证实了以往的研究，并进一步强调了JAM-A在体内稳态及疾病状态下对肠道通透性和中性粒细胞跨上皮迁移调控的重要性。

iLoop 模型为肠道稳态和炎症的可重复体内研究提供了一种高度标准化的方法，将显著增进对炎症性肠病（IBD）等疾病中肠道屏障功能和黏膜炎症的理解。

引言

肠黏膜包含单层柱状肠上皮细胞（IECs）、下方的固有层免疫细胞以及黏膜肌层。除了吸收营养物质的功能外，肠上皮还作为物理屏障，保护机体内部免受管腔内共生细菌、病原体和饮食抗原的侵害。此外，IECs与固有层免疫细胞协同调节免疫反应，根据具体环境和刺激信号诱导免疫耐受或免疫应答。已有研究报道，上皮屏障的破坏可能先于病理性黏膜炎症的发生，并参与炎症性肠病（IBD）的发展，该疾病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病^{1,2,3,4,5,6,7}。溃疡性结肠炎患者表现出多形核中性粒细胞（PMN）过度的跨上皮迁移（TEpM），形成隐窝脓肿，这一现象已被认为与疾病严重程度相关^8,9。尽管上皮屏障功能受损和过度免疫反应是IBD的典型特征，但目前仍缺乏可在体内定量评估肠黏膜通透性和免疫细胞募集的实验方法。

研究肠上皮通透性和中性粒细胞跨上皮迁移（PMN TEpM）最常用的方法是采用基于腔室的离体实验，利用培养在半透性多孔膜插入物上的肠上皮细胞（IEC）单层进行实验^10,11,12。上皮屏障完整性可通过跨上皮电阻（TEER）的测定，或荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖从顶端向基底侧腔室的旁细胞通量来监测^13,14,15。类似地，PMN TEpM 通常通过在下腔室中加入趋化因子来研究¹⁶。将中性粒细胞置于上腔室，经过一定孵育时间后，收集并定量迁移至基底侧腔室的中性粒细胞。尽管这些方法具有实用性、操作简便且可重复性高，但显然属于简化模型，未必能准确反映体内实际情况。

在小鼠中，研究肠道旁细胞通透性的常用方法是经口灌胃给予FITC-葡聚糖，随后检测血液血清中出现的FITC-葡聚糖含量^13,17。该方法的缺点在于其反映的是整个胃肠道屏障完整性的综合评估，而非特定肠段各自对通透性的贡献。此外，伊文思蓝常用于体内评估血管渗漏¹⁸，也被用于评估小鼠和大鼠的肠道黏膜通透性^19,20,21。对肠道黏膜中伊文思蓝的定量需要通过在甲酰胺中孵育过夜来提取组织中的染料。因此，同一组织样本无法同时用于研究肠道上皮通透性和中性粒细胞浸润。

本文介绍了一种简化方案，可减少为获得可重复的结肠黏膜通透性和白细胞跨上皮迁移体内数据所需使用的动物数量。因此，我们推荐使用FITC-葡聚糖，其在血清中易于检测，且不会破坏结扎肠段的完整性，从而可将其回收用于后续分析。值得注意的是，结扎肠段模型已在多种物种（包括小鼠、大鼠、兔、犊牛）中用于研究细菌感染（例如 沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌)^22,23,24,25 以及肠道通透性²⁶然而，据我们所知，目前尚无研究探讨中性粒细胞在肠道特定区域（如回肠或结肠）跨上皮迁移的机制，而这些区域常受炎症性肠病累及。

本文介绍了一种稳定可靠的活体显微外科小鼠肠袢（iLoop）模型，该模型采用血供良好且外置于体外的回肠或近端结肠节段。iLoop模型具有生理相关性，可在麻醉状态下活体评估小鼠肠道屏障完整性和中性粒细胞跨上皮迁移（PMN TEpM）。我们展示了两种应用：1）在iLoop内给予4 kDa FITC-葡聚糖后，定量检测血清中的水平；2）在iLoop腔内注射后，定量检测迁移至腔内的中性粒细胞（PMN）数量 强效趋化因子白三烯B₄ (LTB₄)²⁷此外，利用iLoop模型与 Jam-a-基因敲除小鼠或肠上皮细胞中特异性缺失JAM-A的小鼠（Villin-cre；Jam-a ^fl/fl与对照小鼠相比，我们能够证实先前研究的结论，即紧密连接相关蛋白 JAM-A 在肠道通透性和中性粒细胞跨膜迁移中具有重要作用。^{15,28,29,30,31}.

iLoop 模型是一种高度功能化且符合生理条件的方法，可用于验证体外实验。此外，该模型具有良好的通用性，可用来研究多种可注入袢腔内的试剂，包括趋化因子、细胞因子、细菌病原体、毒素、抗体以及治疗药物。

方案

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院的指南和政策进行，并经机构动物护理与使用委员会批准。 & 密歇根大学使用委员会。

1. 术前准备

注意：本方法使用8至12周龄、C57BL/6遗传背景的成年小鼠建立。所有小鼠均饲养于严格的无特定病原体环境中，可自由摄取普通饲料和水。实验所用小鼠包括C57BL/6小鼠、Jam-a基因敲除小鼠（Jam-a^-/-），以及肠上皮细胞特异性缺失JAM-A的小鼠（Villin-cre;Jam-a^fl/fl），同时以同窝出生的Jam-a^fl/fl小鼠作为对照，如先前所述³⁰。

1. 区域准备
   1. 在洁净区域进行手术。然而，肠袢模型为非存活手术，无需无菌/无菌操作技术。应遵守兽医卫生规范，并使用清洁的手术器械（即用肥皂刷洗，用水冲洗后用70%乙醇处理）。
   2. 开启温控手术板（或加热垫）并调整适配光源，以防止动物在麻醉和手术期间发生低体温。
   3. 通过裁剪非吸收性4-0丝线缝合线，制备长度为6 cm的结扎线段。
   4. 准备中心部位按椭圆形裁剪的棉纱布（5 cm × 5 cm），用于覆盖正中腹切口，并防止外翻的肠袢与动物毛发直接接触。将裁剪好的纱布浸泡于培养皿中温热的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。
   5. 准备用温热HBSS浸湿的棉签，用于操作器官和外翻的肠袢。
   6. 准备装有温热HBSS的10 mL注射器，并连接黄色喂养管。该注射器用于手术期间保持暴露组织湿润，并轻柔冲洗肠袢内的粪便内容物。
2. 动物准备
   1. 根据批准的动物实验方案对动物实施麻醉。本方案中通过麻醉蒸发器给予异氟烷与氧气的混合气体。根据制造商说明，调节氧气流速至1 L/min。将蒸发器设定为5%，并预充诱导室。5分钟后，将异氟烷蒸发器浓度降至2%–2.5%。
   2. 将动物置于诱导室内3–5分钟，随后转移至加热手术板上，并连接麻醉鼻罩接头。使用胶带固定四肢，使动物呈仰卧位。
      注：作为麻醉替代方案，可通过腹腔注射给予氯胺酮（80 mg/kg–100 mg/kg）与赛拉嗪（5 mg/kg–10 mg/kg）溶于生理盐水（0.9% NaCl）的混合液。为维持麻醉深度，应通过肌肉注射追加氯胺酮/赛拉嗪（剂量为初始剂量的0.1–0.25倍）。如条件允许，强烈推荐使用异氟烷麻醉蒸发器，以确保更好的可重复性、存活率并防止动物疼痛。
   3. 在双眼涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
   4. 进行体格检查，包括心率（约500次/分钟）和心律、黏膜颜色（粉红色）、毛细血管再充盈时间（< 2秒）、呼吸频率（不低于40–60次/分钟）以及体温（36.5 °C）³²。
   5. 在进行下一步操作前，通过足底回缩反射评估麻醉深度。对脚趾间或足垫皮肤施加疼痛刺激（捏压），小鼠会通过收缩并抽回腿部作出反应。当动物深度麻醉时，该足底反射消失。
      ​注：建议在整个麻醉过程中至少每15分钟监测一次生命体征和足底反射。机构动物护理与使用委员会（IACUC）关于麻醉深度评估的指南建议监测以下指标：（a）尾部、足部和黏膜（如舌部）的颜色，正常为粉红色，苍白或发绀提示血流灌注不足或呼吸窘迫；（b）呼吸模式是否规律。可分别使用直肠温度探头、啮齿类动物血氧仪和心率监测仪评估体温、心率和呼吸频率。

2. 回肠袢的制备

1. 皮肤准备：用酒精棉片或浸有70%乙醇的纱布擦拭腹部中线的毛发。避免用酒精浸湿大面积毛发，以防低体温。
2. 使用剪刀进行腹部正中切口。在腹部中央做一垂直切口（长约2 cm），暴露腹膜。操作时注意避免损伤腹腔内器官。
3. 将预先剪好并润湿的棉纱布覆盖在暴露的腹腔上。
4. 用湿润的棉签游离并外置盲肠。小心地将盲肠放置在湿润的棉纱布上。
   注意：在大多数小鼠中，盲肠位于腹腔的左后象限，且不受动物性别的影响。
5. 用湿润的棉签游离并轻柔地外置回肠，其末端（远端）与盲肠相连（图1B）。
6. 将至少6 cm长的末端回肠展布于湿润的棉纱布上，注意不要破坏肠系膜血管及其血液供应。若无出血且组织保持粉红色，则表明血供良好（图1B）。
   注意：使用连接黄色饲管的10 mL注射器，每隔2–3分钟用温热的HBSS润湿组织，以保持暴露组织湿润，防止干燥（见步骤1.1.6）。
7. 靠近盲肠处，在肠系膜中辨认出为回肠供血的主要动脉。随后在肠系膜上选择两个无重要血管穿行的结扎位点。
8. 使用钝头组织镊牢固夹住末端回肠（靠近盲肠端），再用精细镊子在避开血管的区域对肠系膜进行穿孔。将丝线穿过穿孔处并打外科结，完成第一处结扎（环段的远端）。
9. 使用直尺测量，从第一处结扎点起向远端量取4 cm，按步骤2.8所述方法进行第二处结扎（环段的近端）（图1C）。
10. 用精细剪刀小心地在每处结扎线旁剪断，以分离出4 cm长的回肠环段，同时保持血液供应和肠系膜结构完整。
    注意：剪除外置iLoop段的两端后，需轻柔冲洗，此步骤可清除管腔内容物（如粪便物质）的干扰，有助于FITC-葡聚糖或趋化因子在整个隔离肠段内均匀分布，并提高流式细胞术对白细胞定量的准确性。此外，该操作可确保注入指定体积试剂后黏膜扩张均匀，增强动物间实验的可重复性。
11. 使用连接于10 mL注射器的柔软黄色饲管，以温热的HBSS轻柔冲洗回肠环段内的内容物（见步骤1.1.6）。
12. 使用丝线结扎冲洗后回肠环段的两个断端。
13. 使用1 mL注射器配30 G针头，缓慢向肠腔内注射250 µL试剂（如FITC-葡聚糖，见步骤4.2；或趋化因子，见步骤5.3）。回肠环将膨胀，导致黏膜中度扩张（图1D）。
    ​注意：应将试剂注射至肠系膜动脉对侧的环腔内。注射时注意避免将回肠环从动物体内拉出，以防撕裂血管引起出血。
14. 用湿润的棉签将回肠环、近端回肠和盲肠轻柔复位。
15. 使用持针器、解剖镊及带反向切割针的3.0不可吸收丝线缝合腹壁。
16. 将动物置于温控麻醉舱内，进行孵育。

3. 近端结肠袢（pcLoop）的构建

注意：有关用于生成 pcLoop 的小鼠的详细信息，请参见方案部分开头提供的信息。

1. 按照上述方法对回肠袢执行步骤 2.1 至 2.4。
2. 使用湿润的棉签将整个回肠外置，并置于湿润纱布上方。辨认近端结肠及肠系膜结肠中的血供。游离近端结肠，并使用精细镊子在肠系膜结肠无血管区域、距盲肠约 0.5 cm 处打第一个结扎（图 2B）。
3. 从第一个结扎处测量 2 cm，在肠系膜结肠无血供区域打第二个结扎（图 2C）。
4. 使用精细剪刀小心地在每条结扎线旁剪开，以分离出一段 2 cm 长的 pcLoop。
   注意：如步骤 2.10 下的注释所述，重要的是剪除两端，以获得一段轻柔清除管腔内容物的 pcLoop。小心剪开结肠组织和肠系膜结肠，防止小血管出血进入肠腔。如有必要，可使用热凝止血法控制切口部位出血。
5. 使用连接 10 mL 注射器的柔软黄色饲管（见步骤 1.1.6），以温热的 HBSS 轻柔冲洗 pcLoop，清除粪便。
6. 使用丝线缝合结扎已冲洗的 pcLoop 的两个切断端。
7. 使用 1 mL 注射器配 30G 针头，缓慢向肠腔内注射 200 μL 试剂，如 FITC-葡聚糖（步骤 4.2）或趋化因子（步骤 5.3）。pcLoop 将膨胀，导致黏膜适度扩张（图 2D）。
   注意：将试剂注射至与肠系膜动脉相对的一侧肠腔内。确保动物间操作一致，并制作 2 cm 长的 pcLoop，以保证黏膜扩张程度均一。
8. 使用湿润棉签轻柔地将结扎后的 pcLoop、回肠和盲肠复位至腹腔内。
9. 使用持针器、解剖镊和带反向切割针的 3.0 不可吸收丝线缝合腹壁。
10. 将动物放入温控麻醉舱中，进行孵育期观察。

4. 肠道通透性的定量评估：4 kDa FITC-葡聚糖检测

1. 进行回肠袢或pcLoop操作（如上所述）。
2. 使用带有30 G针头的1 mL注射器，向肠腔内注射4 kDa FITC-葡聚糖溶液（1 mg/mL，溶于HBSS）250 µL（回肠，见步骤2.13）或200 µL（结肠，见步骤3.7）。未使用的FITC-葡聚糖溶液需避光保存，以便在采集血清后绘制标准曲线。
3. 对于回肠袢，请执行步骤2.14至2.16；对于pcLoop，请执行步骤3.8至3.10。简要而言，将器官和iLoop放回腹腔内原位，缝合腹壁。
4. 将动物置于加热的麻醉舱中120分钟。
5. 孵育结束后，打开腹壁，暴露心脏，使用带有25 G针头的1 mL注射器进行心脏穿刺以采集血液。将血液转移至1.3 mL含促凝剂的血清管中，轻轻混匀，并置于冰上避光保存。每只小鼠至少采集500 µL血液。
   ​注意：动物在麻醉状态下采用物理方法（如断头或颈椎脱位）实施安乐死，操作须符合已批准的动物实验方案。
6. 根据制造商建议，在室温下以10,000 x g 离心血清促凝管5分钟。收集血清（上清液），转移至1.7 mL离心管中。将离心管置于冰上并避光保存。
7. 血清中荧光强度的定量分析
   1. 使用对照组小鼠（生理盐水或HBSS亦可作为替代）的血清配制4 kDa FITC-葡聚糖的标准曲线。从1 mg/mL FITC-葡聚糖起始，进行两倍系列稀释。所测定的4 kDa FITC-葡聚糖浓度范围为0.25 mg/mL至2 µg/mL。
   2. 将等体积的样品与标准品加入黑色96孔板（平底），按照制造商说明及已发表的实验方案³³，使用荧光酶标仪（激发波长490 nm，发射波长520 nm）检测FITC荧光值。根据标准曲线计算FITC浓度，或以相对于实验对照组归一化的倍数变化形式表示通透性数值。

5. 化学趋化因子肠腔内刺激后迁移至肠腔的中性粒细胞的定量评估

注意：在基础状态下，仅有极少数中性粒细胞（PMN）存在于肠黏膜中。用促炎性细胞因子对动物进行预处理，可产生一种促炎环境，从而促进中性粒细胞从血液中募集至肠黏膜。

1. 使用带30 G针头的1 mL注射器，向腹腔内（i.p.）注射含有100 ng肿瘤坏死因子-α（TNFα）和100 ng干扰素-γ（INFγ）的无菌溶液，溶于200 µL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
2. 经促炎性细胞因子预处理4–24小时后，进行回肠袢或pcLoop操作（如上所述）。
3. 使用带30 G针头的1 mL注射器，向肠腔内注射250 µL（回肠，步骤2.13）或200 µL（结肠，步骤3.7）趋化因子溶液白三烯B4（LTB₄），浓度为1 nM，溶于HBSS中。
   ​注：本实验方案使用白三烯B4（LTB₄）作为中性粒细胞（PMN）的强效趋化因子。其他趋化因子如N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLF）或C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1/KC）也可用于诱导PMN大量募集至结肠腔内³⁰。
4. 对于回肠袢，请执行步骤2.14至2.16；对于pcLoop，请执行步骤3.8至3.10。简而言之，将器官和iLoop放回腹腔内原位，缝合腹壁。
5. 将动物置于加热的麻醉舱中60分钟。
6. 肠袢内容物的收集
   1. 配制溶液并置于冰上保存：对于回肠袢和pcLoop，配制洗涤缓冲液，其中含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、5 mM二硫苏糖醇（DTT）和2%胎牛血清（FBS），溶于不含钙和镁的无菌PBS中。
   2. 孵育结束后，在维持麻醉状态下打开腹壁，取出iLoop（回肠袢或pcLoop）。动物在麻醉状态下采用物理方法（如断头术或颈椎脱位）实施安乐死，操作须符合批准的动物实验方案。
   3. 用冷PBS冲洗肠袢以去除任何残留的血液污染物，并用纸巾吸去多余的PBS。小心收集肠袢内容物至1.7 mL离心管中（回肠袢约250 µL，pcLoop约200 µL）。用500 µL冷洗涤缓冲液冲洗肠袢，收集后立即将离心管置于冰上。
      ​注：DTT有助于溶解黏液。若iLoop肠腔内容物黏稠度较高（取决于小鼠遗传背景），可用含DTT的洗涤缓冲液将其稀释1:2或1:3。
   4. 使用带细胞筛帽的5 mL圆底管，将肠腔内容物溶液通过35 µm尼龙滤网过滤。此步骤有助于去除组织碎片和细胞聚集体。用1 mL洗涤缓冲液冲洗细胞筛。
   5. 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。弃去上清液，用500 µL–1 mL洗涤缓冲液重悬沉淀，再次在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
   6. 将iLoop肠腔细胞沉淀重悬于200 µL流式细胞术缓冲液（FCB）中，FCB含2% FBS，溶于不含钙和镁的无菌PBS中。细胞可保留在离心管中，或转移至96孔圆底板中用于流式细胞术染色与分析。
7. 流式细胞术染色与分析
   1. 补偿对照：白细胞
      1. 准备一支带25 G针头的1 mL注射器，预先装入无菌0.5 M EDTA（pH 8.0）。EDTA用量为预期血量的10%（每1 mL血液加入100 µL EDTA）。
      2. 在麻醉状态下通过心脏穿刺采集血液。将血液转移至1.7 mL离心管中，然后在4 °C条件下以400 × g离心10分钟。
         注：小鼠处于麻醉状态时，应采用物理方法（如颈椎脱位）确认死亡，操作须符合批准的动物实验方案。
      3. 吸除上清液。将沉淀重悬于1 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，以裂解红细胞。冰上孵育3–5分钟。在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。若沉淀仍呈红色，重复ACK裂解步骤直至沉淀变为白色。
      4. 将沉淀重悬于1 mL FCB中，并将0.5 × 10⁶–1 × 10⁶个细胞接种至每孔。准备96孔圆底板中的五个孔，并将该板置于冰上。
         ​注：使用与肠袢腔内容物相同的96孔板（见步骤5.6.6）。
   2. 流式细胞术染色
      1. 将96孔板在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。弃去上清液，用50 µL纯化大鼠抗小鼠CD16/CD32（Fc阻断剂，每100 µL FCB中含1 μg）重悬各孔沉淀。冰上孵育5–10分钟。
      2. iLoop肠腔内容物的免疫染色：配制含所有荧光素偶联抗体的混合液（在FCB中1:50稀释）：抗-CD45-PerCP、抗-CD11b-PE和抗-Ly-6G-Alexa Fluor 647。每孔加入50 µL该混合液，终体积为100 µL。
      3. 白细胞补偿对照的免疫染色（在FCB中1:50稀释）：仅加入50 µL FCB（未染色样本，第1孔），或分别加入50 µL各单个荧光素偶联抗体（第2–4孔），或加入50 µL所有荧光素偶联抗体的混合液（第5孔）。终体积为100 µL。
      4. 将板置于避光冰上孵育30分钟。
      5. 将板在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。弃去上清液，用200 µL FCB洗涤。重复洗涤两次。
      6. 向血液样本每孔加入150 µL FCB。
      7. 向iLoop肠腔内容物样本每孔加入100 µL FCB，随后每孔加入50 µL荧光计数微球。
   3. 流式细胞术分析
      1. 设门圈选CD45阳性事件，并分析Ly-6G-/Gr-1和CD11b的表达³⁰。
      2. 以100 µL样本体积作为采集停止条件。
      3. 根据荧光计数微球生产商提供的信息，计算迁移至iLoop肠腔内的PMN绝对数量。
         注：数据可表示为（1）肠腔内PMN总数^30,34,35，（2）每克组织中PMN数量，以及（3）每mm³中PMN数量，后者可通过圆柱体体积公式V = π(pi) r²h（V为体积，r为半径，h为高度）计算得出。

结果

回肠环和pcLoop模型的示意图如下所示 图1 和 图2，分别。解剖图展示了该操作的关键步骤，包括肠段的外置（图1B 和 图2B），确定适合结扎的位置，以最大程度减少对血液供应的干扰（图1C 和 图 2C）以及切割后对iLoop末端进行清洗并连接，随后可向其中填充试剂溶液（图1D 和 图 2D重要的是，iLoop 模型能够保留关键的血液供应，并允许所施加试剂（如 FITC-葡聚糖或强效的中性粒细胞趋...

讨论

在炎症性肠病（IBD）等病理条件下，导致肠道屏障功能失调和免疫细胞募集的机制尚未完全阐明。本文详细介绍了一种可靠的体内小鼠模型，该模型采用血供良好的外置小肠末端或近端结肠节段，可用于评估肠道通透性、中性粒细胞迁移以及其他相关研究。

iLoop 是一种在活体动物上进行的非恢复性手术。实验过程中必须持续监测麻醉状态，并强制评估镇静深度。最关键的步骤包括：（1）iLoop 的分离，（2）切断端的结扎，以及（3）通过管腔内注射试剂溶液使 iLoop 膨胀。在上述每一步中均可能发生出血，从而影响 iLoop 的血液供应并干扰实验结果的准确性。值得注意的是，在 PMN 跨上皮迁移（TEpM）实验中若出现罕见的管腔内出血情况，本文所提供的流式细胞术设门策略将有助于区分从 iLoop 跨膜迁移的 PMN 与直接来源于血液循环的 PMN（未迁移 PMN）。与循环中的 PMN 相比，收集于 iLoop 管腔内的跨膜迁移 PMN 表面标志物 CD11b¹⁰ 的表达水平显著升高（图 4D）。

...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器与材料
BD 酒精棉片	BD	326895
BD PrecisionGlide 针头，25G × 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide 针头，30G × 1/2"	BD	305106
BD 1ml 无针结核菌素注射器	BD	309659
15ml 离心管	Corning	14-959-53A
Corning 96 孔实心黑色聚苯乙烯微孔板	FisherScientific	07-200-592
Corning 未处理培养皿，10cm	MilliporeSigma	CLS430588
棉签（棉签），6"，无菌	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex 棉填充纱布垫，非无菌，2" × 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 麻醉蒸发器（经典系统，含加热单元）	E-Z Systems	EZ-7000
Falcon 离心管 50ml	VWR	21008-940
Fisherbrand 彩色标签胶带	FisherScientific	15-901-10R
Halsey 持针器（持针钳）	FST	12001-13
Kimwipes 小号（擦拭纸巾）	FisherScientific	06-666
1.7ml 微量离心管	Thomas Scientific	c2170
1.3ml Z 微量管（血清凝块激活管）	Sarstedt	41.1501.105
Moria 精细剪刀	FST	14370-22
5ml 聚苯乙烯圆底管，带细胞滤网帽（35 µm 尼龙网）	Falcon	352235
Puralube Vet 软膏，无菌眼用润滑剂	Dechra	12920060
环形镊子（钝组织镊）	FST	11103-09
Roboz 外科 4-0 黑色编织丝线，100 码	FisherScientific	NC9452680
Semken 镊子（解剖镊）	FST	1108-13
Sofsilk 不可吸收涂层黑色缝合线，编织丝线，3-0 规格，18"，针长 19mm，3/8 圆弧反向切割	HenrySchein	SS694
学生用精细镊子，弯头	FST	91110-10
10ml 注射器 PP/PE，无针	Millipore Sigma	Z248029
96 孔细胞培养板	Corning	3799
黄色啮齿动物饲喂管，20G × 30 mm	Instech	FTP-20-30
溶液与缓冲液
Accugene 0.5M EDTA	Lonza	51201
氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液	BioWhittaker	10-548E
Hanks 平衡盐溶液	Corning	21-023-CV
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液	Corning	21-040-CV
试剂
Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly-6G 抗体（1A8）	BioLegend	127610
CD11b 单克隆抗体，PE，eBioscience（M1/70）	ThermoFisher	12-0112-81
CountBright 绝对计数微球	Invitrogen	C36950
二硫苏糖醇	FisherScientific	BP172-5
胎牛血清，热灭活	R&D Systems	511550
异硫氰酸荧光素-葡聚糖，平均分子量 4,000	Sigma	60842-46-8
异氟烷	Halocarbon	12164-002-25
白三烯 B4	Millipore Sigma	71160-24-2
PerCP 大鼠抗小鼠 CD45（30-F11）	BD Pharmingen	557235
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD FC 封闭剂）	BD Bioscience	553142
重组小鼠 IFN-γ	Peprotech	315-05
重组小鼠 TNF-α	Peprotech	315-01A