利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估

摘要

肠道上皮屏障功能和免疫反应失调是炎症性肠病的特征，但由于缺乏生理相关模型，这些特征迄今研究尚不充分。本文介绍一种小鼠肠道环模型，该模型利用血供良好且外置于体外的肠段，在活体条件下研究黏膜通透性和白细胞募集。

摘要

肠道黏膜由单层上皮细胞构成，形成一种动态屏障，允许营养物质和水的旁细胞转运，同时阻止管腔细菌和外源性物质的通过。该屏障层的破坏会导致管腔内容物通透性增加以及免疫细胞的募集，这两者均为肠道病理状态的特征，包括炎症性肠病（IBD）。

由于缺乏可用于定量分析的体内实验方法，目前对调控上皮屏障功能以及多形核中性粒细胞（PMN）跨上皮迁移（TEpM）的机制仍不完全清楚。本文介绍了一种可靠的鼠类实验模型，该模型采用外置的小肠末端或近端结肠节段。这种外置的肠段（iLoop）具有完整的血管化，相较于常用于研究上皮细胞单层通透性和PMN迁移的离体腔室方法，具有更优的生理学优势。

我们详细展示了该模型的两种应用：（1）通过检测肠腔内注射后血清中荧光标记的葡聚糖来定量测量肠道通透性；（2）在肠腔内引入趋化因子后，定量评估迁移穿过肠上皮进入肠腔的中性粒细胞（PMN）。我们验证了该模型的可行性，并展示了在缺乏上皮紧密连接相关蛋白JAM-A的小鼠中使用iLoop所获得的结果，与对照组进行比较。已有研究证明，JAM-A在炎症反应过程中可调控上皮屏障功能以及中性粒细胞的跨上皮迁移（PMN TEpM）。我们利用iLoop所得的结果证实了以往的研究，并进一步强调了JAM-A在体内稳态及疾病状态下对肠道通透性和中性粒细胞跨上皮迁移调控的重要性。

iLoop 模型为肠道稳态和炎症的可重复体内研究提供了一种高度标准化的方法，将显著增进对炎症性肠病（IBD）等疾病中肠道屏障功能和黏膜炎症的理解。

引言

肠黏膜包含单层柱状肠上皮细胞（IECs）、下方的固有层免疫细胞以及黏膜肌层。除了吸收营养物质的功能外，肠上皮还作为物理屏障，保护机体内部免受管腔内共生细菌、病原体和饮食抗原的侵害。此外，IECs与固有层免疫细胞协同调节免疫反应，根据具体环境和刺激信号诱导免疫耐受或免疫应答。已有研究报道，上皮屏障的破坏可能先于病理性黏膜炎症的发生，并参与炎症性肠病（IBD）的发展，该疾病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病^{1,2,3,4,5,6,7}。溃疡性结肠炎患者表现出多形核中性粒细胞（PMN）过度的跨上皮迁移（TEpM），形成隐窝脓肿，这一现象已被认为与疾病严重程度相关^8,9。尽管上皮屏障功能受损和过度免疫反应是IBD的典型特征，但目前仍缺乏可在体内定量评估肠黏膜通透性和免疫细胞募集的实验方法。

研究肠上皮通透性和中性粒细胞....

方案

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院的指南和政策进行，并经机构动物护理与使用委员会批准。 & 密歇根大学使用委员会。

1. 术前准备

注意：本方法使用8至12周龄、C57BL/6遗传背景的成年小鼠建立。所有小鼠均饲养于严格的无特定病原体环境中，可自由摄取普通饲料和水。实验所用小鼠包括C57BL/6小鼠、Jam-a基因敲除小鼠（Jam-a^-/-），以及肠上皮细胞特异性缺失JAM-A的小鼠（Villin-cre;Jam-a^fl/fl），同时以同窝出生的Jam-a^fl/fl小鼠作为对照，如先前所述³⁰。

1. 区域准备
   1. 在洁净区域进行手术。然而，肠袢模型为非存活手术，无需无菌/无菌操作技术。应遵守兽医卫生规范，并使用清洁的手术器械（即用肥皂刷洗，用水冲洗后用70%乙醇处理）。
   2. 开启温控手术板（或加热垫）并调整适配光源，以防止动物在麻醉和手术期间发生低体温。
   3. 通过裁剪非吸收性4-0丝线缝合线，制备长度为6 cm的结扎线段。
   4. 准备中心部位按椭圆形裁剪的棉纱布（5 cm × 5 cm），用于覆盖正中腹切....

结果

回肠环和pcLoop模型的示意图如下所示 图1 和 图2，分别。解剖图展示了该操作的关键步骤，包括肠段的外置（图1B 和 图2B），确定适合结扎的位置，以最大程度减少对血液供应的干扰（图1C 和 图 2C）以及切割后对iLoop末端进行清洗并连接，随后可向其中填充试剂溶液（图1D 和 图 2D重要的是，iLoop 模型能够保留关键的血液供应，并允许所施加试剂（如 FITC-葡聚糖或强效的中性粒细胞趋.......

讨论

在炎症性肠病（IBD）等病理条件下，导致肠道屏障功能失调和免疫细胞募集的机制尚未完全阐明。本文详细介绍了一种可靠的体内小鼠模型，该模型采用血供良好的外置小肠末端或近端结肠节段，可用于评估肠道通透性、中性粒细胞迁移以及其他相关研究。

iLoop 是一种在活体动物上进行的非恢复性手术。实验过程中必须持续监测麻醉状态，并强制评估镇静深度。最关键的步骤包括：（1）iLoop 的分离，（2）切断端的结扎，以及（3）通过管腔内注射试剂溶液使 iLoop 膨胀。在上述每一步中均可能发生出血，从而影响 iLoop 的血液供应并干扰实验结果的准确性。值得注意的是，在 PMN 跨上皮迁移（TEpM）实验中若出现罕见的管腔内出血情况，本文所提供的流式细胞术设门策略将有助于区分从 iLoop 跨膜迁移的 PMN 与直接来源于血液循环的 PMN（未迁移 PMN）。与循环中的 PMN 相比，收集于 iLoop 管腔内的跨膜迁移 PMN 表面标志物 CD11b¹⁰ 的表达水平显著升高（图 4D）。

.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器与材料
BD 酒精棉片	BD	326895
BD PrecisionGlide 针头，25G × 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide 针头，30G × 1/2"	BD	305106
BD 1ml 无针结核菌素注射器	BD	309659
15ml 离心管	Corning	14-959-53A
Corning 96 孔实心黑色聚苯乙烯微孔板	FisherScientific	07-200-592
Corning 未处理培养皿，10cm	MilliporeSigma	CLS430588
棉签（棉签），6"，无菌	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex 棉填充纱布垫，非无菌，2" × 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 麻醉蒸发器（经典系统，含加热单元）	E-Z Systems	EZ-7000
Falcon 离心管 50ml	VWR	21008-940
Fisherbrand 彩色标签胶带	FisherScientific	15-901-10R
Halsey 持针器（持针钳）	FST	12001-13
Kimwipes 小号（擦拭纸巾）	FisherScientific	06-666
1.7ml 微量离心管	Thomas Scientific	c2170
1.3ml Z 微量管（血清凝块激活管）	Sarstedt	41.1501.105
Moria 精细剪刀	FST	14370-22
5ml 聚苯乙烯圆底管，带细胞滤网帽（35 µm 尼龙网）	Falcon	352235
Puralube Vet 软膏，无菌眼用润滑剂	Dechra	12920060
环形镊子（钝组织镊）	FST	11103-09
Roboz 外科 4-0 黑色编织丝线，100 码	FisherScientific	NC9452680
Semken 镊子（解剖镊）	FST	1108-13
Sofsilk 不可吸收涂层黑色缝合线，编织丝线，3-0 规格，18"，针长 19mm，3/8 圆弧反向切割	HenrySchein	SS694
学生用精细镊子，弯头	FST	91110-10
10ml 注射器 PP/PE，无针	Millipore Sigma	Z248029
96 孔细胞培养板	Corning	3799
黄色啮齿动物饲喂管，20G × 30 mm	Instech	FTP-20-30
溶液与缓冲液
Accugene 0.5M EDTA	Lonza	51201
氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液	BioWhittaker	10-548E
Hanks 平衡盐溶液	Corning	21-023-CV
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液	Corning	21-040-CV
试剂
Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly-6G 抗体（1A8）	BioLegend	127610
CD11b 单克隆抗体，PE，eBioscience（M1/70）	ThermoFisher	12-0112-81
CountBright 绝对计数微球	Invitrogen	C36950
二硫苏糖醇	FisherScientific	BP172-5
胎牛血清，热灭活	R&D Systems	511550
异硫氰酸荧光素-葡聚糖，平均分子量 4,000	Sigma	60842-46-8
异氟烷	Halocarbon	12164-002-25
白三烯 B4	Millipore Sigma	71160-24-2
PerCP 大鼠抗小鼠 CD45（30-F11）	BD Pharmingen	557235
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD FC 封闭剂）	BD Bioscience	553142
重组小鼠 IFN-γ	Peprotech	315-05
重组小鼠 TNF-α	Peprotech	315-01A