本文介绍了一种跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）的实验方案，这是一种非接触式扫描探针技术，可用于对活体听觉毛细胞中的静纤毛束进行纳米级成像。
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摘要
摘要
内耳毛细胞可检测声音引起的位移，并通过由静纤毛组成的毛束将这些刺激转化为电信号，其中静纤毛按高度递增的行排列。当静纤毛发生偏转时，会牵拉连接相邻静纤毛、直径约5 nm的微小细胞外顶端连接（tip links），从而将力学力传递至机械敏感性转导通道。尽管数十年来研究人员已在活体毛细胞中对机械转导过程进行了研究，但位于静纤毛顶端、与功能密切相关的关键超微结构细节（如顶端连接的动态变化或转导依赖性的静纤毛重塑）仍只能通过电子显微镜在固定死亡细胞中进行观察。理论上，扫描探针技术（如原子力显微镜）具备足够的分辨率以可视化静纤毛表面结构。然而，无论采用何种成像模式，原子力显微镜探针与毛束之间即使发生最轻微的接触，通常也会造成毛束损伤。本文介绍了一种用于活体啮齿类动物听觉毛细胞成像的跳跃式探针离子电导显微镜（HPICM）详细实验方案。这种非接触式扫描探针技术能够在不与样品发生物理接触的前提下，以单纳米级分辨率对具有复杂拓扑结构的活细胞表面（如毛细胞）进行长时间延时成像。HPICM利用通过玻璃纳米移液管的电流来检测探针附近细胞表面的位置，同时由三维压电定位系统扫描表面并生成图像。借助HPICM，我们成功对活体听觉毛细胞中的静纤毛束及其相互连接的结构进行了数小时的连续成像，且未观察到明显损伤。我们预期，HPICM的应用将有助于直接探究活体毛细胞静纤毛中发生的超微结构变化，从而更深入地理解其功能机制。
引言
尽管听觉毛细胞中的静纤毛束足够大，可以通过光学显微镜观察，并在活细胞的膜片钳实验中发生偏转，但换能机制的关键结构组分（如顶端连接）只能在死细胞中通过电子显微镜成像。在哺乳动物的听觉毛细胞中，换能机制位于顶端连接的下端，即较短排静纤毛的顶端1，并通过静纤毛顶端的局部信号进行调控2,3。然而，由于静纤毛尺寸微小，目前尚无法在活体毛细胞中对该位置的表面结构进行无标记成像。
哺乳动物的耳蜗包含两种听觉感觉细胞：内毛细胞和外毛细胞。在内毛细胞中，静纤毛比外毛细胞中的更长且更粗4。在小鼠或大鼠的内毛细胞中，第一排和第二排静纤毛的直径为300–500 nm。由于光的衍射效应，无标记光学显微镜所能达到的最大分辨率约为200 nm。因此，利用光学显微镜相对容易观察到内毛细胞束中第一排和第二排的单个静纤毛 。相比之下，内毛细胞中较短排的静纤毛以及外毛细胞中的所有静纤毛直径约为100–200 nm，无法通过光学显微镜进行观察5。尽管超分辨率成像技术近年来取得了进展，但这一基本限制在任何无标记光学成像中仍然存在。目前所有 commercially available 的超分辨率技术均需要使用某种类型的荧光分子
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方案
本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。所有动物实验程序均经肯塔基大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 00903M2005）。
1. 纳米移液管的制备与测试
- 在微移液管拉制仪中创建程序，以制备电阻在 200 至 400 MΩ 之间的移液管，这对应于约 50–70 nm 的尖端内径。具体参数取决于所用的微移液管拉制仪。若需获得具有非柔性细尖的短移液管，请参考拉制仪的操作手册。
- 使用外径/内径为 1/0.58 mm 并带有内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管，以利于填充。移液管的长度至关重要，因为它决定了移液管横向机械共振的频率。移液管越长，共振频率越低，越难以避免该共振。
注意：操作者应尽量制造可被夹持器容纳的最短移液管。本实验中纳米移液管的长度通常为 15–25 mm（图 2A）。 - 用灌流液（Leibovitz's L-15 或添加了 20 mM D-葡萄糖以调节渗透压的 Hank's 平衡盐溶液 HBSS）将纳米移液管填充至其中点位置（图 2A）。为避免潜在的假象，应使用与记录时浴槽中相同的溶液。
- 使用 10 倍光学显微镜检查移液管尖端是否存在气泡（
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结果
本文所介绍的方案可用于可视化具有复杂拓扑结构的任何活细胞。按照这些步骤，我们常规获得了活体大鼠听觉毛细胞束的图像（图6B，D）。尽管与扫描电镜（SEM）图像相比，其X-Y方向分辨率较低，但我们的高分辨率离子电导显微镜（HPICM）图像仍能成功分辨出静纤毛的不同排布、静纤毛顶端的形态，甚至连接相邻静纤毛的细小连接结构（直径约5 nm）（图6F）。此外，HPICM图像具备SEM图像所缺乏的三维信息。由于该成像技术为非接触式，我们还能够对同一毛细胞束连续进行数小时（通常为5–6小时）的时间序列HPICM成像，而不会破坏细胞束的完整性（图7）。因此，HPICM在研究毛细胞束随时间发生的动态结构变化方面展现出巨大潜力。
尽管我们提供了移液器尺寸、当前设定点、低分辨率和高分辨率参数以及跳跃幅度的多个范围，但每位用户可能仍需略微优化其设置，以成功获得活体毛细胞束的高分辨率离子电导显微成.......
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讨论
为了获得成功的HPICM图像，用户需要建立一个低噪声、低振动的系统，并制备合适的移液管。我们强烈建议在尝试进行任何活细胞成像之前，使用原子力显微镜（AFM）校准标准品来测试系统的稳定性。在系统分辨率经过测试后，用户可先考虑对固定的耳蜗柯蒂氏器样本进行成像，以熟悉成像参数设置，然后再进行活细胞成像。
成像的最佳设定点因不同移液管而异，具体取决于其尖端的个体形状（在通过电子显微镜检查之前未知）以及尖端附着的污物量，后者同样不可预测。设定点高于0.7%的纳米移液管应予以弃用。
在活细胞成像过程中，细胞外溶液中的灰尘和碎屑会随时间逐渐增多。这些颗粒物可能最终聚集在移液管尖端，导致电流减小，从而无法继续扫描组织——图像将完全变白，因为反馈系统会"认为"纳米移液管始终处于样品附近。若发生这种情况，建议将移液管沿Z轴从该组织区域撤回。此操作可能清除"污染"。如果移液管仍然被污染，则必须更换移液管并转移到样品的另一区域，之后用户可继续扫描组织。
目前，高分.......
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致谢
我们感谢英国帝国理工学院的尤里·科尔切夫（Yuri Korchev）教授在本项目各个阶段提供的长期支持与指导。我们还感谢英国帝国理工学院的帕维尔·诺瓦克（Pavel Novak）博士和安德鲁·舍夫丘克（Andrew Shevchuk）博士，以及俄罗斯国家听力学研究中心的奥列格·贝洛夫（Oleg Belov），他们在软件开发方面提供了帮助。本研究得到了美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所/国立卫生研究院（NIDCD/NIH）的资助（项目编号：R01 DC008861 和 R01 DC014658，授予 G.I.F.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 模拟示波器 | B&K 精密 | 2160C | 用于实时监测纳米移液管电流和Z轴接近的模拟示波器 |
| 原子力显微镜校准标准品 | TED PELLA 公司 | HS-100MG；HS-20MG | 这些100纳米和20纳米的校准标准用于测试HPICM系统的性能 |
| 台式振动隔离器 | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | 主动振动隔离 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | 世界精密仪器公司（WPI） | 1B100F-4 | 用于纳米移液管的硼硅酸盐玻璃毛细管 |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | 用于调节浴液渗透压 |
| 数字化仪 | 国家仪器公司 | PCI-6221 | 多通道输入/输出数字化仪 |
| 用于Z轴运动的快速模拟比例-积分-微分（PID）控制 | 斯坦福研究系统 | SIM900，SIM960，SIM980 | 集成于外部PID控制器中的用于Z向移动的仪器模块。该系统需要快速响应，而这种响应速度通常未在商用压电放大器中实现。 |
| 法拉第笼 | AMETEK/TMC | II型 | 用于屏蔽电磁干扰 |
| 玻璃底培养皿 | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | 用作组织培养腔室的培养皿 |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) | Gibco，赛默飞世尔科技 | 14025092 | 细胞外（灌流）溶液 |
| 仪器放大器 | 布朗利精密仪器 | Model 440 | 仪器放大器提供所需的偏移、滤波以及二次放大或衰减 |
| 基于激光的微电极拉制仪 | Sutter Instrument | P-2000/G | 使用微电极拉制仪制备纳米移液管。制备尖锐的石英移液管需要使用激光。 |
| Lebovitz's L-15，不含酚红 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 21083027 | 细胞外（浴）溶液 |
| 显微操作仪 | Scientifica | PatchStar | 用于 "课程" Z轴压电驱动器的定位 |
| 显微镜 | 尼康 | Eclipse TS100 | 倒置光学显微镜 |
| 膜片钳放大器 | Molecular Devices | Axopatch 200B | 膜片钳放大器测量通过纳米移液管的电流 |
| 压电放大器（XY轴） | Physik Instrumente (PI) | E-500.00，E-505.00，E-509.C2A | XY压电平移台的放大与PID控制 |
| 压电放大器（Z轴） | Piezosystem jena | ENT 400 &和 800 | 由 ENT 400 电源和两台并联的 ENT 800 放大器组成的定制放大器，以实现最大 1.6 nA 的电流 |
| 塑料盖玻片 | TED PELLA 公司 | 26028 | 用于组织培养室的制备 |
| SICM 控制器 &和软件* | Ionscope，英国（ionscope.com） | N/A | 基于Innovative Integration Ltd公司的SBC6711数字信号处理板的定制控制器 |
| 硅酮弹性体（Sylgard） | 世界精密仪器公司（WPI） | SYLG184 | 用于将柔性玻璃纤维连接至组织腔室 |
| 硅胶 | 陶氏化学公司 | 734 | 用于粘合组织培养腔室的各个部件 |
| 钨棒 | A-M Systems | 717500 | 用于在组织腔室内固定牙线股 |
| XY压电纳米定位器 | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | 带有电容传感器的XY平移台 |
| Z轴压电纳米定位器 | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | 带应变片传感器的环形压电驱动器 |
| Ionscope 不再销售独立的 SICM 控制器。目前还有少数其他商用系统： NX12-Bio 和 NX10 SICM， | |||
| Park Systems，韩国；ICAPPIC Limited，英国（icappic.com）的SICM模块。所有这些系统均基于原始 | |||
| HPICM 原理。然而，对毛细胞中的静纤毛束进行成像需要若干技术上的定制改装 | |||
| 在封闭环境中具有挑战性（甚至不可能） “即用型” 系统，例如 Ionscope 或 NX12-Bio/NX10。目前仅有一种 | |||
| 模块化系统（ICAPPIC），具有灵活的配置，可适用于任何扫描离子电导显微镜（SICM）或高通量离子电导显微镜（HPICM）实验，但需要一定的组件集成。 |
参考文献
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J.
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