利用量子点标记的DNA和全内反射荧光显微镜，我们可以在使用未标记蛋白质的情况下研究限制性内切酶的反应机制。这种单分子技术能够大规模多重观测单个蛋白质-DNA相互作用，并可将数据汇总以生成具有充分统计量的停留时间分布。
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摘要
摘要
本研究建立了一种基于全内反射荧光显微镜的新型检测方法，可在单次实验中同时测量数百个单个限制性内切酶（REase）分子催化循环的持续时间。该检测方法无需对蛋白质进行标记，且仅需使用单一成像通道即可完成。此外，多个独立实验的结果可合并分析，以获得数据点丰富的停留时间分布。对所得停留时间分布的分析有助于揭示无法直接观察到的动力学步骤，从而阐明DNA切割机制。利用该方法对已被广泛研究的限制性内切酶EcoRV（一种二聚体IIP型限制性内切酶，可切割回文序列GAT↓ATC，其中↓表示切割位点）进行检测所获得的示例数据与先前研究结果一致。这些结果表明，在EcoRV结合DNA后，通过引入镁离子启动DNA切割过程的反应路径中至少包含三个步骤，每个步骤的平均速率为0.17 s-1。
引言
限制性内切核酸酶（REases）是一类能够在DNA中特异性序列位置引起双链断裂的酶。20世纪70年代限制性内切酶的发现推动了重组DNA技术的发展，如今这些酶已成为遗传修饰与操作中不可或缺的实验工具1。其中，II型限制性内切酶是该类酶中应用最广泛的一类，因其可在识别序列内部或附近特定位置切割DNA。然而，II型限制性内切酶之间存在显著差异，其分类主要依据特定的酶学特性，而非进化关系。在各个亚型中，分类体系常存在诸多例外情况，且许多酶可同时归属于多个亚型2。目前已鉴定出数千种II型限制性内切酶，其中数百种已实现商业化供应。
然而，尽管II型限制性内切酶具有多样性，但被深入研究的限制性内切酶却非常少。根据由理查德·罗伯茨爵士于1975年建立的限制性内切酶数据库REBASE3，目前仅有不到20种酶具有已发表的动力学数据。此外，虽然已有部分限制性内切酶在单分子水平上被直接观察到在扩散并沿DNA移动、直至遇到并结合其识别序列的过程4,5,6,7，但针对其切割反应动力学的单分子研究仍极为有限。现....
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方案
1. 一般信息
- 寡核苷酸设计
注意：60 个碱基对（bp）长的 DNA 底物由一对互补寡核苷酸组成，在 100 mM NaCl 条件下其双链熔解温度为 75 °C。- 订购一条在 5' 端带有单个生物素修饰、另一条在 5' 端带有硫醇修饰（含六碳间隔基）的寡核苷酸。将识别位点置于双链区域的中央。
注意：以下显示了用于 EcoRV 的寡核苷酸序列（识别位点以粗体标出）。
5' 生物素 - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
5' 硫醇 - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
- 订购一条在 5' 端带有单个生物素修饰、另一条在 5' 端带有硫醇修饰（含六碳间隔基）的寡核苷酸。将识别位点置于双链区域的中央。
- 所有步骤均使用电阻率为 18 MΩ·cm 的超纯水。
- 所有含量子点的溶液均需避光保存，以防光漂白。
- 本实验方案需使用压缩空气源完成。
2. 量子点标记的DNA底物材料的制备
注意：除上述寡核苷酸外，制备量子点标记的DNA....
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结果
流动池直接连接至倒置显微镜上一个高数值孔径的60倍油浸物镜，该显微镜配备激光光源，用于通过物镜进行全内反射荧光（TIRF）成像（图5A）。在引入DNA底物并洗去多余的DNA和量子点后，视野中通常存在数千个单独的量子点（图5B）。这些量子点稳定地附着在玻璃表面，在实验时间尺度内不会出现明显的荧光减弱或显著的漂白现象。然而，若将含有镁离子和适当限制性内切酶（REase）的缓冲液流经流动通道，在典型的四分钟观察期结束时，实验开始时存在的量子点中至少有30%会从视野中消失。为验证镁离子的必要性，当在无镁离子条件下将限制性内切酶流经通道时，实验结束时仍可观察到95%以上的初始量子点（图5C）。然而，若先在无镁离子条件下使限制性内切酶结合到固定于表面的DNA上，随后立即引入含镁离子的缓冲液，则在观察期结束时，最多可有半数量子点消失（图5D），该结果与同时流经限制性内切酶和镁离子时所观察到的现象相似。具体反应事件的.......
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讨论
本实验所用的DNA底物通过两步反应方案使用磺基-SMCC标记量子点。这种双功能交联剂包含一个可与伯胺反应的NHS酯基团和一个可与巯基反应的马来酰亚胺基团20。用于制备底物的巯基化寡核苷酸以氧化形式提供。在进行偶联反应前，必须按照所述方法对其进行还原和纯化，否则偶联反应效率会降低。DTT和磺基-SMCC溶液必须在使用前新鲜配制，因为这些分子在水溶液中会迅速水解。转移溶液进出透析装置时需格外小心——若移液器吸头接触膜，会导致膜破裂，造成样品丢失。建议连续完成第2节中的所有步骤，以避免样品损失。
用于生成量子点标记寡核苷酸的偶联反应效率较低。在将量子点标记的寡核苷酸与生物素化寡核苷酸混合并退火后，制备的底物样品中会存在过量未标记的DNA。尽管这些物质能够结合到功能化表面，但在推荐的成像条件下不可见，也不会对实验读数产生影响。为了验证完整结构的切割会导致量子点从表面释放，需按照方案第5节所述进行表面固定，并对表面的一个区域成像，以确定存在的量子点数量。随后，将800 µL含有10 U/mL DNase I的DNase缓冲液（2.5 mM Mg.......
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披露
作者无竞争性财务利益或其他利益冲突
致谢
本研究工作获得了美国国家普通医学科学研究所授予 CME 的 K12GM074869 项目资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家普通医学科学研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTS) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | 存放于干燥器中 |
| 5分钟环氧树脂胶 | Devcon | 20845 | 用于密封微流控装置 |
| 丙酮 | Pharmco | 329000ACS | 用于清洗盖玻片 |
| 超声波清洗仪 | Fisher Scientific | CPXH Model 2800 | 目录号 15-337-410 |
| 玻璃烧杯，100 mL | |||
| 台式离心机 | |||
| 生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（分子量 5,000） | Laysan Bio | BIO-SVA-5K | 琥珀酰亚胺戊酸酯的半衰期比琥珀酰亚胺碳酸酯更长 |
| 生物素化寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 定制——设计注意事项参见实验方案 | 要求进行5'端生物素修饰并采用HPLC纯化 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | VWR | 0903-5G | 配制10 mg/mL的水溶液，使用前加热至95 °C |
| Centri-Spin-10 尺寸排阻离心柱 | Princeton Separations | CS-100 或 CS-101 | 用于还原二硫键后纯化巯基化寡核苷酸 |
| 1.5 mL 离心管 | |||
| 1英寸方形玻璃盖玻片 | |||
| 盖玻片架 | |||
| 金刚石刻划轮 | Dremel | 7134 | 用于在石英流动池盖板上钻孔 |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Thermo Scientific | A39255 | 无需称量形式，每瓶7.7 mg |
| 台式钻床旋转工具工作台支架 | Dremel | 220-01 | 便于石英材料钻孔 |
| EcoRV（用于生成示例数据的限制性内切酶） | New England Biolabs | R0195T 或 R0195M | 使用100,000单位/mL的储备液以避免添加过量甘油；查阅REBASE获取其他限制性内切酶供应商信息 |
| 乙醇 | 多种品牌 | CAS 64-17-5 | 变性乙醇或95%乙醇均可，用于清洗盖玻片 |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Sigma Aldrich | EDS | BioUltra级，无水，存放于干燥器中 |
| Flea Micro Spinbar 搅拌子 | Fisherbrand | 14-513-65 | 尺寸为3 mm × 10 mm，可置于盖玻片架下方 |
| 荧光素 | Acros Organics | 17324 | 用于配制实验缓冲液 |
| 重力对流烘箱 | Binder | 9010-0131 | |
| 手持式多功能旋转工具 | Dremel | 8220 | 用于在石英流动池盖板上钻孔 |
| ImagEM X2 EM-CCD 相机 | Hamamatsu | C9100-23B | 本实验中空气冷却已足够，使用HCImage软件或类似软件进行控制 |
| 双面粘附成像垫片 | |||
| 带螺口盖的玻璃广口瓶（直径约50 mm，高约50 mm） | |||
| 六水合氯化镁 | Fisher Bioreagents | BP214-500 | 用于配制含镁的实验缓冲液 |
| MATLAB 软件 | 数据分析 | ||
| 金属镊子 | Fisher Brand | 16-100-110 | |
| 甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（分子量 5,000） | Laysan Bio | M-SVA-5K | 两种聚乙二醇应具有相同的NHS酯基团，以确保反应速率一致 |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| 多位置磁力搅拌器 | VWR | 12621-022 | |
| N-环己基-2-氨基乙磺酸 (CHES) | Acros Organics | AC20818 | CAS 103-47-9，用于配制CHES缓冲液 |
| 适用于微量离心管的轨道摇床及加热装置 | Q Instruments | 1808-0506 | 配备1808-1061适配器，适用于24 × 2.0 mL或15 × 0.5 mL离心管 |
| Parafilm封口膜 | |||
| PE60聚乙烯管（内径0.76 mm，外径1.22 mm） | Intramedic | 6258917 | 22 G钝头针与此管径匹配良好 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) 10x | Sigma Aldrich | P7059 | 使用时稀释至1x浓度 |
| 氢氧化钾 | VWR Chemicals BDH | BDH9262 | 使用1 M溶液清洗盖玻片 |
| Qdot 655 ITK 氨基（PEG）量子点 | Invitrogen | Q21521MP | |
| 石英载玻片，1英寸方形，厚度1 mm | Electron Microscopy Sciences | 72250-10 | 需在四角钻孔以便插入进样和出样管路 |
| 增强型塑料镊子 | Rubis | K35a | 用于操作盖玻片及组装微流控装置 |
| SecureSeal 粘附片 | Grace Biolabs | SA-S-1L | 裁剪后作为微流控装置的垫片 |
| 单通道微流控注射泵 | New Era Pump Systems | NE-1002X-US | 配备50 mL注射器和22 G钝头针 |
| Slide-a-Lyzer MINI 透析装置，10 kDa 截留分子量，0.1 mL | Thermo Scientific | 69570 或 69572 | 用于量子点与DNA偶联过程中的缓冲液置换 |
| 碳酸氢钠 | EMD Millipore | SX0320 | 用于配制表面功能化缓冲液；100 mM，pH 8 |
| 氯化钠 | Macron | 7581-12 | 用于配制实验缓冲液 |
| 磷酸氢二钠溶液（BioUltra级，水中0.5 M） | Sigma Aldrich | 94046 | 用于配制100 mM磷酸钠缓冲液 |
| 磷酸二氢钠溶液（BioUltra级，水中5 M） | Sigma Aldrich | 74092 | 用于调节100 mM磷酸钠缓冲液的pH值 |
| 链霉亲和素（来自 Streptomyces avidinii） | Sigma Aldrich | S4762 | 溶解至1 mg/mL，分装25 mL后于-20 ?保存 |
| 磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (sulfo-SMCC) | Thermo Scientific | A39268 | 无需称量形式，每瓶2 mg |
| 配备21 G钝头针的注射器 | |||
| 注射泵 | |||
| 巯基化寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 定制——设计注意事项参见实验方案 | 要求进行5'端硫醇修饰C6 S-S并采用HPLC纯化 |
| 配备488 nm激光照明的全内反射荧光（TIRF）成像系统 | 多种品牌 | 定制组装 | |
| Tris-HCl | Research Products International | T60050 | 用于配制实验缓冲液 |
| Tris碱 | JT Baker | 4101 | 用于配制实验缓冲液 |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | 用于配制封闭缓冲液 |
| 超纯水 | |||
| 涡旋混合器 | VWR | 10153-842 | |
| Wash-N-Dry 盖玻片架 | Electron Microscopy Sciences | 70366-16 | 用于盖玻片的表面功能化处理 |
参考文献
- Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).
- Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E.
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