本文介绍了一种利用遗传密码子扩展技术表达乙酰化组蛋白蛋白，并在体外组装重建核小体的方法。
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本文内容
摘要
摘要
乙酰化组蛋白蛋白可被高效表达于 大肠杆菌 编码一种突变体， Nε乙酰化赖氨酸（AcK）特异性 Methanosarcina mazi 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（MmAcKRS1）及其同源tRNA（tRNAPyl) 组装带有位点特异性乙酰化组蛋白的重建单核小体。MmAcKRS1 和 tRNAPyl 在翻译过程中将AcK递送至所选mRNA的琥珀突变位点 大肠杆菌该技术已广泛用于在组蛋白H3的赖氨酸位点引入乙酰赖氨酸（AcK）。吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PylRS）也可被快速改造以引入其他非天然氨基酸（ncAAs），实现蛋白质的位点特异性修饰或功能化。本文详细描述了一种利用MmAcKRS1系统将AcK引入组蛋白H3，并将乙酰化H3蛋白整合至重组单核小体的方法。所获得的乙酰化重组单核小体可用于生化与结合实验、结构解析等多种研究。获取修饰后的单核小体对于设计探索新相互作用及深入理解表观遗传机制的实验至关重要。
引言
我们利用PylRS和tRNAPyl合成并组装了含有位点特异性乙酰化组蛋白的重建单核小体。PylRS作为一种扩展遗传密码的工具，在产生带有翻译后修饰（PTMs）的蛋白质方面已被证明具有重要价值，并已通过基因进化实现了约200种不同非天然氨基酸（ncAAs）的掺入。PylRS在琥珀终止密码子处进行掺入，从而避免了翻译过程中其他氨基酸的竞争。PylRS最初发现于产甲烷古菌中，此后已在化学生物学中被用于将新颖的反应性化学基团引入蛋白质1,2。
MmAcKRS1 由 Methanosarcina mazei PylRS 进化而来，本实验室常用于合成乙酰化蛋白质3,4,5,6。MmAcKRS1 能在 Escherichia coli 翻译过程中将 AcK 插入目标 mRNA 的琥珀突变位点。该技术此前已被用于在组蛋白 H3 的 K4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、K56、K64 和 K79 赖氨酸位点引入 AcK，以研究 Sirtuin 1、2、6 和 7 在乙酰化单核小体上的活性4,5,6。本文详细描述了表达乙酰化组蛋白并重构乙酰化核小体的方法。
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方案
1. 质粒构建
- 首先确定需要乙酰化的组蛋白以及具体的赖氨酸位点。利用定点诱变技术，将目标位点突变为琥珀终止密码子（TAG）。
注意：已有四种预先设计好的质粒用于表达组蛋白。这四种组蛋白均被克隆至 pETDuet-1 载体中，并带有 N 端组氨酸标签。组蛋白 H4 还包含一个 SUMO 标签，复制起点为 colE1（拷贝数约为 40），具有氨苄青霉素抗性，并含有 T7 启动子。- 设计正向和反向引物，使其在四种组蛋白质粒之一的目标位点处包含 TAG 突变（将原有的赖氨酸密码子替换为琥珀终止密码子）。
- 使用全质粒 PCR 扩增含有 TAG 的质粒。确定引物的合适退火温度。通常，引物的熔解温度（Tm）减去 5 °C 即可满足要求。若在获得 PCR 产物时遇到困难，可在 Tm - 5 °C 附近设置温度梯度以优化扩增的退火温度。
注意：本实验中使用实验室自备的 PFU 聚合酶进行 30 个循环扩增，反应条件如下：94 °C 变性 30 s，退火温度下退火 30 s，72 °C 延伸 6 min（或每千碱基对延伸 1 min）。有关此类 PCR 方法的更多细节，请参见 Liu 和 Naismith7。 - 按照制造商说明书，使用 PCR 产物纯化试剂盒对 PCR 产物进行纯化。通过琼脂糖凝胶电泳及后续的溴化乙锭染色分析 PCR 产物。
- 将质粒与 T4 连接酶在 16 °C 下过夜孵育进行连接。
- 首先将含有 TAG 的质粒（AmpR）转化至化学感受态的 Escherichia coli 中。从转化平板中至少挑选 4 个单菌落，提取并纯化质粒。按照标准方法加入甘油制备菌种保存液，并于 -80 °C 保存。送测序以确认所需的 TAG 突变已成功引入。
- 测序确认无误后，将含有 TAG 的质粒（AmpR）与 pEVOL-AckRS（ChlR）共同转化至化学感受态的 CobB 缺失型 BL21 细胞中（CobB 是目前在 E. coli 中已知的唯一组蛋白赖氨酸去乙酰化酶），采用热激法进行转化。pEVOL 是一种具有中低拷贝数的质粒，其复制起点为 p15A。
注意：pEVOL 系列质粒的构建基于先前研究，结果表明提高正交 aaRS/tRNATyr 配对的表达水平可有效减少蛋白截短现象，并提高突变蛋白的整体产量8。若无法获得 CobB 缺失型细胞，可改用化学感受态 BL21 细胞。CobB 是一种 Sirtuin 类组蛋白赖氨酸去乙酰化酶，在表达组蛋白蛋白时可在培养基中添加终浓度为 5 mM 的烟酰胺以抑制 CobB 活性，作为替代方案9。 - 制备细胞保存液，并于 -80 °C 保存。
2. 乙酰化组蛋白蛋白表达
- 在培养瓶中准备1 L已灭菌的2YT培养基（或根据需要选择体积）。
- 在含有适当抗生素的20 mL 2YT培养基中接种共转化细胞储备液，该细胞含有带TAG的质粒（AmpR）和pEVOL-AckRS质粒（ChlR），于37 °C培养至OD = 0.6（4–6小时）。
- 向1 L已灭菌的2YT培养基中加入适当的抗生素，并接种20 mL的种子培养物。于37 °C培养至OD = 0.6–0.8（2–3小时）。
- 加入诱导剂和乙酰赖氨酸（AcK），使其终浓度分别为IPTG 1 mM、0.2%阿拉伯糖和AcK 5 mM。
- 将培养物在37 °C继续培养6–8小时。
- 在2,700 × g条件下离心15分钟，收集细胞沉淀。
- 将细胞沉淀于-80 °C保存过夜。
- 从本步骤开始，所有操作均需在冰上进行。每1 L培养物用50 mL组蛋白裂解缓冲液溶解细胞沉淀。
- 按以下程序进行超声处理：开启1秒，关闭1秒，总开启时间为3分钟，振幅60%。
- 在41,600 × g条件下离心45分钟，沉淀包涵体。
- 弃去上清液，将包涵体重悬于30 mL组蛋白裂解缓冲液中。在41,600 × g条件下离心30分钟，收集沉淀。
- 弃去上清液，将包涵体重悬于30 mL沉淀洗涤缓冲液中。在41,600 × g条件下离心30分钟，收集沉淀。
- 弃去上清液，将包涵体溶解于25 mL 6 M盐酸胍（GuHCl）缓冲液中。于37 °C振荡孵育1小时。
注：如有需要，可于4 °C振荡孵育过夜。 - 在41,600 × g条件下离心45分钟，收集沉淀。将上清液与1 mL已用6 M盐酸胍缓冲液平衡的Ni-NTA树脂在4 °C孵育2小时。
- 在变性条件下进行Ni-NTA纯化。用柱洗涤缓冲液洗涤柱体，体积为3个柱体积。用10 mL洗脱缓冲液洗脱乙酰化组蛋白蛋白。
注：此处可尝试浓缩蛋白，但乙酰化组蛋白性质极不稳定，容易沉淀。总体积不建议浓缩至2 mL以下。 - 将乙酰化组蛋白蛋白用5%乙酸缓冲液进行充分透析以去除盐分。每次透析3小时，于 4 °C进行，至少更换新鲜缓冲液6次。
注：为提高蛋白纯度，可选择使用纯水进行透析。但此操作会导致显著沉淀和产率下降，对于产率较低的乙酰化组蛋白蛋白可能不适用。 - 分装蛋白溶液，冻干后可长期保存于-80 °C。野生型组蛋白蛋白通常产率为10–50 mg/L，而乙酰化组蛋白蛋白产率低于10 mg/L，具体取决于赖氨酸修饰位点。例如，H3K79Ac平均产率为5 mg/L。
3. 野生型组蛋白表达
- 为组装完整的核小体，需表达全部4种组蛋白。在表达和纯化野生型组蛋白时，其方案与乙酰化组蛋白相同，但以下步骤除外：
- 不进行共转化。表达野生型组蛋白时不使用pEVOL-AcKRS质粒。根据需要调整抗生素种类。
- 在诱导细胞表达期间，不使用CobB基因缺失的细胞系，也不添加烟酰胺（Nicotinamide）、乙酰化赖氨酸（AcK）或阿拉伯糖（arabinose）。
4. 601 DNA 的制备
注意：先前设计的优化DNA序列可高效地与组蛋白八聚体组装，形成单核小体。该序列被称为601 DNA或Widom序列。此序列已成为体外核小体研究的标准DNA序列，广泛应用于从染色质重塑实验到单分子测量等多种研究中10。
- 为制备足量的601 DNA用于核小体组装，将pGEM-3z/601质粒转化至Top 10感受态细胞中，并培养10 mL菌液以进行质粒扩增与提取。使用质粒提取试剂盒，并按照制造商的说明操作。
- 本扩增实验建议使用实验室自表达的PFU聚合酶（效率更高）。配制PCR反应体系：对于250 µL反应体系，加入207.5 µL经高压灭菌的MQ H2O、25 µL 10x PFU Buffer、5 µL正向引物：ctggagaatcccggtgccg、5 µL反向引物：acaggatgtatatatctgacacg、5 µL dNTP混合物、2.5 µL PFU酶。 通常一次性运行60个反应，以获得足够的DNA用于后续组装。
- 若使用PFU聚合酶，退火温度设为52 °C，持续30秒，延伸时间也为30秒。若使用其他聚合酶，请遵循制造商推荐的反应条件。
- PCR完成后，选用合适的PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。
5. 组装组蛋白八聚体
- 将组蛋白H2A、H2B、H3和H4的蛋白沉淀物分别溶解，使每种组蛋白在GuHCl缓冲液中形成独立的储备液，总体积为100 µL。
- 通过测定A280吸光度计算每种组蛋白的浓度。
- 若任一种蛋白的吸光度大于1，则用GuHCl缓冲液稀释，以获得更准确的浓度。
- 按1:1摩尔比混合H2A和H2B蛋白，并稀释至总蛋白浓度为4 µg/µL。对H3和H4重复相同操作。
- 在4 °C下依次对样品进行透析：先在2 M TE缓冲液中过夜，再在1 M TE缓冲液中透析2小时，最后在0.5 M TE缓冲液中透析5小时。
注意：透析的第二步和第三步会导致蛋白不稳定构象而发生沉淀，此过程中出现大量沉淀是正常现象。 - 在4 °C下以16,800 x g离心去除沉淀。
- 再次通过测定A280吸光度，计算组蛋白二聚体（H2A/H2B混合物）和四聚体（H3/H4混合物）的浓度。
- 按1:1摩尔比混合二聚体和四聚体，并通过加入固体NaCl将NaCl浓度调整至2 M。
- 组蛋白八聚体可在4 °C下保存，其稳定性高于二聚体和四聚体。切勿冷冻组蛋白八聚体，以免引起解聚。
- 若使用乙酰化组蛋白进行组装，只需在操作中用乙酰化蛋白替代野生型蛋白即可。
6. 核小体组装
- 使用100倍浓度的TE缓冲液和固体NaCl将601 DNA调整至含有2 M NaCl的TE缓冲液中。按0.85:1至0.90:1的摩尔比，将溶于2 M TE缓冲液中的601 DNA加入组蛋白八聚体中。若凝胶迁移分析中存在游离DNA，可使用较低比例的DNA。
- 将DNA-组蛋白混合物转移至透析袋中，放入约200 mL的2 M TE缓冲液（若同时组装多个样品，则可使用更多缓冲液），并在4 °C下极其轻柔地搅拌。
- 设置蠕动泵以缓慢滴加无盐TE缓冲液。当体积大约增加一倍时，倒掉一半体积。总共至少重复此操作4次。使用泵时，整个过程可能需要4–8小时，具体时间取决于起始体积。当盐浓度降低至150 mM（通过盐度计测量）时，核小体开始形成。
- 当盐浓度降至150 mM后，更换为20 mM TE缓冲液透析过夜。
- 通过离心去除沉淀物，并使用酶标仪测定A260值以确定核小体的浓度。
- 加入His-TEV蛋白酶（TEV:核小体质量比为1:30），在4 °C下孵育 过夜，以切除所有组氨酸标签。使用Ni-NTA树脂下拉法从核小体溶液中去除组氨酸标签杂质。
- 为使核小体正确定位并使样品均一化，于60 °C孵育1小时。
注意：对于特别不稳定的乙酰化位点，此步骤可能不适用。 - 短期储存（数周）时，将核小体保存在4 °C。
- 长期储存时，将核小体对储存缓冲液进行透析后，于-80 °C保存。
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结果
二聚体、四聚体和八聚体可通过运行12% SDS-PAGE凝胶进行检测（图1 和 图2）。在此可以看出，一些乙酰化的四聚体产量低于其他四聚体（图1）。事实上，越接近核心区域，观察到的产量越低。这很可能是因为乙酰化作用干扰了四聚体在靠近核心区域处的组装。在八聚体组装后也观察到了类似的影响。图2）。将含有601 DNA序列的八聚体组装完成后，可通过1×TBE非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（5%）分离核小体，随后用溴化乙锭染色进行检测图3）。在TEV消化前，核小体条带位于约10 kb标记处。TEV消化后，核小体条带相对于DNA ladder向下移动。在热定位前，观察到的核小体条带非常宽，可能出现拖尾现象图4).
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讨论
在实验过程中，必须严格遵循本方案的每一个细节。核小体稳定性较差，该方案的确定经历了大量反复试验。关键是在每一步（或一旦观察到）都要去除沉淀物，因为颗粒物很容易干扰组装过程。组蛋白样品应始终置于冰上。如果核小体在4 °C下储存过久，可能会发生自发解离。若核小体在4 °C下储存超过2周，在用于任何实验前务必通过非变性PAGE检测样品状态。避免涡旋混匀八聚体和核小体，因为这也会导致其解离。如果在组装二聚体、四聚体或八聚体时遇到问题，通常表明蛋白质质量不佳。可通过15% SDS-PAGE检测蛋白质质量。若蛋白质纯度较低，一种可选方法是将蛋白质对纯水进行透析。这会导致大量沉淀并显著降低蛋白质得率，但可获得更纯的样品。每个组蛋白乙酰化位点的整合效率及核小体稳定性差异较大。通常情况下，乙酰化位点越靠近N端结构域，在组蛋白表达时的产量越低。就核小体稳定性而言，乙酰化位点越接近核小体核心或DNA结合位点，组装后的核小体越不稳定。如果遇到稳定性问题，必须始终将核小体样品置于冰上。可能需要省略60 °C的核小体定位步骤，因为该步骤可能导致解离或沉淀。乙酰化核小体的主要局限性在于其不稳定性。在较高温度（如37 °C）下进行实验时，可能导致核小体沉淀，因此可能无...
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披露
所有作者均无任何需要声明的竞争性经济利益。
致谢
我们感谢韦斯利·王博士为本方案奠定的基础工作及其宝贵的指导。 本研究部分得到了美国国立卫生研究院（资助号 R01GM127575 和 R01GM121584）和威尔奇基金会（资助号 A-1715）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M TE 缓冲液 | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE 缓冲液 | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE 缓冲液 | NA | NA | |
| 2 M TE 缓冲液 | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE 缓冲液 | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6 M 盐酸胍, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| 乙酰化赖氨酸 | |||
| 柱洗涤缓冲液 | NA | NA | 6 M 尿素, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM 咪唑, pH 7.8 |
| 洗脱缓冲液 | NA | NA | |
| Fisherbrand 可调流速化学转移泵 | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV 蛋白酶 | |||
| 组蛋白裂解缓冲液 | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF, pH 8.0 |
| Ni-NTA 树脂 | 6 M 尿素, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM 咪唑, pH 7.8 | ||
| PCR 纯化试剂盒 | Epoch Life Sciences | 2360050 | |
| 沉淀洗涤缓冲液 | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| 储存缓冲液 | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% 甘油, pH 7.8 |
| 热循环仪 |
参考文献
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