本文介绍了一种利用遗传密码子扩展技术表达乙酰化组蛋白蛋白，并在体外组装重建核小体的方法。
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本文内容
摘要
摘要
乙酰化组蛋白蛋白可被高效表达于 大肠杆菌 编码一种突变体， Nε乙酰化赖氨酸（AcK）特异性 Methanosarcina mazi 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（MmAcKRS1）及其同源tRNA（tRNAPyl) 组装带有位点特异性乙酰化组蛋白的重建单核小体。MmAcKRS1 和 tRNAPyl 在翻译过程中将AcK递送至所选mRNA的琥珀突变位点 大肠杆菌该技术已广泛用于在组蛋白H3的赖氨酸位点引入乙酰赖氨酸（AcK）。吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PylRS）也可被快速改造以引入其他非天然氨基酸（ncAAs），实现蛋白质的位点特异性修饰或功能化。本文详细描述了一种利用MmAcKRS1系统将AcK引入组蛋白H3，并将乙酰化H3蛋白整合至重组单核小体的方法。所获得的乙酰化重组单核小体可用于生化与结合实验、结构解析等多种研究。获取修饰后的单核小体对于设计探索新相互作用及深入理解表观遗传机制的实验至关重要。
引言
我们利用PylRS和tRNAPyl合成并组装了含有位点特异性乙酰化组蛋白的重建单核小体。PylRS作为一种扩展遗传密码的工具，在产生带有翻译后修饰（PTMs）的蛋白质方面已被证明具有重要价值，并已通过基因进化实现了约200种不同非天然氨基酸（ncAAs）的掺入。PylRS在琥珀终止密码子处进行掺入，从而避免了翻译过程中其他氨基酸的竞争。PylRS最初发现于产甲烷古菌中，此后已在化学生物学中被用于将新颖的反应性化学基团引入蛋白质1,2。
MmAcKRS1 由 Methanosarcina mazei PylRS 进化而来，本实验室常用于合成乙酰化蛋白质3,4,5,6。MmAcKRS1 能在 Escherichia coli 翻译过程中将 AcK 插入目标 mRNA 的琥珀突变位点。该技术此前已被用于在组蛋白 H3 的 K4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、K56、K64 和 K79 赖氨酸位点引入 AcK，以研究 Sirtuin 1、2、....
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方案
1. 质粒构建
- 首先确定需要乙酰化的组蛋白以及具体的赖氨酸位点。利用定点诱变技术，将目标位点突变为琥珀终止密码子（TAG）。
注意：已有四种预先设计好的质粒用于表达组蛋白。这四种组蛋白均被克隆至 pETDuet-1 载体中，并带有 N 端组氨酸标签。组蛋白 H4 还包含一个 SUMO 标签，复制起点为 colE1（拷贝数约为 40），具有氨苄青霉素抗性，并含有 T7 启动子。- 设计正向和反向引物，使其在四种组蛋白质粒之一的目标位点处包含 TAG 突变（将原有的赖氨酸密码子替换为琥珀终止密码子）。
- 使用全质粒 PCR 扩增含有 TAG 的质粒。确定引物的合适退火温度。通常，引物的熔解温度（Tm）减去 5 °C 即可满足要求。若在获得 PCR 产物时遇到困难，可在 Tm - 5 °C 附近设置温度梯度以优化扩增的退火温度。
注意：本实验中使用实验室自备的 PFU 聚合酶进行 30 个循环扩增，反应条件如下：94 °C 变性 30 s，退火温度下退火 30 s，72 °C 延伸 6 min（或每千碱基对延伸 1 min）。有关此类 PCR 方法的更多细节，请参见 Liu 和 Naismith7。 - 按照制造商说明书，使用 PCR 产物纯化试剂盒对 PCR 产物进行纯化。通过琼脂糖凝胶电泳....
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结果
二聚体、四聚体和八聚体可通过运行12% SDS-PAGE凝胶进行检测（图1 和 图2）。在此可以看出，一些乙酰化的四聚体产量低于其他四聚体（图1）。事实上，越接近核心区域，观察到的产量越低。这很可能是因为乙酰化作用干扰了四聚体在靠近核心区域处的组装。在八聚体组装后也观察到了类似的影响。图2）。将含有601 DNA序列的八聚体组装完成后，可通过1×TBE非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（5%）分离核小体，随后用溴化乙锭染色进行检测图3）。在TEV消化前，核小体条带位于约10 kb标记处。TEV消化后，核小体条带相对于DNA ladder向下移动。在热定位前，观察到的核小体条带非常宽，可能出现拖尾现象图4).
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讨论
在实验过程中，必须严格遵循本方案的每一个细节。核小体稳定性较差，该方案的确定经历了大量反复试验。关键是在每一步（或一旦观察到）都要去除沉淀物，因为颗粒物很容易干扰组装过程。组蛋白样品应始终置于冰上。如果核小体在4 °C下储存过久，可能会发生自发解离。若核小体在4 °C下储存超过2周，在用于任何实验前务必通过非变性PAGE检测样品状态。避免涡旋混匀八聚体和核小体，因为这也会导致其解离。如果在组装二聚体、四聚体或八聚体时遇到问题，通常表明蛋白质质量不佳。可通过15% SDS-PAGE检测蛋白质质量。若蛋白质纯度较低，一种可选方法是将蛋白质对纯水进行透析。这会导致大量沉淀并显著降低蛋白质得率，但可获得更纯的样品。每个组蛋白乙酰化位点的整合效率及核小体稳定性差异较大。通常情况下，乙酰化位点越靠近N端结构域，在组蛋白表达时的产量越低。就核小体稳定性而言，乙酰化位点越接近核小体核心或DNA结合位点，组装后的核小体越不稳定。如果遇到稳定性问题，必须始终将核小体样品置于冰上。可能需要省略60 °C的核小体定位步骤，因为该步骤可能导致解离或沉淀。乙酰化核小体的主要局限性在于其不稳定性。在较高温度（如37 °C）下进行实验时，可能导致核小体沉淀，因此可能无.......
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披露
所有作者均无任何需要声明的竞争性经济利益。
致谢
我们感谢韦斯利·王博士为本方案奠定的基础工作及其宝贵的指导。 本研究部分得到了美国国立卫生研究院（资助号 R01GM127575 和 R01GM121584）和威尔奇基金会（资助号 A-1715）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M TE 缓冲液 | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE 缓冲液 | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE 缓冲液 | NA | NA | |
| 2 M TE 缓冲液 | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE 缓冲液 | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6 M 盐酸胍, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| 乙酰化赖氨酸 | |||
| 柱洗涤缓冲液 | NA | NA | 6 M 尿素, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM 咪唑, pH 7.8 |
| 洗脱缓冲液 | NA | NA | |
| Fisherbrand 可调流速化学转移泵 | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV 蛋白酶 | |||
| 组蛋白裂解缓冲液 | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF, pH 8.0 |
| Ni-NTA 树脂 | 6 M 尿素, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM 咪唑, pH 7.8 | ||
| PCR 纯化试剂盒 | Epoch Life Sciences | 2360050 | |
| 沉淀洗涤缓冲液 | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| 储存缓冲液 | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% 甘油, pH 7.8 |
| 热循环仪 |
参考文献
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA syntheta....
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重印与许可
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