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斑马鱼早期生命阶段中荧光微塑料的累积与分布

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DOI：

10.3791/62117

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2021年7月4日

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1College of Environment, Zhejiang University of Technology

本文内容

摘要

斑马鱼胚胎/幼鱼在体外发育，且具有光学透明性。利用荧光标记的微珠可方便地评估微塑料在鱼类早期生命阶段的生物累积情况。

摘要

作为一种新型环境污染物，微塑料已在水生环境中被广泛发现，并对水生生物构成严重威胁。微塑料的生物累积在其毒性效应中起关键作用；然而，由于微塑料属于颗粒物，其生物累积方式与许多其他污染物有所不同。本文介绍了一种利用荧光标记微塑料直观测定微塑料在斑马鱼胚胎或幼鱼中累积与分布的可行方法。将胚胎暴露于不同浓度（0.1、1 和 10 mg/L）的直径为 500 nm 的荧光微塑料中，持续 120 小时。结果显示，微塑料可在斑马鱼胚胎/幼鱼体内以浓度依赖的方式发生生物累积。在孵化前，强荧光信号主要出现在胚胎的卵膜周围；而在斑马鱼幼鱼中，卵黄囊、心包腔和胃肠道是微塑料主要的累积部位。该结果证实了微塑料在斑马鱼早期生命阶段的摄取和内化过程，将为深入理解微塑料对水生动物的影响提供依据。

引言

自20世纪首次合成以来，塑料已广泛应用于各个领域，导致全球产量迅速增长1。2018年，全球塑料产量约为3.6亿吨2。自然环境中的塑料会因化学、物理或生物过程降解为细小颗粒3。通常，粒径小于<5 mm的塑料颗粒被定义为微塑料4。微塑料也可为特定用途而人工制造，例如来自化妆品的微珠5。作为近乎永久性的污染物，微塑料在环境中不断累积，已引起科学家、政策制定者和公众日益增多的关注1,6。先前的研究表明，微塑料可能对鱼类造成多种不良影响，如胃肠道损伤7、神经毒性8、内分泌干扰9、氧化应激10和DNA损伤11。然而，微塑料的毒性至今尚未被充分揭示12,13。

斑马鱼胚胎具有多种实验优势，包括个体小、体外受精、光学透明以及产卵量大，被认为是研究污染物对鱼类早期生命阶段影响的理想模式生物。此外，评估生物学反应所需的测试物质用量极少。本实验中，将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的微塑料（0.1、1、10 mg/L）中持续5天，评估微塑料在斑马鱼胚胎/幼鱼体内的生物累积及其分布情况。该结果将增进我们对微塑料对鱼类毒性的理解，且本文所述方法有望推广应用于其他类型荧光材料在斑马鱼早期生命阶段中累积与分布的测定。

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方案

成年斑马鱼来源于中国斑马鱼资源中心（中国武汉）。实验严格遵循国家标准"实验动物福利伦理审查指南（GB/T35892-2018）进行。

1. 胚胎收集

  1. 将鱼类饲养在20 L的玻璃缸中，使用循环活性炭过滤的自来水系统（pH值为7.0 ± 0.2），温度保持恒定（28 ± 0.5 °C），光照周期为14小时光照:10小时黑暗。
  2. 每天喂食两次卤虫无节幼体（Artemia nauplii）。建议每日投喂量最多不超过鱼体重的3%，且每次投喂的食物应在5分钟内被完全摄食14。
  3. 在繁殖前一晚，将发育良好的成年斑马鱼（体长3–4 cm）以1条雄鱼配2条雌鱼的比例转移至产卵缸中。
    注意：次日清晨，光照周期开始后，鱼类即开始产卵。
  4. 使用巴斯德移液管收集卵子。用10% Hank's溶液多次冲洗后，在显微镜下检查受精情况。受精卵在受精后约2小时（hpf）进入卵裂期，可被清晰识别15。
  5. 将受精胚胎置于含有200 mL 10% Hank's溶液和1%亚甲蓝（用于消毒）的500 mL烧杯中，在28 °C条件下孵育。胚胎密度不得超过1个胚胎/2 mL溶液。
    注意：10% Hank's溶液的成分为137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na2HPO4、0.44 mM KH2PO4、1.3 mM CaCl2、1.0 mM MgSO4和4.2 mM NaHCO3。

2. 微塑料悬浮液的制备

  1. 将绿色荧光标记的聚苯乙烯微球储备液（10 mg/mL，标称直径为 500 nm，激发/发射波长：460/500 nm）超声处理 10 分钟。
  2. 用 10% Hank's 溶液稀释储备液，配制所需浓度的暴露溶液（0.1、1 和 10 mg/L）。
  3. 始终在暴露前现配微塑料的暴露溶液。
    ​注意：评估微塑料的毒性效应时应格外谨慎，因为市售微球制剂中可能含有如叠氮化钠等防腐剂，这些物质对不同生物体具有毒性16。因此，在开展毒性实验前，应在对照组中去除或校正这些添加剂的影响。

3. 微塑料暴露

  1. 随机选取6个新受精的胚胎（4 hpf），然后分别转移至6孔板的每个孔中，每孔含有5 mL不同浓度的微塑料溶液。设置含有10% Hank's溶液的对照组。
    1. 每种处理设置三个重复孔（共18个胚胎）。
  2. 将胚胎在与成体相同光照：黑暗循环和温度条件下培养（见1.2），每12小时观察一次。及时移除死亡个体。
  3. 每24小时更换90%的微塑料溶液。暴露期间不喂食鱼类。
    注：通常胚胎在48 hpf开始孵化，约72 hpf完成孵化。

4. 微塑料分布的评估

  1. 在受精后24、48、72、96和120小时，从三个重复组中随机选取胚胎/幼鱼（每组各取一个），并用10% Hank's溶液冲洗。
  2. 将幼鱼转移至培养皿中，并用0.016%三卡因进行麻醉。
    1. 配制三卡因储备液：将4 mg三卡因粉末溶于100 mL双蒸水中，用Tris-HCl（pH 9.0）调节pH至7.0。将储备液保存于冷冻室。
    2. 配制工作液：在室温下用10% Hank's溶液将储备液稀释至所需浓度（0.016%）14。
  3. 将胚胎/幼鱼排列整齐，准备观察。
  4. 使用荧光显微镜观察鱼类，并通过成像软件采集图像。
  5. 使用ImageJ软件定量分析鱼类的荧光强度。

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结果

荧光微塑料的分布与累积情况如图1和表1所示。未暴露组（对照组）中未观察到可见荧光。然而，在暴露于不同浓度微塑料后（24 hpf），在卵膜周围发现荧光累积。在幼体中也检测到绿色荧光，且荧光水平呈浓度和时间依赖性增加。卵黄囊、心包腔和胃肠道是微塑料主要的累积部位（图2）。

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图 1： 荧光标记的聚苯乙烯微塑料在斑马鱼胚胎/幼鱼中的分布（40×）。 鱼类样本来自对照组或暴露于500 nm微塑料浓度分别为0.1、1和10 mg/L的实验组。 比例尺：100 µm

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讨论

根据《用于科学目的动物保护指南》（如欧盟指令 2010/63/EU）的规定，在斑马鱼发育至能够独立摄食的阶段（受精后 5 天）之前，其早期生命阶段的实验无需强制获得动物伦理许可17。然而，为优化斑马鱼的使用，良好的福利实践至关重要，例如应关注人道的麻醉和安乐死方法。本实验采用乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（MS-222 或 tricaine），该试剂为大多数实验室常规使用的麻醉与安乐死试剂。

在显微镜观察前，应冲洗胚胎和幼虫，因为吸附在体表的微塑料可能干扰实验结果。此外，胚胎/幼虫自身的自发荧光，尤其是卵黄囊周围偶尔报道出现的自发荧光，也可能带来问题。许多生物大分子（如黄素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、芳香族氨基酸、脂褐素、晚期糖基化终末产物和胶原）在适当波长激发下会发出荧光。

需要注意的是，作为颗粒污染物，微塑料的尺寸被认为是其生物可利用性和毒性的决定因素之一18。本实验所用微塑料的标称直径为 500 nm，与斑马鱼胚胎卵膜的孔...

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披露

作者声明不存在竞争性或经济利益。

致谢

本工作由国家自然科学基金（21777145，22076170）和长江学者及创新研究团队项目（IRT_17R97）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
荧光显微镜Nikon, JapanEclipse Ti-S
绿色荧光标记的聚苯乙烯微球Phosphorex, USA2103A
三卡因Sigma-Aldrich, USAA5040

参考文献

  1. SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
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