斑马鱼早期生命阶段中荧光微塑料的累积与分布

摘要

斑马鱼胚胎/幼鱼在体外发育，且具有光学透明性。利用荧光标记的微珠可方便地评估微塑料在鱼类早期生命阶段的生物累积情况。

摘要

作为一种新型环境污染物，微塑料已在水生环境中被广泛发现，并对水生生物构成严重威胁。微塑料的生物累积在其毒性效应中起关键作用；然而，由于微塑料属于颗粒物，其生物累积方式与许多其他污染物有所不同。本文介绍了一种利用荧光标记微塑料直观测定微塑料在斑马鱼胚胎或幼鱼中累积与分布的可行方法。将胚胎暴露于不同浓度（0.1、1 和 10 mg/L）的直径为 500 nm 的荧光微塑料中，持续 120 小时。结果显示，微塑料可在斑马鱼胚胎/幼鱼体内以浓度依赖的方式发生生物累积。在孵化前，强荧光信号主要出现在胚胎的卵膜周围；而在斑马鱼幼鱼中，卵黄囊、心包腔和胃肠道是微塑料主要的累积部位。该结果证实了微塑料在斑马鱼早期生命阶段的摄取和内化过程，将为深入理解微塑料对水生动物的影响提供依据。

引言

自20世纪首次合成以来，塑料已广泛应用于各个领域，导致全球产量迅速增长¹。2018年，全球塑料产量约为3.6亿吨²。自然环境中的塑料会因化学、物理或生物过程降解为细小颗粒³。通常，粒径小于<5 mm的塑料颗粒被定义为微塑料⁴。微塑料也可为特定用途而人工制造，例如来自化妆品的微珠⁵。作为近乎永久性的污染物，微塑料在环境中不断累积，已引起科学家、政策制定者和公众日益增多的关注^1,6。先前的研究表明，微塑料可能对鱼类造成多种不良影响，如胃肠道损伤⁷、神经毒性⁸、内分泌干扰⁹、氧化应激¹⁰和DNA损伤¹¹。然而，微塑料的毒性至今尚未被充分揭示^12,13。

斑马鱼胚胎具有多种实验优势....

方案

成年斑马鱼来源于中国斑马鱼资源中心（中国武汉）。实验严格遵循国家标准"实验动物福利伦理审查指南（GB/T35892-2018）进行。

1. 胚胎收集

1. 将鱼类饲养在20 L的玻璃缸中，使用循环活性炭过滤的自来水系统（pH值为7.0 ± 0.2），温度保持恒定（28 ± 0.5 °C），光照周期为14小时光照:10小时黑暗。
2. 每天喂食两次卤虫无节幼体（Artemia nauplii）。建议每日投喂量最多不超过鱼体重的3%，且每次投喂的食物应在5分钟内被完全摄食¹⁴。
3. 在繁殖前一晚，将发育良好的成年斑马鱼（体长3–4 cm）以1条雄鱼配2条雌鱼的比例转移至产卵缸中。
   注意：次日清晨，光照周期开始后，鱼类即开始产卵。
4. 使用巴斯德移液管收集卵子。用10% Hank's溶液多次冲洗后，在显微镜下检查受精情况。受精卵在受精后约2小时（hpf）进入卵裂期，可被清晰识别¹⁵。
5. 将受精胚胎置于含有200 mL 10% Hank's溶液和1%亚甲蓝（用于消毒）的500 mL烧杯中，在28 °C条件下孵育。胚胎密度不得超过1个胚胎/2 mL溶液。
   注意：10% Hank's溶液的成分为137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na....

结果

荧光微塑料的分布与蓄积情况如图1和表1所示。未暴露组（对照组）中未观察到可见荧光。然而，在暴露于不同浓度微塑料后（24 hpf），在卵膜周围可见荧光蓄积。幼鱼体内亦检测到绿色荧光，且荧光强度呈浓度和时间依赖性增加。卵黄囊、心包腔和胃肠道是微塑料主要的蓄积部位（图2）。

图1：荧光标记的聚苯乙烯微塑料在斑马鱼胚胎/幼鱼体内的分布情况（40×）。 鱼类样本来自对照组或.......

讨论

根据《用于科学目的动物保护指南》（如欧盟指令 2010/63/EU）的规定，在斑马鱼发育至能够独立摄食的阶段（受精后 5 天）之前，其早期生命阶段的实验无需强制获得动物伦理许可¹⁷。然而，为优化斑马鱼的使用，良好的福利实践至关重要，例如应关注人道的麻醉和安乐死方法。本实验采用乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（MS-222 或 tricaine），该试剂为大多数实验室常规使用的麻醉与安乐死试剂。

在显微镜观察前，应冲洗胚胎和幼虫，因为吸附在体表的微塑料可能干扰实验结果。此外，胚胎/幼虫自身的自发荧光，尤其是卵黄囊周围偶尔报道出现的自发荧光，也可能带来问题。许多生物大分子（如黄素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、芳香族氨基酸、脂褐素、晚期糖基化终末产物和胶原）在适当波长激发下会发出荧光。

需要注意的是，作为颗粒污染物，微塑料的尺寸被认为是其生物可利用性和毒性的决定因素之一¹⁸。本实验所用微塑料的标称直径为 500 nm，与斑马鱼胚胎卵膜的孔.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光显微镜	Nikon, Japan	Eclipse Ti-S
绿色荧光标记的聚苯乙烯微球	Phosphorex, USA	2103A
三卡因	Sigma-Aldrich, USA	A5040