方法文章

完整组织染色、可视化及味蕾分析：菌状乳头、轮廓乳头与腭部味蕾

DOI：

10.3791/62126

⸱

2021年2月11日

 , 
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

本文内容

摘要

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本文介绍了对轮廓乳头、叶状乳头和腭部味蕾进行组织制备、染色及分析的方法，这些方法能够稳定地获得完整且结构完好的全器官味蕾（包括支配味蕾的神经纤维），并维持味蕾内部各结构之间以及味蕾与周围乳头组织之间的空间关系。

摘要

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味蕾是由一系列特化的味觉转导细胞组成的结构，专门用于检测口腔内特定类别的化学刺激。这些转导细胞与神经纤维相连接，将信息传递至大脑。由于味觉转导细胞在整个成年期持续死亡并被更新，味蕾所处的微环境既复杂又动态，因此需要对其中的细胞类型、空间定位以及细胞间的物理关系进行细致分析。然而，舌组织的高度异质性和致密性严重限制了抗体的渗透，使得此类分析受到制约。这些技术障碍迫使研究者采用切片方法，导致味蕾被分割在不同切片中，从而使测量结果仅为近似值，且细胞间的空间关系丢失。为克服上述挑战，本文所述方法包括从三个味觉区域——菌状乳头、轮廓乳头和腭部——完整采集、成像并分析整个味蕾及单个终末树突结构。完整采集味蕾可减少偏差和技术变异性，可用于精确报告多种特征的绝对数值，包括味蕾体积、味蕾总支配神经量、转导细胞数量以及单个终末树突的形态学特征。为展示该方法的优势，本文利用通用的味蕾标记物及全味觉纤维标记物，比较了菌状乳头与轮廓乳头中味蕾及其神经支配的体积差异。此外，还提供了一种稀疏细胞遗传标记技术的工作流程，用于标记部分味觉神经元（同时标记特定亚群的味觉转导细胞）。该工作流程借助图像分析软件，分析单个味觉神经树突的结构、细胞类型的数量以及细胞之间的物理关系。上述方法共同构成了一种全新的组织制备与分析策略，可用于研究完整的味蕾结构及其支配神经树突的全部形态特征。

引言

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味蕾是由50至100个特化的上皮细胞组成的结构，能够结合存在于口腔中的特定化学味觉刺激物。通常认为，味觉转导细胞可分为不同类型1,2,3,4,5,6,7,8,9，最初分类依据为电子显微镜下的形态特征，之后这些类型被与分子标记物相关联。II型细胞表达磷脂酶C-β2（PLCβ2）2和瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员51，包括负责转导甜味、苦味和鲜味的细胞1,10。III型细胞表达碳酸酐酶4（Car4）11和突触小泡相关蛋白258，主....

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方案

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注意：所有动物的饲养和护理均遵循美国卫生与公共服务部发布的《实验动物人道护理和使用政策》以及《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》中的规定。Phox2b-Cre 小鼠（MMRRC 品系 034613-UCD，NP91Gsat/Mmcd）或 TrkBCreER 小鼠（Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg）与 tdTomato 报告基因小鼠（Ai14）进行杂交。AdvillinCreER47 与 Phox2b-flpo48 及 Ai65 小鼠进行杂交。对于 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）注射，EdU 的配制和剂量计算参照 Perea-Martinez 等人49 的方法进行。

1. 材料准备

  1. 溶液的配制
    1. 在搅拌器上，将5.244 g一水磷酸二氢钠和23.004 g磷酸氢二钠溶解于双蒸水（ddH2O）中。调节pH至7.4，并定容至1 L，得到0.2 M磷酸盐缓冲液（PB）。
    2. 在通风橱中，将多聚甲醛加入双蒸水（ddH2O）中，在搅拌器上加热并持续搅拌，直至溶液温度达到90 °C。逐滴加入4 M NaOH溶液以溶解多聚甲醛，然后使....

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结果

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利用抗dsRed和角蛋白-8（一种通用的味蕾标记物）抗体对舌上皮进行染色，可在Phox2b-Cre:tdTomato小鼠中同时标记完整的味蕾及其全部味蕾神经支配50,51（图3A）。从味蕾的孔部至基底部进行成像，获得了最高分辨率的x-y平面图像（图3A、B）。使用基于像素的成像程序中的轮廓功能，在每一张切片中标记出味蕾的外围边界（图3B），然后生成一个代表味蕾体积的表面（图3C）。仅在该表面范围内对与味蕾标记相关的荧光信号进行掩膜（或复制），从而创建一个新的通道，该通道仅包含此荧光信号，并消除了可能遮挡味蕾的乳头染色背景（图3D）。对味蕾内部的神经纤维荧光信号进行掩膜处理（

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讨论

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建立一种从口腔内三个味觉区域（菌状乳头、轮廓乳头和腭部）持续采集并染色完整味蕾的方法，显著改进了对味觉转导细胞的分析、新整合细胞的追踪、神经支配情况以及这些结构之间关系的研究。此外，该方法有助于定位潜在的次级神经元标志物，无论其位于标记细胞群内部或外部50。这一点尤为重要，因为味觉乳头同时还接受强烈的躯体感觉神经支配52,53，这可能导致部分味觉神经元也被标记。含有味蕾的乳头也可使用较低倍率进行成像，从而能够观察整个乳头及其味蕾的神经支配情况，并可独立分析穿透味蕾的神经纤维与周围神经纤维的分布。

皮肤中的躯体感觉神经末梢可根据其在毛囊周围的排列方式以及与其他上皮成分的关系进行区分；对味觉乳头进行类似的平行分析，可能获得相似的特征描述54,55。建立味蕾和乳头内部结构及其组成的正常基础，将为阐明外周味觉功.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢Kavisca Kuruparanantha在轮廓乳头味蕾组织染色及成像方面的贡献，Jennifer Xu在乳头神经支配染色与成像方面的工作，Kaytee Horn在动物饲养和基因分型方面的协助，以及Liqun Ma在软腭味蕾组织染色中的工作。本项目得到了R21 DC014857和R01 DC007176（资助对象：R.F.K.）以及F31 DC017660（资助对象：L.O.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2,2-三溴乙醇ACROS OrganicsAC421430100
2-甲基丁烷ACROS126470025
AffiniPure Fab 片段驴抗兔 IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure 驴抗大鼠 IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 软件 Media Cybernetics
钝头镊子Fine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU 细胞增殖检测试剂盒Molecular ProbesC10637遵循试剂盒说明书 
盖玻片Marienfeld107242
细胞角蛋白-8发育研究杂交瘤库 (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 上清液(1:50，4°C 保存)
解剖剪刀（粗齿）RobozRS-5619
解剖剪刀（细齿）MoriaMC19B
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
驴抗兔，Alexa Fluor® 555 标记ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab 片段牛抗山羊 IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
载玻片Fisher Scientific (Superfrost Plus 显微载玻片)12-550-15
山羊抗 Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane 基于像素的图像分析软件
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences基于三维矢量的图像分析软件
正常驴血清Jackson Immuno Research017-000-121
正常兔血清 Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(多氩离子激光器，波长为 458、488、515，以及额外的 HeNe 激光器，发射波长为 543 和 633)
多聚甲醛EMDPX0055-30.1M 磷酸盐缓冲液中 4%
兔抗 dsRedLiving Colors DsRed 多克隆抗体；Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
兔抗 PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
无水磷酸氢二钠Fisher ScientificBP332-500
磷酸二氢钠Fisher ScientificBP330-500
叔戊醇Aldrich Chemical Company8.06193
组织包埋模具Electron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. 包埋剂Sakura4583
吐温 X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 兔 IgG 标记试剂盒ThermoFisher ScientificZ25305遵循试剂盒说明书 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7(2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C.

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