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方法文章

一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法

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⸱

DOI：

10.3791/62127

⸱

2021年8月11日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方法介绍了一种利用急性脑切片检测内源性单胺类物质释放的简单技术。该实验装置采用一个48孔板，其中包含用于单胺释放的组织固定装置。释放的单胺类物质通过高效液相色谱法（HPLC）结合电化学检测进行分析。此外，该技术还可作为药物发现的筛选方法。

摘要

单胺类神经递质与多种神经及精神疾病相关。此类疾病的动物模型已显示出单胺类神经递质释放和摄取动态的改变。研究单胺类神经递质功能需要采用电生理学、快速扫描循环伏安法（FSCV）、成像、活体 微透析、光遗传学或放射性标记等技术复杂的方法。本文介绍的方法是一种优化的两步法，用于在急性脑切片中检测单胺类神经递质的释放，该方法使用含有组织固定装置的48孔板来孵育脑组织以检测单胺释放，并结合高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）对释放的单胺进行定量分析。简言之，使用组织切片机或振动切片机制备包含感兴趣脑区（如前额叶皮层、海马和背侧纹状体）的大鼠脑切片。将这些感兴趣脑区从全脑中分离后，置于充氧的生理缓冲液中孵育。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验在整个实验过程中评估组织活性。将新鲜分离的脑组织置于不同药物条件下孵育，这些药物可通过转运体诱导单胺释放（如苯丙胺）或通过激活胞吐性囊泡释放（如KCl）。孵育结束后，收集上清液中的释放产物，并通过HPLC-ECD系统进行分析。本方法可检测急性脑切片中的基础单胺释放水平。所得数据支持既往的体内和体外研究结果，表明苯丙胺（AMPH）和KCl可诱导单胺释放。该方法特别适用于研究与单胺转运体依赖性释放相关的机制，并为快速、低成本地筛选影响单胺释放的化合物提供了有效途径。

引言

多种神经和精神疾病与单胺类神经递质（多巴胺 [DA]、5-羟色胺 [5-HT]、去甲肾上腺素 [NE]）稳态的失调或维持不足相关1,2,3。这些疾病包括但不限于抑郁症1,2、精神分裂症2、焦虑症2、成瘾4、更年期5,6,7、疼痛8以及帕金森病3。例如，多种大鼠更年期模型表明，海马、前额叶皮层和纹状体中单胺类神经递质的失调或减少可能与更年期女性所表现出的抑郁症状和认知功能下降有关。在这些模型中，单胺类神经递质的失调已通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）进行了广泛研究，但这些研究并未区分所测得的神经递质含量与神经递质释放量5,6,7。传统上，单胺类神经递质通过依赖Ca2+的囊泡释放机制进入细胞外空间9，并通过各自的质膜重摄取系统（多巴胺转运体 DAT；5-羟色胺转运体 SERT；去甲肾上腺素转运体 NET）被回收10,11。然而，有研究数据表明，这些转运体也能够介导单胺类神经递质的释放或外排，因为已知滥用药物如苯丙胺（AMPH）和3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）可分别通过其转运体系统促使DA和5-HT释放12,13,14,15,16,17。因此，深入理解单胺类神经递质释放的动力学机制，对于开发特异且靶向的药物治疗策略至关重要。

已采用多种技术研究单胺类物质的释放，例如快速扫描循环伏安法（FSCV）18、活体 微透析13、成像技术19、放射性标记单胺预孵育20、光遗传学，以及近年来发展的基因编码荧光传感器与光度法21,22。FSCV 和活体微透析是研究单胺释放的主要技术。FSCV 主要用于在急性脑片和活体条件下研究刺激引发的胞吐释放，尤其是多巴胺（DA）的释放23。 由于 FSCV 使用电极刺激或诱发释放，其神经递质释放的主要来源为依赖 Ca2+ 的囊泡释放18,24,25,26,27,28,29,30,31。活体 微透析结合高效液相色谱（HPLC）通过将探针置入目标脑区来测量细胞外神经递质水平的变化13,32。与 FSCV 类似，活体 微透析的一个主要局限在于难以确定神经递质释放的来源：是依赖 Ca2+ 的囊泡释放，还是依赖转运体的释放。值得注意的是，这两种方法均可直接测量单胺的释放。随着光遗传学技术的近期发展，研究已实现对 5-HT 和 DA 释放的高细胞类型特异性、快速检测21,22。然而，这些策略需要复杂且昂贵的技术与设备，并通过单胺与受体的结合间接测量单胺释放。此外，放射性标记的单胺也用于研究单胺动态变化。放射性标记的单胺可预先加载至多种模型系统中，例如过表达各类单胺转运体的异源细胞20,33,34,35,36,37,38,39,40、原代神经元20、突触体33,39,41,42以及急性脑片43,44。然而，放射性物质可能对实验操作者造成潜在危害，且氚标记的分析物可能无法真实再现内源性单胺的动态过程45,46。结合离线检测方法（如 HPLC-ECD）的灌流系统已可用于检测来自多种组织来源的单胺。本文所述方案提供了一种优化的、低成本、简便且精确的方法，利用急性脑片直接测量内源性基础状态及刺激诱导的单胺释放。

急性脑切片可用于验证机制性假设，主要因其能够保留体内解剖微环境，并维持突触的完整性47,48,49,50,51,52。在少数研究中，急性脑切片或切碎的脑组织曾与灌流技术联用，通过KCl刺激Ca2+介导的递质释放53,54,55,56。灌流系统对于推动领域内对神经递质释放机制（包括单胺类递质）的理解至关重要。然而，这些系统相对昂贵，可用于组织分析的腔室数量通常仅为4至12个。相比之下，本文所介绍的方法成本低廉，可同时检测48个组织样本，并可进一步优化以容纳多达96个组织样本。48孔板中的每个孔均含有使用滤膜将释放产物与组织分离的组织固定装置，释放的单胺类物质随后被收集并采用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）进行分析。重要的是，该方法可在给予调节单胺释放的药理学试剂处理后，同时测定来自前额叶皮层、海马和背侧纹状体等不同脑区的5-HT、DA和NE的释放水平。因此，研究者可利用这一低成本的多孔板系统，在增加检测样本数量的同时减少实验动物使用量，从而回答多个科学问题。

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方案

所有实验，包括动物操作和组织采集，均按照佛罗里达大学和纽约城市学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规定进行，并遵循批准的方案编号 201508873（UF）和 1071（CCNY）。有关试剂和缓冲液，请参见补充文件。

1. 制备急性大鼠脑切片

注意：本实验使用成年雄性大鼠（250–350 g）。然而，该实验体系也可适用于不同的发育阶段、雌性大鼠以及其他物种。若使用较小的动物（如小鼠），实验者可通过调整每个条件下的脑切片或脑组织 punches 数量来优化实验方案。灌注缓冲液将称为缓冲液1；外排缓冲液将称为缓冲液2。

  1. 按照补充文件中所述方法配制缓冲液1。将95%/5%（O2/CO2）混合气体通入缓冲液1中20分钟，以在冰上充分氧合。另取50 mL缓冲液1，置于小烧杯或培养皿中冰上预冷。该缓冲液用于保存急性分离的完整脑组织。
  2. 使用1%-2%异氟烷麻醉一只或两只成年大鼠（250-350 g），采用断头器断头后迅速取出脑组织。立即将脑组织放入步骤1.1中盛有冰冻氧合缓冲液1的容器中。
    注意：确保安全使用异氟烷和断头器。异氟烷应在通风橱内开启。
  3. 使用振动切片机或压缩切片机，从各目标脑区切取300 µm厚的冠状脑切片（图1）。切片过程中必须持续向缓冲液1中通氧。使用不锈钢刮勺，小心且迅速地将脑切片转移至盛有冰冻氧合缓冲液1的新培养皿中（图2）。
  4. 根据大鼠脑图谱57，使用玻璃载片（图1G）小心移动脑切片，进一步进行解剖分离（例如打孔或切割）。例如，根据背侧纹状体深色条纹状结构进行识别，根据海马靠近皮层的位置及其独特的螺旋结构进行定位。左右半脑可分别分离，作为对照组和实验组切片（图2G - H）。本实验中，背侧纹状体进一步被制成2 mm直径的组织圆片（图1G）。
  5. 使用剪去尖端的塑料移液管，将脑切片或组织圆片转移至浸没于通氧冰冻缓冲液1中的小型容器内。这些容器可为不锈钢网筛，或盛有缓冲液的小型培养皿（图1H）。

2. 脑切片或脑组织 punches 的离体自源性单胺释放

注意：本部分所用装置由一个48孔板和一个组织固定器组成，该固定器由六个未装内置滤膜的微量离心滤波单元连接至碳酰气管线构成（图2）。制作该固定器时，使用一根坚固的塑料棒（例如细胞刮棒），并将未装内置滤膜的微量离心滤波单元用强力胶粘附于其上，静置干燥1-2天。内源性单胺类物质释放实验所需时间，以及苯丙胺、氟西汀和可卡因的浓度均基于现有文献和先前的实验方案13,20,58。

  1. 组织激活
    1. 将步骤1.1.5中的脑组织转移至流出室的各个孔中，并在含0.5–1 mL充氧Buffer 2的载片加热器上于37 °C孵育30–50分钟，期间持续轻柔通气（图2B1）。
    2. 在此孵育期间，将药物稀释至实验所需浓度。所有药物均需溶解于Buffer 2中，浓度依据现有文献确定。
  2. 第一次孵育
    1. 将带有脑组织的组织支架转移至含有500 µL充氧Buffer 2的孔中，在37 °C下孵育20分钟。转移过程中，通过轻敲支架边缘以去除残留液体，确保带入的缓冲液体积最小或无残留。
    2. 在涉及药理学试剂（如单胺转运体抑制剂）的实验中，将组织样本与溶解于充氧Buffer 2中的药物共同孵育（例如，10 µM 氟西汀，40 µM 可卡因；见 图2B2）。每孔最终体积为500 µL。
  3. 第二次孵育
    1. 将带有组织的支架转移至一组新的孔中，每孔含总共500 µL的Buffer 2，可选择性加入所需浓度的药物。确保无过量缓冲液残留。每个孔代表一个实验条件下的n = 1。每个实验条件均设三重复。
    2. 一个孔中仅含充氧Buffer 2，另一个孔含10–30 µM AMPH，最后一个孔含10–30 µM AMPH及单胺转运体抑制剂。每种药物均溶解于充氧Buffer 2中。
    3. 在37 °C下用500 µL药物处理液孵育组织20分钟。
      ​注意：可额外设置包含高K+充氧Buffer 2（含或不含单胺转运体抑制剂）的孔。将每种药物溶解于500 µL充氧Buffer 2中。
    4. 在第二次20分钟孵育期间，收集步骤2.2.1中第一次孵育各孔的溶液，并转移至含有50 µL 1 N高氯酸或磷酸（根据HPLC类型而定，终浓度为0.1 N）的微量离心管中。样品终体积为550 µL。将微量离心管置于冰上，并标记为#1。
    5. 第二次20分钟孵育结束后，将带有脑切片或穿孔组织的支架转移至空孔中，并将整块板置于冰上。将上清液转移至含有50 µL 1 N高氯酸或磷酸的微量离心管中。样品终体积为550 µL。保持微量离心管在冰上，并标记为#2。
    6. 向每个含有组织的孔中加入1 mL冰浴Buffer 1。用小镊子收集全部组织，并转移至洁净的微量离心管中。
    7. 将含有脑组织的管置于-80 °C保存。弃去1 mL Buffer 1（图2B4）。
    8. 使用微量离心过滤管（0.22 µm）在2,500 × g 条件下离心2分钟，过滤各次孵育所得溶液。取滤液用于通过高效液相色谱-电化学检测法测定单胺含量（图2B5）。

3. 组织活性

  1. MTT 法检测
    ​注意：本实验设计的一个重要问题是组织的活性，因为组织可能需要使用数小时之久59。实验结束时采用 MTT 法60,61来评估组织活性。该方法基于活细胞中具有正常代谢活性的细胞可将黄色四唑盐 MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）还原为紫色甲臜结晶的原理。
    1. 实验结束后，单独保留一组组织样本，并将其分为两组。
    2. 将其中一组在 37 °C 条件下，用含 1% Triton X-100 的缓冲液 2 孵育 20 分钟作为对照（Triton X-100 处理可导致细胞死亡）；另一组仅置于缓冲液 2 中，不进行 Triton X-100 孵育（作为组织活性对照）。
    3. 向两组样本中加入 MTT（PBS 中 5 mg/mL 的储备液，pH 7.4），使其在通氧的缓冲液 2 中终浓度为 0.5 mg/mL。
    4. 将组织样本在 37 °C 孵育 20 分钟，用 PBS 洗涤后，转移至含有 250 µL 溶解液（含 SDS 10% w/v、DMF 25% v/v 和水）的微量离心管中，以溶解甲臜结晶。
    5. 将样本孵育 24 小时。
    6. 以 10,000 × g 离心 10 分钟，取上清液 200 µL，使用酶标仪在 562 nm 和 690 nm 处测定吸光度。组织活性按以下公式计算：(A562－A690) / 组织重量。

4. 单胺类物质的高效液相色谱分析

  1. 根据先前的方案13,44，使用反相色谱柱通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）定量测定每种实验条件下单胺类物质的释放量。
    1. 配制检测所需的流动相。该流动相包含100 mM磷酸、100 mM柠檬酸、0.1 mM EDTA-Na2、600 mg/L辛烷磺酸和8% v/v乙腈（最终pH为6.0）。流动相的组成取决于所使用的HPLC类型和色谱柱类型。
    2. 将电化学检测器（2 mm玻璃碳电极）的电位设定为0.46 V，并将流速设定为0.05 mL/min。
    3. 将每个样品（包括神经递质标准品）各取5 µL注入HPLC系统，进行自动进样和检测。每个样品的上样量取决于所使用的HPLC类型。
    4. HPLC运行结束后，使用配套的HPLC分析软件获取并分析色谱图数据。
    5. 利用由各单胺类物质（多巴胺：DA、去甲肾上腺素：NE和5-羟色胺：5-HT；图2C）组成的标准曲线分析单胺含量。根据制造商的指南，使用所得色谱图计算曲线下面积（AUC）。

5. 准备组织裂解液用于蛋白质定量

  1. 蛋白质测定
    1. 向含有脑组织切片/穿孔的每个微量离心管中加入预冷的裂解缓冲液及蛋白酶抑制剂（0.1 g/1 mL），使用研杵匀浆器进行匀浆。匀浆过程中必须将微量离心管置于冰上，以防止蛋白质降解。
    2. 将组织匀浆物在4 °C条件下轻度旋转孵育1小时。
    3. 在4 °C条件下以16,000 × g离心15分钟，收集上清液。
    4. 使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，测定上清液中的蛋白质浓度。
    5. 将每份脑组织样本中的单胺含量归一化为250 µL裂解脑组织中测得的总蛋白含量（µg）。使用以下公式计算每克蛋白质所含单胺的nmol数。df = 稀释倍数。

单胺定量公式，每克蛋白质分析中 nmol 的计算示意图。

6. 统计学分析

  1. 使用单因素方差分析（One-way ANOVA）对单胺释放量（nmol/g）进行分析，组间多重比较采用Sidak's多重比较检验。
  2. 使用非配对Student t 检验对独立组别（对照组 vs. 1% Triton X-100）的组织活力进行分析。
  3. 所有统计分析的显著性水平α均设定为≤ 0.05。

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结果

本技术描述了使用脑切片并通过基于48孔板内置组织支架的高效液相色谱-电化学检测法测定内源性单胺类物质释放的方法。实验装置如图1和图2所示。首先，为了确保实验结束时组织仍具有活性，进行了MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，一种四氮唑）检测。在完成功能实验后，急性脑切片仍保持代谢活性，其活性显著高于经1% Triton X-100孵育的切片（细胞死亡条件），表明其具有良好的存活状态（图3）。

对海马体和前额叶皮层脑切片进行急性、20分钟的AMPH处理，可显著提高每种单胺类神经递质的细胞外水平（图4A、B）。AMPH（30 µM）使海马体切片和前额叶皮层切...

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讨论

多年来，单胺类物质释放的检测已在多种系统中开展，包括异源细胞、神经元培养物、脑突触体、离体急性脑切片以及整体动物13,20,41,42,58,64,65,66,67,68。这些实验体系使神经科学领域得以探索基本的神经递质释放机制，进而可能发现针对单胺类物质参与的神经系统和精神疾病的新药理学靶点。尽管这些方法被广泛使用，但在内源性单胺释放的来源和/或释放量方面仍存在某些局限...

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致谢

本工作获得了Fondecyt启动基金N 11191049（授予J.A.P.）和美国国立卫生研究院（NIH）基金DA038598（授予G.E.T.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
48 孔板NANA检测
乙腈Fischer ScientificA998-1流动相
无水氯化钙Sigma AldrichC1016改良人工脑脊液或外排缓冲液
Clarity 软件Anetc
柠檬酸Sigma Aldrich流动相
D-(+)-葡萄糖Sigma1002608421解剖缓冲液
DMFSigma AldrichD4551MTT 检测
EDTA-Na2Sigma Aldrich流动相
GraphPad 软件Graphpad Software, Inc统计分析
甘油Sigma AldrichG5516裂解缓冲液
HEPESSigma AldrichH3375裂解缓冲液
HPLC，十级安培检测器AnetcHPLC，LC-EC 系统
HPLCAmuzaHPLC HTEC-510
L-抗坏血酸Sigma AldrichA5960解剖缓冲液
硫酸镁Sigma7487-88-9KH 缓冲液
微量离心过滤单元 UltraFreeMilliporeC7554检测 — 6 个适配于 48 孔板
MTTThermo FisherM6494MTT 检测
NanosepVWR29300-606检测；蛋白检测
辛烷磺酸Sigma AldrichV800010流动相
盐酸苯丙胺Sigma AldrichP8013改良人工脑脊液或外排缓冲液
磷酸Sigma Aldrich流动相
氯化钾Sigma12636KH 缓冲液
磷酸二氢钾Sigma1001655559KH 缓冲液
Precisonary VF-21-0ZPrecissonary组织切片压缩仪（Compresstome）
蛋白酶抑制剂混合物Sigma AldrichP2714裂解缓冲液
碳酸氢钠SigmaS5761解剖缓冲液
碳酸氢钠Sigma AldrichS5761解剖缓冲液
氯化钠SigmaS3014KH 缓冲液
十二烷基硫酸钠Sigma AldrichL3771裂解缓冲液
吐温 X-100Sigma AldrichT8787MTT 检测 / 裂解缓冲液

参考文献

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一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法
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