本方法介绍了一种利用急性脑切片检测内源性单胺类物质释放的简单技术。该实验装置采用一个48孔板，其中包含用于单胺释放的组织固定装置。释放的单胺类物质通过高效液相色谱法（HPLC）结合电化学检测进行分析。此外，该技术还可作为药物发现的筛选方法。
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方法文章
一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
单胺类神经递质与多种神经及精神疾病相关。此类疾病的动物模型已显示出单胺类神经递质释放和摄取动态的改变。研究单胺类神经递质功能需要采用电生理学、快速扫描循环伏安法（FSCV）、成像、活体 微透析、光遗传学或放射性标记等技术复杂的方法。本文介绍的方法是一种优化的两步法，用于在急性脑切片中检测单胺类神经递质的释放，该方法使用含有组织固定装置的48孔板来孵育脑组织以检测单胺释放，并结合高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）对释放的单胺进行定量分析。简言之，使用组织切片机或振动切片机制备包含感兴趣脑区（如前额叶皮层、海马和背侧纹状体）的大鼠脑切片。将这些感兴趣脑区从全脑中分离后，置于充氧的生理缓冲液中孵育。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验在整个实验过程中评估组织活性。将新鲜分离的脑组织置于不同药物条件下孵育，这些药物可通过转运体诱导单胺释放（如苯丙胺）或通过激活胞吐性囊泡释放（如KCl）。孵育结束后，收集上清液中的释放产物，并通过HPLC-ECD系统进行分析。本方法可检测急性脑切片中的基础单胺释放水平。所得数据支持既往的体内和体外研究结果，表明苯丙胺（AMPH）和KCl可诱导单胺释放。该方法特别适用于研究与单胺转运体依赖性释放相关的机制，并为快速、低成本地筛选影响单胺释放的化合物提供了有效途径。
引言
多种神经和精神疾病与单胺类神经递质（多巴胺 [DA]、5-羟色胺 [5-HT]、去甲肾上腺素 [NE]）稳态的失调或维持不足相关1,2,3。这些疾病包括但不限于抑郁症1,2、精神分裂症2、焦虑症2、成瘾4、更年期5,6,7、疼痛8以及帕金森病3。例如，多种大鼠更年期模型表明，海马、前额叶皮层和纹状体中单胺类神经递质的失调或减少可能与更年期女性所表现出的抑郁症状和认知功能下降有关。在这些模型中，单胺类神经递质的失调已通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）进行了广泛研究，但这些研究并未区分所测得的神经递质含量与神经递质释放量5,
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方案
所有实验，包括动物操作和组织采集，均按照佛罗里达大学和纽约城市学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规定进行，并遵循批准的方案编号 201508873（UF）和 1071（CCNY）。有关试剂和缓冲液，请参见补充文件。
1. 制备急性大鼠脑切片
注意：本实验使用成年雄性大鼠（250–350 g）。然而，该实验体系也可适用于不同的发育阶段、雌性大鼠以及其他物种。若使用较小的动物（如小鼠），实验者可通过调整每个条件下的脑切片或脑组织 punches 数量来优化实验方案。灌注缓冲液将称为缓冲液1；外排缓冲液将称为缓冲液2。
- 按照补充文件中所述方法配制缓冲液1。将95%/5%（O2/CO2）混合气体通入缓冲液1中20分钟，以在冰上充分氧合。另取50 mL缓冲液1，置于小烧杯或培养皿中冰上预冷。该缓冲液用于保存急性分离的完整脑组织。
- 使用1%-2%异氟烷麻醉一只或两只成年大鼠（250-350 g），采用断头器断头后迅速取出脑组织。立即将脑组织放入步骤1.1中盛有冰冻氧合缓冲液1的容器中。
注意：确保安全使用异氟烷和断头器。异氟烷应在通风橱内开启。 - 使用振动切片机或压缩切片机，从各目标脑区切取300 µm厚的冠状脑切片（
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结果
本技术描述了使用脑切片并通过基于48孔板内置组织支架的高效液相色谱-电化学检测法测定内源性单胺类物质释放的方法。实验装置如图1和图2所示。首先，为了确保实验结束时组织仍具有活性，进行了MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，一种四氮唑）检测。在完成功能实验后，急性脑切片仍保持代谢活性，其活性显著高于经1% Triton X-100孵育的切片（细胞死亡条件），表明其具有良好的存活状态（图3）。
对海马体和前额叶皮层脑切片进行急性、20分钟的AMPH处理，可显著提高每种单胺类神经递质的细胞外水平（图4A、B）。AMPH（30 µM）使海马体切片和前额叶皮层切.......
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讨论
多年来，单胺类物质释放的检测已在多种系统中开展，包括异源细胞、神经元培养物、脑突触体、离体急性脑切片以及整体动物13,20,41,42,58,64,65,66,67,68。这些实验体系使神经科学领域得以探索基本的神经递质释放机制，进而可能发现针对单胺类物质参与的神经系统和精神疾病的新药理学靶点。尽管这些方法被广泛使用，但在内源性单胺释放的来源和/或释放量方面仍存在某些局限.......
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致谢
本工作获得了Fondecyt启动基金N 11191049（授予J.A.P.）和美国国立卫生研究院（NIH）基金DA038598（授予G.E.T.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 48 孔板 | NA | NA | 检测 |
| 乙腈 | Fischer Scientific | A998-1 | 流动相 |
| 无水氯化钙 | Sigma Aldrich | C1016 | 改良人工脑脊液或外排缓冲液 |
| Clarity 软件 | Anetc | ||
| 柠檬酸 | Sigma Aldrich | 流动相 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | 1002608421 | 解剖缓冲液 |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT 检测 |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | 流动相 | |
| GraphPad 软件 | Graphpad Software, Inc | 统计分析 | |
| 甘油 | Sigma Aldrich | G5516 | 裂解缓冲液 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | 裂解缓冲液 |
| HPLC，十级安培检测器 | Anetc | HPLC，LC-EC 系统 | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A5960 | 解剖缓冲液 |
| 硫酸镁 | Sigma | 7487-88-9 | KH 缓冲液 |
| 微量离心过滤单元 UltraFree | Millipore | C7554 | 检测 — 6 个适配于 48 孔板 |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT 检测 |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | 检测；蛋白检测 |
| 辛烷磺酸 | Sigma Aldrich | V800010 | 流动相 |
| 盐酸苯丙胺 | Sigma Aldrich | P8013 | 改良人工脑脊液或外排缓冲液 |
| 磷酸 | Sigma Aldrich | 流动相 | |
| 氯化钾 | Sigma | 12636 | KH 缓冲液 |
| 磷酸二氢钾 | Sigma | 1001655559 | KH 缓冲液 |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | 组织切片压缩仪（Compresstome） | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | P2714 | 裂解缓冲液 |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761 | 解剖缓冲液 |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S5761 | 解剖缓冲液 |
| 氯化钠 | Sigma | S3014 | KH 缓冲液 |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma Aldrich | L3771 | 裂解缓冲液 |
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT 检测 / 裂解缓冲液 |
参考文献
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S.
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