利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

摘要

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可用于在可控的时空条件下调控基因表达，从而在Anopheles gambiae中进行功能性遗传学分析。本文所述该系统的使用方法包括半标准化的克隆策略、基于荧光蛋白标记对蛹进行性别鉴定和筛选，以及胚胎固定。

摘要

双组分 GAL4-UAS 系统是一种多功能且强大的功能遗传学分析工具。该系统的核心在于将转基因“驱动”品系与转基因“响应”品系进行杂交：驱动品系以组织特异性方式表达酵母转录因子 GAL4，而响应品系携带一个候选基因或 RNA 干扰结构，其表达受上游激活序列（UAS）控制，而 UAS 可与 GAL4 结合。在杂交后代中，目标基因或基因沉默结构便按照预设的时空模式表达，从而可对所产生的表型进行检测，并据此推断基因功能。该双元系统使实验设计具有高度灵活性，能够在多种组织特异性表达模式下筛选转基因表达所引发的表型，即使这些表型伴随严重的适合度代价亦可进行。我们已将此系统应用于非洲主要疟疾传播媒介——Anopheles gambiae。

本文介绍了一些在 GAL4-UAS 分析过程中常用的实验方法。我们描述了已建立的冈比亚按蚊（An. gambiae）GAL4-UAS 品系，以及用于基因上调和 RNAi 沉默的新效应子载体的克隆方法。我们提供了按蚊蛹期性别鉴定的逐步操作指南，以建立遗传杂交，并包括对后代进行筛选，以追踪标记驱动子和效应子插入的荧光基因标记的遗传情况。此外，我们还介绍了一种用于透明化冈比亚按蚊（An. gambiae）胚胎以研究胚胎发育的实验方案。最后，我们提出了通过 CRISPR/Cas9 技术将 GAL4 插入目标基因下游以构建驱动子品系的潜在改进方法。

引言

双组分GAL4-UAS系统是昆虫模式生物Drosophila melanogaster^1,2,3中基因功能鉴定的主要工具。使用GAL4-UAS系统时，将携带酵母转录因子GAL4的转基因驱动品系（其表达受特定调控序列控制）与响应品系（携带由GAL4识别的上游激活序列（UAS）控制的目的基因或RNA干扰（RNAi）构建体）进行杂交。该杂交后代中，目的转基因的表达模式由驱动GAL4表达的启动子决定，呈现特定的时空表达特征（图1）。通过分析驱动品系与响应品系杂交后代所表现出的表型，可揭示候选基因的功能。尽管D. melanogaster已被用于研究其他生物的基因^4,5,6,7，但目前GAL4-UAS系统已拓展应用于具有医学和农业重要性的其他昆虫物种，以实现对目标物种的直接功能分析^8,9,

方案

1. UAS 载体的设计与构建

1. 候选基因表达载体的设计与构建
   1. 确定用于候选基因上调的序列。
      1. 对目标品系的 cDNA/gDNA 进行测序，并与已发表序列进行比对，以验证其身份，并识别潜在的 SNP 和用于诊断性酶切的限制性酶切位点。
      2. 在适当情况下，确保用于基因扩增的正向引物覆盖天然的 Kozak 序列和起始密码子。设计在起始密码子上游约 10 个碱基处结合的引物，可包含 Kozak 序列。
      3. 在大多数情况下，反向引物扩增的片段中应包含终止密码子。可使用文中所述质粒载体提供的 3' 终止序列，或从候选基因的基因组序列中扩增获得。
      4. 如需要，可订购具有特定密码子偏好性的商业合成序列。
   2. 采用标准亚克隆方法将基因表达盒插入 UAS 质粒载体中，例如用于基因上调和 RNAi 构建的 pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]¹⁵（图 1）。
   3. 利用 ΦC31 重组介导的表达盒交换技术生成转基因蚊子^10,17....

结果

3xP3 启动子驱动的 eYFP、dsRed 和 eCFP 表达可在An. gambiae蛹的眼部和腹神经节中产生可靠且易于区分的标记，从而准确识别携带这些标记基因的个体（图3）。雄性和雌性外部生殖器在形态上的差异可用于性别鉴定，图4展示了这一特征及一个无法识别性别的蛹样例。去除蛹体表面所有水分会增加性别鉴定难度，因为肛门桨状结构会遮挡生殖器的观察（图4D、E）。双组分GAL4-UAS系统可实现基因表达的时空特异性调控，通过将泛表达驱动系（图6A、C）和油胞细胞特异性驱动系（图6B、D）与响应子品系UAS-mCD8:mCherry¹⁰杂交，可直观观察到基因表达.......

讨论

了解蚊子基因功能对于开发控制 Anopheles 并影响疟疾传播的新方法至关重要。本文所述的GAL4-UAS系统是一种多功能且强大的候选基因功能分析工具，迄今为止，我们已利用该系统研究了杀虫剂抗性的遗传基础¹⁷ 以及表皮碳氢化合物的产生^15,23，同时还实现了对不同蚊子细胞群体的荧光标记⁸。目前，响应子构建体主要通过限制性内切酶克隆方法插入含有多个克隆位点的质粒中，该位点位于UAS下游（图1、表1）。然而，由于这些构建体具有模块化特征，包含多个元件（attB位点、 3xP3-YFP和gypsy绝缘子序列），因此可采用更为现代的技术来构建新的响应子质粒。通常，过表达序列可通过PCR从cDNA或gDNA中扩增获得，但商业合成有时可减少构建新载体所需的人力和时间。在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 x 15 mm 塑料培养皿	SLS	2175546	每包 10 个
1000 µL Gilson 移液器	Gilson	F144059P
20/25 mL 通用管	Starlab	E1412-3020	每包 400 个
3 mL 巴斯德吸管	SLS	G612398	Greiner 3 mL 无菌独立包装巴斯德吸管
50 mL Falcon 管	Fisher Scientific	11512303
无水乙醇	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
乙酸	SLS	45726-1L-F	1 L
饲养笼	SLS	E6099	30x30x30 带筛网接口
细毛画笔	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 件套细节绘画笔套装，适用于水彩、丙烯、油画（酒红色）
鱼食	Amazon		Tetra Min 鱼食，适用于所有热带鱼的全面营养食品，促进健康、体色和活力，10 L
甲醛溶液	Sigma Aldrich	F8775
口吸管	John Hock	612
池塘盐	Amazon		Blagdon Guardian 池塘保健盐，用于鱼类健康、水质调节、通用补剂、pH 缓冲，9.08 kg，可处理 9,092 L 水量
蛹盒	Cater4you	SP8OZ	250 个带盖蛹盒
小型塑料桶	Amazon		2.5 L 白色塑料桶，配白色盖（每包 10 个）
次氯酸钠	Fisher Scientific	S25552