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方法文章

评估小鼠伤口中生物膜的分散

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DOI：

10.3791/62136

⸱

2021年8月7日

 ,  , 
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了从小鼠伤口感染部位评估细菌播散的离体（ex vivo）和在体（in vivo）方法。该方案可用于检测局部抗菌和抗生物膜治疗措施的有效性，或评估不同细菌菌株或物种的播散能力。

摘要

与生物膜相关的感染涉及多种慢性疾病，例如难以愈合的糖尿病足溃疡、慢性鼻窦炎、反复发作的中耳炎等。这些感染中的微生物细胞受到胞外聚合物基质（EPS）的保护，从而阻碍抗生素和宿主免疫细胞清除感染。为克服这一障碍，研究人员已开始开发具有潜在治疗作用的生物膜分散剂。这些分散剂可靶向生物膜EPS中的不同组分，削弱其结构，并促使细菌分散，理论上可增强抗生素的效力并促进免疫清除。为了评估分散剂在伤口感染中的有效性，我们建立了可在离体和体内条件下检测生物膜分散的实验方案。我们采用一种已被充分描述的小鼠手术切除模型，以建立与生物膜相关的慢性伤口感染。为在体内监测分散效果，我们使用表达荧光素酶的细菌菌株感染伤口。待成熟感染形成后，用含有可降解生物膜EPS组分的酶溶液冲洗伤口，随后监测伤口部位及过滤器官中发光信号的位置与强度，以评估所达到的分散程度。对于生物膜分散的离体分析，将感染的伤口组织浸入可降解生物膜的酶溶液中，之后分别测定组织内残留的细菌负荷量与溶液中的细菌负荷量。这两种方案各有优缺点，均可进一步优化，以更准确地评估分散治疗措施的有效性。

引言

全球范围内抗生素耐药性的上升导致可用于治疗多种细菌感染的抗生素选择日益减少1。除了抗生素耐药性之外，细菌还可通过形成生物膜相关的生活方式获得对抗生素的耐受性2。生物膜是由微生物组成的群落，其外层被多糖、胞外DNA、脂类和蛋白质构成的基质所保护3，这些成分统称为胞外聚合物（EPS）。随着抗生素耐药危机的持续加剧，迫切需要开发新的策略，以延长现有抗生素的使用寿命或增强其疗效。抗生物膜剂便是其中一种有前景的解决方案4。

在已提出的多种抗生物膜策略中，利用可靶向生物膜胞外聚合物基质（EPS）不同组分的分散剂，正处于治疗开发的前沿5糖苷水解酶（GH）是其中一类分散剂。GH 是一大类酶，可催化裂解为胞外多糖（EPS）提供结构完整性的多糖内部的不同化学键。我们课题组及其他研究团队已证实，GH 能有效降解生物膜、诱导生物膜分散，并提高多种细菌对抗生素的敏感性， 体外 和 体内6,7,8,9,10,11.

随着人们对生物膜分散的兴趣日益增加，开发能够评估分散效果的有效方法显得尤为重要。本文介绍了一种在小鼠模型中使用分散剂处理与生物膜相关的伤口感染的详细实验方案。 以及扩散效率的评估， 体内 和 离体总体目标是提供可在临床前模型中有效且高效地测量生物膜分散的方法。

在这些研究中，采用了一种小鼠外科切除感染模型来建立与生物膜相关的感染。我们已使用该模型超过15年，并广泛发表了相关观察结果7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。总体而言，这是一种非致死性感染模型，细菌局限于伤口床并形成生物膜相关感染（在显微镜下可见被胞外多糖基质包围的细菌聚集体），从而建立可持续长达3周的慢性感染。然而，如果小鼠存在免疫功能受损（例如患有1型糖尿病），则在此模型中可能更易发展为致命性全身感染。

在本报告中，我们提供了评估细菌从伤口扩散的实验方案，包括 体内 和 离体两种方案均可用于评估分散剂的效果，且各有优缺点。例如，评估分散 体内 可提供关于细菌播散至机体其他部位后扩散情况的重要实时信息，以及宿主对此的反应。另一方面，评估播散过程 离体 可能更适合用于筛选多种药物、剂量或剂型，因为可以将组织分割成多个部分并分别进行测试，从而减少所需小鼠的数量。在评估多种药物时，我们通常首先测量分散情况 体外 如前所述 6,9,22我们随后测试最有效的方法 离体 并保留 体内 测试少数极具前景的药物。

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方案

本动物实验方案已通过德克萨斯理工大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的审查和批准（方案编号 07044）。本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。

1. 准备用于小鼠感染的细菌

注意：本文仅描述使用Pseudomonas aeruginosa感染小鼠。然而，也可使用其他细菌种类引发感染。细菌菌株及相关材料详见材料表。

  1. 使用 铜绿假单胞菌 野生型菌株PAO1携带发光质粒pQF50-lux23 如先前所述，用于这些实验7.
  2. 培养 P. aeruginosa 在装有挡板的锥形瓶中，于37 °C、200 rpm振荡条件下，在Luria-Bertani（LB）肉汤中培养菌株16至20小时。为维持PAO1(pQF50-lux)质粒，在其过夜培养物中加入终浓度为100 µg/mL的氨苄青霉素。
  3. 传代培养 P. aeruginosa 通过将100 µL过夜培养物加入含有10 mL LB肉汤（含终浓度为100 µg/mL氨苄青霉素）的锥形瓶中。然后在37 °C振荡培养2–2.5小时，至OD600 nm 0.4，然后连续稀释（1:10）三次，以获得约10的感染剂量4 细胞

2. 生物膜分散酶的制备

注意：本研究中我们使用由等量淀粉酶和纤维素酶组成的10%溶液（每种酶各5%），该溶液在分散处理中简称为"GH"。

  1. 使用溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）的10% GH溶液（w/v），其中含有淀粉酶（来自Bacillus subtilis）和真菌纤维素酶（来自Aspergillus niger）。以PBS作为溶剂对照处理。
  2. 将所有处理组在37 °C下预热30分钟，以激活酶活性。

3. 实验动物与术前准备

  1. 将小鼠每5只同窝仔鼠饲养于一个笼内，在环境可控的条件下，保持12小时光照/12小时黑暗循环，并确保食物和水的充足供应。
  2. 建议使用8至10周龄的雌性Swiss Webster小鼠。
  3. 称量小鼠体重，以确定所需麻醉剂的正确剂量。
  4. 通过腹腔注射给予每千克体重100 mg的氯胺酮和每千克体重10 mg的赛拉嗪进行麻醉。
  5. 使用棉签小心地将眼膏（例如Refresh P.M.）涂抹于眼睛表面，以减少干燥。
  6. 在整个手术过程中监测生理参数，包括呼吸频率、皮肤颜色和体温。

4. 背部全层切除手术

  1. 通过夹捏脚趾并监测呼吸频率和呼吸努力来评估麻醉的手术平面。剃除背部表面的毛发，涂抹脱毛膏10分钟（或按照产品说明书操作），随后 轻轻移除，确保皮肤干燥。
  2. 为进行疼痛管理，皮下注射0.05 mL利多卡因至待切除区域，并皮下注射0.02 mL丁丙诺啡至颈部背侧皮肤皱褶处。等待10分钟，以确保达到镇痛效果。
  3. 切除前，使用酒精棉片对背部表面进行消毒，并在背部后侧区域画出一个直径为1.5 cm的圆圈。整个操作过程中须保持无菌手术区域，使用经高压灭菌的器械和无菌手套。为减少污染，应在点燃的本生灯旁进行手术，并为每只动物使用清洁的器械。
  4. 使用手术剪在脂肪筋膜肌层水平制造全层皮肤切除性伤口。
  5. 切除后，立即用半透性聚氨酯敷料覆盖伤口。
  6. 注射约104 通过敷料下向伤口床接种100 µL PBS中的细菌CFU，以建立感染。
    注意：伤口也可能同时感染多种细菌和/或真菌，或由预先形成的生物膜引起感染。12，或从患者身上提取的清创组织19，置于创面床。
  7. 感染后，将小鼠放入垫有加热垫的笼子中，并持续观察直至其恢复翻正反射。
    注意：确保小鼠不会受凉，因为这可能导致死亡。
  8. 建立伤口感染模型，持续48小时。
  9. 每日检查粘性敷料是否有破损及非粘附区域，必要时及时更换。

5. 在体 扩散处理

注意：此处我们描述通过应用一系列3种局部伤口冲洗溶液来给予分散剂的方法（图1）。然而，该方案也可适用于其他递送方式，例如凝胶、乳膏或敷料的应用。

  1. 在给予处理的同时，使用异氟烷麻醉小鼠（异氟烷浓度为3%，氧气流速为1升/分钟）。
  2. 准备三支1 mL注射器，每支配备25 G针头，每支注射器中装有200 µL用于每只小鼠的处理液。
  3. 用镊子轻轻提起并夹住伤口上方靠近动物头部一侧的皮肤，将200 µL酶溶液或PBS对照液注射到伤口处。小心地将注射器刺入提起的皮肤，并缓慢将溶液注入敷料与伤口床之间。本研究中使用的敷料通常会黏附于伤口床及周围组织。
    1. 为确保溶液覆盖整个伤口床，可在缓慢注射溶液的同时，用镊子轻轻抬起敷料，使其与伤口床分离。
  4. 处理后，将小鼠放回笼中静置30分钟。
  5. 经过30分钟处理暴露后，再次使用异氟烷麻醉小鼠，并用注射器吸取溶液，穿刺部位应与之前相同。
    注意：所吸取的溶液中含有分散的细菌细胞，可用于后续多种分析。
  6. 第二和第三次灌洗处理的操作与第一次相同，每次均使用新的注射器。

6. 体内 扩散成像与分析

注意：若使用发光细菌菌株来启动感染，则需 活体成像系统 （IVIS）可用于可视化伤口床的扩散情况。

  1. 在治疗前、治疗后即刻以及治疗后10小时和20小时对小鼠进行成像（图2 及补充图1）。
  2. 在小鼠处于麻醉状态下进行成像，将其逐一放置于IVIS系统中，在560 nm波长下对每只小鼠成像5秒。保存图像以供后续分析。
    注意：最佳波长和曝光时间取决于所使用的报告基因以及IVIS仪器和成像软件。
  3. 进行分析时，在IVIS软件中打开图像，并在工具面板中选择待分析区域。
  4. 为校正背景信号，先在图像背景区域放置一个圆形，然后在每只小鼠的伤口床区域放置相同大小的圆形。
  5. 为上传测量值，选择 查看 -> �感兴区域（ROI）测量值 ，并将测量数据表上传至电子表格。将每个伤口床区域的测量值减去背景圆形的读数，以计算各样本的发光强度。通过以下公式计算发光强度变化百分比：
    （治疗前ROI - 治疗后ROI）/ 治疗前ROI × 100。
    ​注意：对照组与处理组小鼠应同时进行分析，以校正可能影响图像采集或辐射强度的变量。

7. 通过测定菌落形成单位评估扩散能力

  1. 在使用 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪进行麻醉后，通过腹腔注射 0.2 mL 戊巴比妥钠（例如 Fatal Plus）人道处死小鼠。
  2. 用无菌镊子轻轻移除敷料后，用无菌手术剪在创面床周围剪开 ，然后用镊子轻轻提起创面床的一端，同时用剪刀剪开或分离样本与肌肉层之间的连接。
  3. 将创面床组织放入预先标记并预称重的含有 1 mL PBS 的 2 mL 匀浆管中。插入样本后再次称重，并轻轻倒置 3–5 次以冲洗掉任何分散或松散附着的细菌，然后弃去 PBS。加入 1 mL 新鲜 PBS。
  4. 为获取脾脏，将小鼠置于仰卧解剖位，并用针固定其四肢于解剖台面上。用 70% 乙醇浸润待解剖区域，以消毒局部并防止毛发污染样本。
  5. 用手术剪在下腹部皮肤真皮层做一垂直于中线的小切口，注意提起皮肤并远离内脏器官。沿中线继续向内切开，直至到达胸骨。暴露腹腔并观察到内脏器官后，轻轻将脾脏从结缔组织中分离，并置于单独的匀浆管中。
  6. 称量脾脏重量，并按照创面床组织的方法用 PBS 冲洗。
    注：其他感兴趣的器官也可采用类似方法获取。
    1. 进行初始切口时，注意避免刺破肠道或其他器官。
  7. 使用台式匀浆仪，在 2 mL 预装珠磨管中以 5 m/s 的速度匀浆样品 60 秒，重复两次。
  8. 为计数菌落形成单位（CFU），对样品进行系列稀释后点种于选择性琼脂平板上。系列稀释时，在 1.5 mL 离心管中加入 100 µL 样品至 900 µL PBS 中，涡旋混匀，重复此步骤共 5 次。取每种稀释液 10 µL 点种于琼脂平板，如 图 3 所示。
    ​注：若需更精确的 CFU 定量，可将每种稀释液的 100 µL 均匀涂布于独立的琼脂平板上。

8. 离体 扩散性评估（图4)

  1. 按照上述方法对小鼠进行伤口处理并接种约 104 CFU 的 PAO1，感染后 48 小时处死小鼠。
  2. 使用无菌技术，用镊子小心移除敷料，避免扰动伤口床。
  3. 使用无菌手术剪，在镊子提起伤口床一端后，沿伤口床边缘剪下，将感染的伤口组织从下方肌肉层及周围未感染组织中切除。将伤口床样本分成相等部分或整块使用。
  4. 将伤口组织放入预先称重的空的 2 mL 珠磨匀浆管中，加入样本后再称一次管重。通过以下公式计算样本重量：
    加入样本后的重量 - 加入样本前的重量。
  5. 加入 1 mL PBS，轻轻倒置管子 3–5 次以冲洗样本，去除任何浮游细胞。移除并弃去 PBS。
  6. 向样本中加入 1 mL GH 处理液（或以 PBS 作为阴性对照），在 37 °C、80 rpm 振荡条件下孵育 2 小时。
  7. 移除生物膜分散液，转移至另一个 1.5 mL 离心管中。此液体中含有已分散的细胞。
  8. 向剩余的组织样本中加入 1 mL PBS，轻轻倒置 3–5 次，以冲洗残留的分散细胞。移除并弃去 PBS。
  9. 向剩余组织中加入 1 mL PBS，使用台式匀浆器在 5 m/s 条件下匀浆 60 秒。
  10. 将分散细胞溶液和匀浆后的组织样本进行连续稀释：取 100 µL 样本加入含 900 µL PBS 的 1.5 mL 管中，重复五次，共进行 6 个梯度稀释。
  11. 将每个稀释度的溶液取 10 µL 点种于选择性培养基平板（例如用于 P. aeruginosa 的假单胞菌分离琼脂），在 37 °C 培养过夜。
  12. 计数菌落形成单位（CFU），并按以下公式计算“分散百分比”：（上清液中的 CFU /（上清液中的 CFU + 生物膜组织中的 CFU））× 100。

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结果

在本实验中，将携带发光质粒 pQF50-lux 的 PAO1 菌以 104 CFU 感染8至10周龄的雌性 Swiss Webster 小鼠。如上所述，在给予 PBS（溶剂对照）或 10% GH（处理组）进行生物膜胞外多糖（EPS）降解之前，先让感染建立 48 小时。在处理前、处理后即刻（0 小时）、以及处理后 10 小时和 20 小时对小鼠进行成像。图 2A 和 补充图 1 显示伤口床内已形成感染，并产生强烈的生物发光信号。GH 处理后（0 小时）可立即观察到细菌从伤口床中扩散，而 PBS 处理后则无此现象。需要注意的是，在先前的研究中，我们已在 GH 处理后 5 小时即可在血液和脾脏中检测到细菌7。通过将小鼠侧置进行成像，也可观察到细菌向器官的播散，如 图 2A 下方图示所示。

PBS处理组和GH处理组小鼠的成像结果显示，给药后20小时的发光信号较给药前均有...

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讨论

在此，我们描述可用于研究生物膜分散剂功效的实验方案。这些方案可轻松调整，适用于不同类型的分散剂、细菌种类或 离体 样本，包括临床清创样本。该方案还提供了一种具有临床相关性的模型，用于收集和研究分散的细菌细胞。研究表明，分散细菌细胞的表型与浮游细菌细胞或生物膜细菌细胞的表型均有所不同。 5,24,25,26；然而，分散细菌的表型 体内 尚未被描述. 如果要将分散剂用于治疗，确定其功效以及了解这些细胞所采用的表型至关重要。此外，本方案还可用于研究EPS结构的变异或信号通路的改变如何影响分散过程。例如，分散的 P. aeruginosa 可将不同胞外多糖组分（如 Pel、Psl、藻酸盐）发生突变的菌株与野生型菌株进行比较。

总体而言，本实验方案可分为四个主要部分：...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院（R21 AI137462-01A1）、Ted Nash Long Life基金会、Jasper L.和Jack Denton Wilson基金会以及美国国防部（DoD MIDRP W0318_19_NM_PP）资助项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Fisher14823434用于完成样品的系列稀释
25G 58 in 针头Fisher14823434连接至 1 mL 注射器使用
氨苄青霉素钠盐FisherBP1760-5配制 50 mg/mL 储存液，并向 10 mL LB 肉汤中加入 100 µL，用于过夜培养和传代培养
淀粉酶MP Biomedicals2100447配制 5% w/v 溶液，涡旋混合——也可使用其他分散剂
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)ZooPharmRX216118用于疼痛管理——也可选用其他替代方案
纤维素酶MP Biomedicals2150583将 5% w/v 加入 5% w/v 淀粉酶溶液中，涡旋混合，在 37 °C 激活 30 分钟——也可使用其他分散剂
脱毛膏Walmart287746取少量按摩至动物背部毛囊处，静置 10 分钟后去除毛发
带齿镊子，尖端带齿Fisher12-460-536也可使用其他类型的镊子
带挡板锥形瓶，125 mLFisher101406用于细菌的过夜培养和传代培养
FastPrep-24 台式均质仪MP Biomedicals6VFV9以 5 m/s 速度均质 60 秒，重复两次以均质组织
Fatal PlusVortech Pharmaceuticals0298-9373-68每只小鼠腹腔注射 0.2 mL
均质管（2 mL 珠管，2.4 mm 金属珠）Fisher15340151用于样品均质以进行涂板
异氟烷Diamond Back Drugs
盐酸氯胺酮/盐酸赛拉嗪溶液 C-IIINSigma AldrichK4138用作麻醉剂——也可使用其他麻醉方案以获得手术麻醉状态
LB 肉汤，Miller 配方FisherBP1426-2添加 25 g/L，高压灭菌
2% 利多卡因注射液Diamond Back Drugs2468在标记的创面区域侧边注射 0.05 mL，使药物沉积于标记中心区域。切割前等待 10 分钟
美罗培南Sigma AldrichPHR1772-500MG配制 5 mg/mL 溶液加入 GH 溶液中用于局部涂抹，另配制 15 mg/mL 溶液，在治疗前 4 小时和治疗后 6 小时腹腔注射
非无菌棉质纱布垫Fisher13-761-52用于去除脱毛膏
PAO1 pQF50-lux 细菌菌株Ref [13]N/A本研究代表性结果中使用 PAO1 pgF50-lux 作为铜绿假单胞菌的目标菌株
培养皿FisherPHR1772-500MG
磷酸盐缓冲液 10xFisherBP3991使用前稀释 10 倍至 1x
聚氨酯敷料Mckesson66024007剪去圆角，将剩余方形部分切成四个相等的小块
假单胞菌选择性琼脂VWR90004-394向水中加入 20 mL/L 甘油和 45 g/mL 琼脂，高压灭菌后倒入培养皿，每皿 20 mL
Refresh P.M.Walmart用于术中眼部，以减少干燥
无菌酒精棉片Fisher22-363-750在造伤前立即用于清洁皮肤，以消毒该区域
直型精细剪刀Fisher89515也可使用弯头剪刀
Swiss Webster 小鼠Charles River551NCISWWEB也可使用其他品系小鼠
1 mL 滑动式针筒Fisher14823434用于给药和酶处理

参考文献

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