评估小鼠伤口中生物膜的分散

摘要

本文介绍了从小鼠伤口感染部位评估细菌播散的离体（ex vivo）和在体（in vivo）方法。该方案可用于检测局部抗菌和抗生物膜治疗措施的有效性，或评估不同细菌菌株或物种的播散能力。

摘要

与生物膜相关的感染涉及多种慢性疾病，例如难以愈合的糖尿病足溃疡、慢性鼻窦炎、反复发作的中耳炎等。这些感染中的微生物细胞受到胞外聚合物基质（EPS）的保护，从而阻碍抗生素和宿主免疫细胞清除感染。为克服这一障碍，研究人员已开始开发具有潜在治疗作用的生物膜分散剂。这些分散剂可靶向生物膜EPS中的不同组分，削弱其结构，并促使细菌分散，理论上可增强抗生素的效力并促进免疫清除。为了评估分散剂在伤口感染中的有效性，我们建立了可在离体和体内条件下检测生物膜分散的实验方案。我们采用一种已被充分描述的小鼠手术切除模型，以建立与生物膜相关的慢性伤口感染。为在体内监测分散效果，我们使用表达荧光素酶的细菌菌株感染伤口。待成熟感染形成后，用含有可降解生物膜EPS组分的酶溶液冲洗伤口，随后监测伤口部位及过滤器官中发光信号的位置与强度，以评估所达到的分散程度。对于生物膜分散的离体分析，将感染的伤口组织浸入可降解生物膜的酶溶液中，之后分别测定组织内残留的细菌负荷量与溶液中的细菌负荷量。这两种方案各有优缺点，均可进一步优化，以更准确地评估分散治疗措施的有效性。

引言

全球范围内抗生素耐药性的上升导致可用于治疗多种细菌感染的抗生素选择日益减少¹。除了抗生素耐药性之外，细菌还可通过形成生物膜相关的生活方式获得对抗生素的耐受性²。生物膜是由微生物组成的群落，其外层被多糖、胞外DNA、脂类和蛋白质构成的基质所保护³，这些成分统称为胞外聚合物（EPS）。随着抗生素耐药危机的持续加剧，迫切需要开发新的策略，以延长现有抗生素的使用寿命或增强其疗效。抗生物膜剂便是其中一种有前景的解决方案⁴。

在已提出的多种抗生物膜策略中，利用可靶向生物膜胞外聚合物基质（EPS）不同组分的分散剂，正处于治疗开发的前沿⁵糖苷水解酶（GH）是其中一类分散剂。GH 是一大类酶，可催化裂解为胞外多糖（EPS）提供结构完整性的多糖内部的不同化学键。我们课题组及其他研究团队已证实，GH 能有效降解生物膜、诱导生物膜分散，并提高多种细菌对抗生素的敏感性， 体外 和 体内^6,7,8,

方案

本动物实验方案已通过德克萨斯理工大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的审查和批准（方案编号 07044）。本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。

1. 准备用于小鼠感染的细菌

注意：本文仅描述使用Pseudomonas aeruginosa感染小鼠。然而，也可使用其他细菌种类引发感染。细菌菌株及相关材料详见材料表。

1. 使用 铜绿假单胞菌 野生型菌株PAO1携带发光质粒pQF50-lux²³ 如先前所述，用于这些实验⁷.
2. 培养 P. aeruginosa 在装有挡板的锥形瓶中，于37 °C、200 rpm振荡条件下，在Luria-Bertani（LB）肉汤中培养菌株16至20小时。为维持PAO1(pQF50-lux)质粒，在其过夜培养物中加入终浓度为100 µg/mL的氨苄青霉素。
3. 传代培养 P. aeruginosa 通过将100 µL过夜培养物加入含有10 mL LB肉汤（含终浓度为100 µg/mL氨苄青霉素）的锥形瓶中。然后在37 °C振荡培养2–2.5小时，至OD_{600 nm} 0.4，....

结果

在本实验中，将携带发光质粒 pQF50-lux 的 PAO1 菌以 10⁴ CFU 感染8至10周龄的雌性 Swiss Webster 小鼠。如上所述，在给予 PBS（溶剂对照）或 10% GH（处理组）进行生物膜胞外多糖（EPS）降解之前，先让感染建立 48 小时。在处理前、处理后即刻（0 小时）、以及处理后 10 小时和 20 小时对小鼠进行成像。图 2A 和 补充图 1 显示伤口床内已形成感染，并产生强烈的生物发光信号。GH 处理后（0 小时）可立即观察到细菌从伤口床中扩散，而 PBS 处理后则无此现象。需要注意的是，在先前的研究中，我们已在 GH 处理后 5 小时即可在血液和脾脏中检测到细菌⁷。通过将小鼠侧置进行成像，也可观察到细菌向器官的播散，如 图 2A 下方图示所示。

PBS处理组和GH处理组小鼠的成像结果显示，给药后20小时的发光信号较给药前均有.......

讨论

在此，我们描述可用于研究生物膜分散剂功效的实验方案。这些方案可轻松调整，适用于不同类型的分散剂、细菌种类或 离体 样本，包括临床清创样本。该方案还提供了一种具有临床相关性的模型，用于收集和研究分散的细菌细胞。研究表明，分散细菌细胞的表型与浮游细菌细胞或生物膜细菌细胞的表型均有所不同。 ^5,24,25,26；然而，分散细菌的表型 体内 尚未被描述. 如果要将分散剂用于治疗，确定其功效以及了解这些细胞所采用的表型至关重要。此外，本方案还可用于研究EPS结构的变异或信号通路的改变如何影响分散过程。例如，分散的 P. aeruginosa 可将不同胞外多糖组分（如 Pel、Psl、藻酸盐）发生突变的菌株与野生型菌株进行比较。

总体而言，本实验方案可分为四个主要部分：.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	14823434	用于完成样品的系列稀释
25G 58 in 针头	Fisher	14823434	连接至 1 mL 注射器使用
氨苄青霉素钠盐	Fisher	BP1760-5	配制 50 mg/mL 储存液，并向 10 mL LB 肉汤中加入 100 µL，用于过夜培养和传代培养
淀粉酶	MP Biomedicals	2100447	配制 5% w/v 溶液，涡旋混合——也可使用其他分散剂
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	用于疼痛管理——也可选用其他替代方案
纤维素酶	MP Biomedicals	2150583	将 5% w/v 加入 5% w/v 淀粉酶溶液中，涡旋混合，在 37 °C 激活 30 分钟——也可使用其他分散剂
脱毛膏	Walmart	287746	取少量按摩至动物背部毛囊处，静置 10 分钟后去除毛发
带齿镊子，尖端带齿	Fisher	12-460-536	也可使用其他类型的镊子
带挡板锥形瓶，125 mL	Fisher	101406	用于细菌的过夜培养和传代培养
FastPrep-24 台式均质仪	MP Biomedicals	6VFV9	以 5 m/s 速度均质 60 秒，重复两次以均质组织
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	每只小鼠腹腔注射 0.2 mL
均质管（2 mL 珠管，2.4 mm 金属珠）	Fisher	15340151	用于样品均质以进行涂板
异氟烷	Diamond Back Drugs
盐酸氯胺酮/盐酸赛拉嗪溶液 C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	用作麻醉剂——也可使用其他麻醉方案以获得手术麻醉状态
LB 肉汤，Miller 配方	Fisher	BP1426-2	添加 25 g/L，高压灭菌
2% 利多卡因注射液	Diamond Back Drugs	2468	在标记的创面区域侧边注射 0.05 mL，使药物沉积于标记中心区域。切割前等待 10 分钟
美罗培南	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	配制 5 mg/mL 溶液加入 GH 溶液中用于局部涂抹，另配制 15 mg/mL 溶液，在治疗前 4 小时和治疗后 6 小时腹腔注射
非无菌棉质纱布垫	Fisher	13-761-52	用于去除脱毛膏
PAO1 pQF50-lux 细菌菌株	Ref [13]	N/A	本研究代表性结果中使用 PAO1 pgF50-lux 作为铜绿假单胞菌的目标菌株
培养皿	Fisher	PHR1772-500MG
磷酸盐缓冲液 10x	Fisher	BP3991	使用前稀释 10 倍至 1x
聚氨酯敷料	Mckesson	66024007	剪去圆角，将剩余方形部分切成四个相等的小块
假单胞菌选择性琼脂	VWR	90004-394	向水中加入 20 mL/L 甘油和 45 g/mL 琼脂，高压灭菌后倒入培养皿，每皿 20 mL
Refresh P.M.	Walmart		用于术中眼部，以减少干燥
无菌酒精棉片	Fisher	22-363-750	在造伤前立即用于清洁皮肤，以消毒该区域
直型精细剪刀	Fisher	89515	也可使用弯头剪刀
Swiss Webster 小鼠	Charles River	551NCISWWEB	也可使用其他品系小鼠
1 mL 滑动式针筒	Fisher	14823434	用于给药和酶处理