Axin2-mTurquoise2 报告基因胸腺细胞中低 Wnt 表达的流式细胞术与共聚焦成像分析

摘要

已知信号水平可调控细胞命运，表明Wnt信号通路的调控是一个有前景的治疗靶点。本文介绍了一种用于检测小鼠经典Wnt信号通路报告模型的流式细胞术和共聚焦显微镜分析方法，该模型可量化不同的Wnt信号水平。

摘要

在尝试鉴定或验证新的 Wnt 治疗靶点时，测量 Wnt 表达水平至关重要。先前的研究表明，经典 Wnt 信号通路通过剂量依赖机制发挥作用，因此有必要在多种细胞类型中研究和测量 Wnt 信号活性。尽管已有多种报告基因模型被提出用于反映生理状态下的 Wnt 表达，但这些工具的有效性、准确性和灵活性往往受到遗传背景或报告蛋白的显著影响。本文描述了利用 Axin2-mTurquoise2 小鼠 Wnt 报告基因模型获取和分析数据的方法，该模型携带突变的 Axin2^em1Fstl 等位基因。该模型有助于在广泛的 Wnt 活性范围内，对单个细胞中的内源性经典 Wnt 信号通路进行研究。

本方案描述了如何通过造血系统的细胞群体分析，结合细胞表面标志物或β-catenin的细胞内染色，全面评估Axin2-mTurquoise2报告基因的活性。这些步骤可作为在其他组织或目标细胞中实施和重复该方法的基础。通过结合荧光激活细胞分选与共聚焦成像，可直观呈现不同的经典Wnt信号表达水平。推荐的检测与分析策略可提供荧光表达水平的定量数据，从而精确评估经典Wnt信号通路活性。这些方法将有助于希望利用Axin2-mTurquoise2模型研究经典Wnt表达模式的研究人员。

引言

经典Wnt信号通路是一种保守的信号传导通路，参与正常组织稳态的维持，也与疾病发生密切相关。研究表明，Wnt信号水平的精确调控在胚胎发育过程中至关重要，同时在成体组织中也具有重要意义。经典Wnt信号通路已被发现对多种器官的组织再生发挥重要作用，例如肠道、皮肤和造血系统。因此，当Wnt信号通路失调时，会导致严重的病理变化。结直肠癌、肝癌和皮肤癌、神经系统疾病以及某些血液系统恶性肿瘤，都是Wnt信号异常作为致病因素或促进因素的典型疾病¹。因此，目前已有多种针对不同Wnt靶点的抑制剂正在作为Wnt相关癌症治疗药物进行临床试验²。

此外，Wnt在神经系统功能恢复、年龄相关性神经疾病以及先天性自闭症谱系障碍治疗潜力方面的研究也取得了引人注目的进展^3,4,5Wnt信号已被广泛研究用于 离体 干细胞扩增以用于后续移植⁶然而，由于经典Wnt信号通路在多种基本细胞功能中具有重要作用，并且与其他信号通路之间存在复杂的交互作用，因此针对该通路的治疗性靶向具有较大难度。^7,8,9，因此需要在一个易于解读的模型中精确测量这些Wnt治疗剂的作用效果。经典Wnt信号通路由邻近细胞分泌或自分泌释放的短程可溶性Wnt配体驱动，此类现象已在多种Wnt响应性干细胞类型中报道。

Wnt Frizzled 受体和脂蛋白受体相关蛋白（LRP）共受体可响应这些配体，从而触发细胞内信号级联反应。当 Wnt 信号关闭时，由轴抑制蛋白（Axin）、肿瘤抑制基因产物腺瘤性息肉病 coli 蛋白（APC）、酪蛋白激酶1（CK1α）和糖原合成酶激酶（GSK-3β）组成的降解复合物会通过蛋白酶体途径阻止 β-catenin（CTNNB1）的积累。当 Wnt 配体与受体结合后，该降解复合物失活，导致 β-catenin 在细胞质中积累并稳定。活化的 β-catenin 可转入细胞核，与转录因子/淋巴增强子结合因子（TCF/LEF）结合，启动 Wnt 靶基因的转录。其中，Axin2 被认为是靶基因，因其是 Wnt 通路的直接靶点¹⁰。此外，Axin2 还可作为经典 Wnt 信号通路活化的负调控因子及报告基因^11,12。

文献中已报道了多种经典的Wnt信号通路报告系统，这些系统在理解Wnt信号在胚胎发育中的作用方面发挥了重要作用。这些报告系统大多利用人工插入的TCF/LEF结合位点，而非依赖内源性靶基因^{13,14,15,16,17,18,19}。此外，已有研究采用尊重基因天然位置的Axin2基因敲入策略^{11,20,21,22,23}，其中Axin2-LacZ被广泛认为是最可靠的经典Wnt信号报告系统¹¹。然而，报告蛋白LacZ尽管在多数组织中易于使用，但其检测依赖于β-半乳糖苷酶底物，而该底物被公认对活细胞具有较强毒性²⁴。特别是对于干细胞和胸腺细胞，在处理细胞悬液时，严苛的LacZ检测条件会增加细胞死亡（本实验室未发表数据）。

尽管LacZ染色引起的信号放大便于检测低水平信号，但其定量过程不够直接，因此可靠性相对较低。为此，设计了一种小鼠报告模型，旨在模拟Axin2-LacZ的遗传策略，但采用mTurquoise2报告蛋白²¹，以提供更直接且更接近生理表达水平的检测读数。mTurquoise2荧光蛋白是LacZ的理想替代物，因其具有高亮度（量子产率（QY）= 0.93）、可与其他荧光蛋白灵活组合用于广泛的细胞表面表征，且无需外源底物。此外，由于其与绿色荧光蛋白（GFP）具有高度的遗传相似性，在必要时可使用大多数识别GFP的荧光抗体以增强信号检测，尤其适用于对Wnt信号极为敏感的细胞²⁵。

Axin2-mTurquoise2 模型不仅是一种经典的 Wnt 报告基因模型，还提供了研究 Axin2 杂合子和纯合子（Axin2 基因敲除）表型的可能性。在 Axin2 起始位点处插入 mTurquoise2 导致 Axin2 蛋白功能中断²¹。由于 Axin2（也称为 Conductin）是 Wnt 降解复合物的组成部分，而该复合物可严格调控 β-catenin 介导的转录过程，因此其部分或完全缺失可能对研究多种病理状态具有重要意义。例如，在结直肠癌中，由于 Wnt 通路的过度激活，Axin2 水平相对较高¹¹；然而，它在其他疾病中的作用仍知之甚少。尽管通常认为 Axin2 在 β-catenin 降解过程中作用有限，但通过添加一种小肽可增强其在 Wnt 信号调控中的功能，从而抑制 Wnt 介导的结直肠癌生长²⁶。

综上所述，通过Wnt治疗靶点对Wnt信号通路进行精细调控，有望为干预严重病理过程的起始或进展提供新机遇，值得在具有报告基因功能的模型中进一步深入研究。本报告中，我们介绍了Axin2-mTurquoise2小鼠模型在流式细胞术和共聚焦成像分析中的最佳实践方法。在Wnt剂量水平背景下，经典的Wnt信号通路活性通常极低，难以检测，而先进的检测与分析能力有助于充分挖掘该模型的优势。胸腺细胞被用作模型系统，因其细胞活力脆弱、经典的Wnt信号表达水平低以及细胞质区域致密，可有效反映Axin2-mTurquoise2模型的检测灵敏度。此外，本文还详细说明了一种针对胸腺细胞悬液的组织学全β-catenin染色实验流程，用于测定细胞质中β-catenin的水平，并结合报告基因系统验证细胞核内活跃的经典Wnt信号通路活性。

方案

注意：所有小鼠操作均经莱顿大学医学中心（LUMC）动物实验伦理委员会批准。实验使用雄性和雌性、6至12周龄的野生型（wt）小鼠（未插入Axin2-mTurquoise2报告基因构建体）、杂合子（Tg/0）小鼠（单等位基因插入Axin2-mTurquoise2报告基因构建体，因此一个Axin2基因被破坏）以及纯合子（Tg/Tg）小鼠（双等位基因均插入Axin2-mTurquoise2报告基因构建体，因此两个Axin2基因均被破坏）；Axin2-mTurquoise2小鼠品系为B6;CBA-Axin2^em1Fstl/J小鼠。动物在器官分离前采用CO₂安乐死法处死。整个操作过程中应尽量减少样本暴露于光照，并始终置于冰上或4 °C环境中，除非另有说明。用铝箔覆盖样本。所有步骤均应在配备生物安全柜的标准实验室中进行。

1. 胸腺细胞悬液的制备

1. 用镊子剪开小鼠腹部，小心摘取胸腺，避免血液污染。将胸腺暂时储存或运输于含 2.5% 胎牛血清（FCS）的冰冻伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM）中。
   注意：为避免血液溢出及胸腺损伤，切勿通过颈椎脱位法处死小鼠。
2. 准备一个装有 70 μm 细胞筛的 50 mL 离心管，并用 1 mL 冷的含 2.5% FCS 的 IMDM 培养基润湿滤膜。
3. 用 1 mL 注射器活塞的尾部碾压组织，同时用冷的含 2.5% FCS 的 IMDM 培养基冲洗两次（图 1A）。如需要，可在含 2.5% FCS 的 IMDM 培养基中加入终浓度为 50 U/mL 的 DNase I，以防止死细胞聚集。用冷的含 2.5% FCS 的 IMDM 培养基冲洗滤膜两次，并在 50 mL 离心管中轻轻重悬细胞。
   注意：总终体积不得超过 10 mL。在后续操作中，若不进行处理，应将细胞置于冰上并避光保存。
4. 在 4 °C 条件下以 330 × g 离心 5 分钟，轻轻吸除上清液。将细胞沉淀轻轻重悬于冷的不含补充物的 IMDM/2.5% FCS 培养基中，并准备进行细胞计数。
   ​注意：如有需要，可将胸腺细胞悬浮于含 10% 二甲基亚砜的胎牛血清中，冻存于液氮中以备后续实验。规范的细胞冻存与复苏操作可减少过度的细胞死亡。由于胸腺中 T 细胞自然选择过程的影响，解冻后平均约一半的胸腺细胞可能发生凋亡，因此在决定每支冻存管中保存的胸腺细胞数量时应考虑此因素。每支冻存管中冻存的胸腺细胞数量不应少于 2.5 × 10⁶ 个。

2. 胸腺细胞流式细胞术样品制备

1. 将胸腺细胞制备用于细胞表面染色，制备 2.5 × 10⁶ 冰浴的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中每染色样品的胸腺细胞数图1B）。若胸腺细胞先前已被冻存，复苏后需重新计数活细胞数量。必要时，加入终浓度为50 U/mL的DNA酶I，以防止死细胞聚集。
2. 使用抗体染色面板对完整的胸腺细胞亚群进行细胞表面表征。
   注意：可选择其他荧光染料组合。对于稀有细胞群标记物，应选择高亮度的荧光染料，条件允许时建议加入活死细胞标记物。由于光谱重叠，V450 和 V500 荧光染料不应与 mTurquoise2 荧光报告蛋白联合使用。在联合使用蓝色和绿色荧光染料时，务必检测 mTurquoise2 的荧光光谱特性补充图 1A).
   1. 将抗体分别按先前确定的比例加入到谱系阴性（Lin-）抗体组合中，置于 PBS/0.2% 牛血清白蛋白（BSA）/0.1% NaN3 溶液中混合₃ （叠氮化钠）缓冲液
      注意：所有不需要的细胞（存在于胸腺中的非胸腺细胞）通过两步法使用链霉亲和素标记的二抗（在此示例中为藻红蛋白（Pe）-Cy7 和别藻蓝蛋白（APC）-Cy7）进行染色，可通过使用 "倾倒门" 在流式细胞术分析中。
   2. 将双阴性（DN）染色 panel 中已预先确定比例的抗体与链霉亲和素标记的 Pe-Cy7 二抗在 PBS/0.2% BSA/0.1% NaN3 中混合₃ 缓冲液。从该混合物中排除 Lin- 面板（表1).
   3. 将抗体与预先确定的不成熟单阳性（ISP）、双阳性（DP）和单阳性（SP）染色 panel 的比例混合，并加入PBS/0.2% BSA/0.1% NaN3中的链霉亲和素二抗APC-Cy7₃ 缓冲液。从该混合物中排除Lin- panel（表1).
   4. 首先，在冰上避光条件下，使用Lin-抗体组合中的生物素标记的一抗混合物对胸腺细胞进行染色，以标记非T细胞群体，孵育30分钟。
      注意：每套Lin- panel包含不同的细胞组合，因此不应在同一份样本中混合染色。
   5. 300 × g 离心 g，4 °C 下离心5分钟，弃上清。用150 μL预冷的PBS/0.2% BSA/0.1% NaN₃洗涤胸腺细胞₃ 缓冲液，300 × g 离心沉淀 g4 °C，5 分钟。
   6. 在冰上避光孵育30分钟，使用DN抗体组合以及对应Lin-染色的ISP/DP/SP抗体组合。300 × g离心沉淀 g，4 °C 离心 5 分钟，弃上清。用 150 μL 冰冷的 PBS/0.2% BSA/0.1% NaN 洗涤胸腺细胞₃ 缓冲液，300 × g 离心沉淀 g，4 °C 下 5 分钟。
3. 使用35 μm细胞滤筛管将细胞匀浆，并用PBS/0.2% BSA/0.1% NaN3重悬细胞，以制备流式细胞术检测样品₃ 缓冲液。避光保护细胞，并在流式细胞仪检测前及检测过程中保持冰上放置。
   注：NaN₃ （叠氮化钠）具有高毒性，可致死亡。操作此物质时需格外小心。接触后应彻底清洗双手，若接触叠氮化钠后出现任何问题，请立即联系中毒控制中心或医生。₃ 是 吞咽。

3. 流式细胞仪检测

注意：无经验的用户应首先接受流式细胞仪培训，因为mTurquoise2信号与多种其他荧光染料的联合检测需要丰富的经验以及对实验的合理规划。有关流式细胞仪的信息，请参见材料表。

1. 根据用户手册或其他既定方案启动流式细胞仪。检查流式细胞仪的带通滤光片组设置，必要时进行调整，以实现最佳的荧光检测策略。
   注：推荐用于 mTurquoise2 的滤光片为在紫外 405 nm、407 nm 或较少见的 440 nm 激光线下使用 470/20 nm 滤光片。
2. 使用市售的补偿微珠和稳定转染并表达 mTurquoise2 的 293T 细胞，校准流式细胞仪的补偿设置。
   注：可使用单一染色的野生型胸腺细胞替代补偿微珠。本实验中，使用微珠进行补偿与使用细胞效果相当，且更为便捷。
   1. 用实验中所使用的每种荧光染料分别标记微珠，并包括未染色的微珠。检测这些微珠以建立补偿设置面板；同时检测表达 mTurquoise2 的 293T 细胞，因为 mTurquoise2 在微珠上没有对应的匹配荧光染料。保存该补偿设置，供后续正式实验使用。
      注：用于补偿设置的 mTurquoise2 表达细胞，其亮度应等于或高于正式实验中 mTurquoise2 表达的胸腺细胞。确保同时存在不表达 mTurquoise2 的 293T 细胞。
   2. 在实验中，应包括荧光减一（FMO）染色的 Tg/Tg 胸腺细胞样本，其中 mTurquoise2 的 FMO 需包含野生型样本，同时每种小鼠基因型的胸腺细胞均需设置未染色样本，作为分析阶段的阳性对照。
      注：这些对照对于正确设定阳性细胞的门控至关重要。其余实验样本则使用完整的染色方案进行染色（表 1）。
      1. 在流式细胞仪软件中创建实验，添加并命名所需数量的样本管，建立散点图以可视化完整荧光染料组合的染色细胞。
      2. 将先前建立的补偿设置应用于当前实验。使用未染色的野生型胸腺细胞调整前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），直至散点图中显示完整的细胞群体。首先检测未染色的 Tg/Tg mTurquoise2 表达胸腺细胞，以确保阳性细胞群可见。
      3. 检测一个完整染色的 Tg/Tg 胸腺细胞样本，并检查所有荧光染料组合的信号。如有必要，调整先前设定的补偿值，以纠正补偿不当的荧光染料。随后检测其余实验样本，在整个样本检测过程中不再调整任何设置。
         ​注：后续的补偿调整也可在数据分析软件中进行。尽管可用细胞数量可能成为限制因素，但仍建议在检测过程中完成此步骤。为比较 mTurquoise2 的强度值，所有样本之间的仪器设置应保持一致。

4. 流式细胞术分析

注意：流式细胞术分析使用 材料表 中提到的特定软件进行；但也可使用其他流式细胞术分析程序。

1. 根据FSC和SSC值圈选活细胞和胸腺细胞亚群。
2. 检查样本左侧补偿矩阵对话框中的补偿设置，确保无荧光染料干扰，并已进行适当补偿，以避免荧光溢出或串色。
   1. 若需调整采集时定义的补偿矩阵，可通过直接增加或减少每种荧光染料组合的补偿值，使细胞群不呈现近乎完全水平或垂直的直线（补充图1B）。
3. 为直观展开展示mTurquoise2强度以便正确设门，将mTurquoise2的X轴显示模式改为线性（补充图2）。
   1. 使用mTurquoise2 FMO对照作为mTurquoise2阳性信号设门的阴性对照。针对每个细胞群调整正确的阈值设门（图2）。
      注：（野生型）mTurquoise2 FMO对照细胞不含mTurquoise2标记，因此可作为Axin2报告基因活性的背景阈值。
4. 使用适当的检测通道圈选mTurquoise2阳性细胞，以确定Wnt阳性细胞的数量。
5. 计算几何均值和中位数，以确定目标细胞的荧光强度水平。
   1. 在显示mTurquoise2阳性细胞的面板中，点击统计 | 添加统计。
   2. 定义统计方法、目标细胞群以及mTurquoise2的检测通道，然后点击添加。以任意单位（AU）表示几何均值和中位荧光强度，用于绘制图表。
      注：中位数代表荧光强度的中间值，因此可反映荧光强度群体的偏移情况。如有需要，可通过背景校正更清晰地展示mTurquoise2报告基因活性的动态范围。具体方法是将特定门控细胞类型的mTurquoise2阳性细胞总频率减去野生型背景染色频率。

5. 胸腺细胞细胞离心涂片的制备以用于共聚焦成像

注意：处理非贴壁细胞的细胞悬液时，建议使用胸腺细胞涂片。由于胸腺细胞中 Axin2-mTurquoise2 的表达水平低于胸腺上皮细胞，因此成像时采用经过滤的胸腺细胞悬液。

1. 取新鲜收获或冻存的胸腺细胞悬液。每种基因型的胸腺细胞，将约 20,000 个细胞悬浮于 100 μL 冷的 PBS/0.5% BSA/10% FCS 中。
   注意：若使用先前冻存的胸腺细胞，必要时应轻柔地解冻，以最大限度保持细胞活力。这有助于在成像时减少自发荧光。检查细胞活力以确保样本质量。细胞离心涂片程序采用了一种针对脆弱胸腺细胞优化的机械力；尽管如此，仍需要起始细胞群体具有高活力。为确保更高的细胞活力，建议使用新鲜收获的胸腺细胞，而非冻存细胞。
2. 用 PBS 预先润湿滤纸卡开口周围的区域。按照说明书组装细胞离心涂片样品室支架（图 1C）。
   1. 将滤纸卡放置在冷冻切片载玻片上（光滑面紧贴载玻片）。将两者一起置于样品室支架上。放置滤纸卡时需确保其精确对准样品室支架的孔位，并将完整的样品室支架放入转子中。
3. 小心重悬胸腺细胞，将 100 μL 细胞悬液加入样品室中。在约 350 × g 条件下离心 4 分钟，使胸腺细胞沉降到冷冻切片载玻片上。小心从载玻片上取下滤纸卡，避免触碰细胞。将细胞涂片在室温下空气干燥，时间可从 1 小时至过夜不等。
   ​注意：当使用其他细胞类型时，应测试不同细胞密度以获得最佳结果。细胞涂片可密封后于 -20 °C 冻存，以备后续实验使用。使用前在室温下解冻 1 小时再进行后续操作。

6. 全β-连环蛋白的细胞离心涂片免疫染色

1. 在室温下用100%甲醇固定细胞涂片15分钟。在室温下将玻片空气干燥10分钟。使用疏水笔在玻片上的胸腺细胞群周围画一个圆圈。
   注意：此固定步骤专为β-catenin染色优化。
2. 将玻片置于PBS/0.05% Tween-20中，在室温下孵育10分钟，随后在封闭和孵育步骤期间转移至避光湿盒中。每张玻片加入100 μL PBS/10%正常小鼠血清（NMS），在湿盒中室温孵育10分钟。轻拍去除10% NMS，每张玻片加入100 μL PBS/10%正常山羊血清（NGS），在湿盒中室温孵育30分钟。
   注意：使用PBS/10% NMS孵育可阻断非特异性一抗结合（图1D），而PBS/10% NGS可阻断非特异性二抗结合。
3. 准备用于细胞染色的额外抗体。将0.5 μg总β-catenin抗体与AF568标记的片段混合。
   注意：在此实验中，使用市售标记试剂盒，在加入胸腺细胞前，将商用抗小鼠总β-catenin一抗与Alexa Fluor 568（AF568）荧光染料标记的山羊抗小鼠IgG1 Fab片段进行预标记。请按照制造商说明书操作，可能需要测试多个浓度。标记后的总β-catenin-AF568抗体应在30分钟内使用。
4. 每张细胞涂片加入50 μL（0.5 μg）总β-catenin-AF568标记抗体，在4 °C湿盒中孵育过夜。根据制造商说明书设置阴性染色对照，或在直接标记方案中使用同型对照。
5. 在室温下用PBS/0.05% Tween-20洗涤20分钟。然后在室温下于含搅拌的广口瓶中用PBS洗涤20分钟。进行第二次固定以确保抗体与抗原的结合：在湿盒中室温下每张玻片加入100 μL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS，孵育10分钟。
   注意：保持玻片避光。甲醇或PFA固定均不会显著影响mTurquoise2的表达²⁷。
6. 将玻片浸入PBS中。在湿盒中每张玻片加入50 μL TO-PRO-3（1:1500），室温下孵育10分钟进行核染色。在含搅拌的广口瓶中室温下用PBS洗涤20分钟。
   注意：可根据是否使用荧光光谱相近的其他荧光染料，对TO-PRO-3浓度进行滴定优化。
7. 根据制造商说明书使用抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。在室温下空气干燥24小时。可直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察，或于-20 °C保存以备后续成像。

7. 共聚焦显微镜测量

注意：有关共聚焦显微镜的信息，请参见材料表。

1. 根据手册或既定方案开启共聚焦显微镜。使用稳定转染的阴性与阳性对照 mTurquoise2 293T 细胞系进行共聚焦参数的初步调整。随后，使用野生型 Axin2-mTurquoise2 和 Tg/Tg （敲除）Axin2-mTurquoise2 胸腺细胞作为阴性对照和阳性对照，以确保mTurquoise2信号未出现曝光不足。
2. 通过编程设置激光和滤光片宽度，为软件的连续扫描做好准备。首先使用最长波长的激光线，然后逐步向最短波长方向进行。完成所有连续扫描步骤的设置后，将样品置于显微镜载物台上，聚焦样品，然后按下 活体 以优化 激光功率 和 智能增益 使用共聚焦软件或可选手动面板上的相应按钮。
   注意：不应在载玻片的标本区域进行成像以用于信号定量，因为可能会发生光漂白。然而，mTurquoise2 具有较高的光稳定性²⁵.
3. 若 mTurquoise2 表达水平极低，可增加激光功率和 Smart Gain，直至观察到荧光信号，并利用阴性对照样本进行验证，以确保信号为真实阳性。使用 40x 1.4 油镜、63x 1.4 油镜或 100x 1.4 油镜观察胸腺细胞。
   注意：本研究使用了 Leica SP5 显微镜。
4. 在测量样品前，使用显微镜的以下共聚焦成像设置。
   1. 通过点击调整强度值范围至12位图像 配置 | 设置 | 切换至12位模式 位深度 可选择生成更广的强度范围，从而更清晰地区分低荧光信号与高荧光信号。
   2. 通过点击来调整成像分辨率 XY，并增加 格式 到 1024 x 1024，这也会使扫描时间加倍。通过点击将扫描速度调整为400-600 Hz 速度 | 更多 手动更改设置。此外，激活 双向的 扫描选项
   3. 调整灵敏度滑块以降低背景信号。通过优化正确的激光功率和 Smart Gain 来实现最佳效果。 快速查找表（LUT） 选项
      注意：在12位图像中，滑块的灰度强度值范围为0至4095。此操作也可在后续使用免费的离线Las X软件完成。绿色表示黑色背景，蓝色表示样本的饱和像素。
5. 当所有成像参数均优化后，通过点击进行样品测量 开始，这将启动所有三个通道的顺序成像。
   1. 测量TO-PRO-3核荧光信号。使用633 nm激光和HyD 640–750 nm检测TO-PRO-3。
      注意：本实验设置中，激光功率为6%，智能增益为15%。该参数设置可能因TO-PRO-3染色强度的不同而调整。若信号过强，过度激发时可能影响低强度荧光染料的检测。此时应降低染色浓度。
   2. 测量β-catenin的核内和胞质荧光信号。使用561 nm激光和HyD 580-605 nm检测β-catenin。通过调整设置，对单张图像最多累积2次扫描。 XY 在AF568信号较低的情况下，软件中选择线平均值为2的框。
      注意：在此设置中，激光功率为85%，智能增益为87%。
   3. 测量 mTurquoise2 的细胞质荧光信号。使用 458 nm 激光和 HyD 490-600 nm 检测 mTurquoise2。通过调整设置，对单张图像最多累积 4 次扫描。 XY 在mTurquoise2信号较低的情况下，软件中选择线平均为4的框。
      注意：由于本实验所用共聚焦显微镜的激光器较旧，且mTurquoise2信号较弱，因此使用405 nm激光（90%激光功率），同时结合458 nm和476 nm激光（均为100%激光功率），并设置HyD探测器采集范围为490–550 nm，智能增益为100%。最理想的激发波长为440 nm，但该波长在共聚焦显微镜中较少配备。高激光功率操作需谨慎，仅在顺序成像模式下进行。务必设置应急参数，防止探测器过曝。由于不同共聚焦显微镜所配备的激光器性能可能存在差异（如激光器更强或更新），其他系统所需的激光功率可能低于本方案所建议的数值。可在成像前进行漂白测试，以确认荧光信号无明显损失。在本方案所用的成像条件下，mTurquoise2的光漂白程度在可接受范围内。
   4. 进行明场成像以观察全部细胞。使用488 nm激光和PMT扫描微分干涉相差（DIC）检测胸腺细胞。导出Lif文件用于图像分析。
      注意：本实验设置中，激光功率为59%，增益为212 V，数据偏移为-4.3%。Lif文件可在离线版LAS x软件中读取，用于图像校正。

8. 共聚焦显微镜分析

1. 使用图像处理软件²⁸（补充图3）分析图像。在软件中加载图像。
   注意：支持多种格式，但建议使用带有LUT的TIFF文件，或直接将Lif文件导入图像处理软件。
2. 测量胸腺细胞核中活性β-catenin信号。
   1. 在用于分析活性β-catenin的红色灰度值图像中，选择经TO-PRO-3染色的胸腺细胞核。可通过手动方式完成，或使用软件中的自动细胞选择功能。
      注意：自动细胞选择可能需要进行图像处理以实现适当的阈值设定和颗粒分析。手动细胞选择虽然较为耗时，但通常无需图像处理，本方案中推荐使用此方法。
   2. 使用工具栏中的任意选择工具启用手动选择。
      1. 选择细胞核的轮廓，并将其添加到感兴趣区域（ROI）管理器中。点击 分析 | 工具 | ROI管理器 以激活ROI管理器；当新的ROI管理器窗口打开后，点击第一个选项 添加 (t)，或使用键盘快捷键 t。重复此步骤，直到所有细胞核均被定义并添加至ROI管理器。使用ROI管理器中的 显示全部 选项来可视化所选细胞。
   3. 选择 >3 个无细胞存在的背景区域，并将这些区域添加到ROI管理器中。
      注意：在此情况下，区域的大小和形状无关紧要。这些区域将作为最终计算中的背景噪声测量值。
      1. 通过点击 分析 | 设定测量值 来定义图像上的测量参数。在弹出的新窗口中包含多个测量选项，请勾选 面积、积分密度 和 平均灰度值，然后点击 确定。
      2. 点击激活β-catenin灰度值图像，并在ROI管理器中点击 显示全部 以可视化所选的细胞核和背景区域。观察当前在β-catenin图像中可见的所有选定区域。
      3. 在ROI管理器中点击 测量，或点击 分析 | 测量。注意新打开的 结果 窗口，其中显示了ROI内β-catenin信号的测量结果。
      4. 通过点击 编辑 | 全选 将结果复制并粘贴到电子表格计算程序中，以便进一步计算。通过点击 更多 | 保存… 保存ROI管理器，以便将来参考，无需重复细胞核选择。
   4. 对于自动细胞选择，先对图像进行 复制（键盘快捷键 Ctrl D），因为许多图像处理设置无法撤销。
      注意：在大多数情况下，自动核标记需要图像处理，以自动且准确地识别细胞核。图像处理仅应用于区域选择目的。处理后的图像不适用于荧光强度测量，因为像素值已被修改。
      1. 点击 处理 | 滤波 | 高斯模糊 执行高斯滤波，以平滑图像。测试多个Sigma（半径）值，并启用 预览 选项以在点击 确定 前查看效果。
      2. 点击 编辑 | 反转 反转图像。点击 图像 | 调整 | 亮度/对比度 检查亮度和对比度。使用 自动 选项，或更推荐手动调整数值。
         注意：请勿点击 应用 更改，因为这会改变图像属性。当获得所需图像后，直接关闭 B&C 窗口即可。
      3. 点击 图像 | 调整 | 阈值 创建阈值，并设定最佳阈值参数，使所有细胞尽可能清晰可见。点击 应用 以应用阈值设置。
         注意：如果细胞存在孔洞而未被正确阈值化，请点击 处理 | 二值化 | 填充孔洞 以填补细胞内部的空隙。如果细胞因阈值设置而融合在一起，请点击 处理 | 二值化 | 分水岭 以分离这些细胞。程序会用一条精细的1像素线分隔任何被识别为融合的细胞。
      4. 使用 自由手选择 工具手动选择一个代表性细胞核，将其添加到ROI管理器中，并测量其面积，以此定义图像中最小和最大的细胞核。
      5. 点击 分析 | 分析颗粒 对颗粒（细胞核）进行分析，在 大小 (^2) 框中输入最小面积和最大面积，中间用连字符（-）连接。在点击 确定 前，勾选 显示结果、添加至管理器 和 排除边缘对象 选项。然后继续执行步骤8.2.3以完成本方案。
3. 测量胸腺细胞中的胞质mTurquoise2和β-catenin信号。
   1. 在明场图像中，按照上述相同步骤选择整个胸腺细胞的轮廓。
   2. 选择 >3 个无细胞存在的背景区域，并将这些区域添加到ROI管理器中。
      注意：在此情况下，区域的大小和形状无关紧要。这些区域将作为最终计算中的背景噪声测量值。
      1. 点击激活mTurquoise2灰度值图像，并在ROI管理器中点击 显示全部 以可视化所选的全细胞ROI和背景区域。观察在mTurquoise2图像中可见的所有选定区域。
      2. 在ROI管理器中点击 测量，或点击 分析 | 测量。注意新打开的 结果 窗口，其中显示了mTurquoise2信号的测量结果。
      3. 通过点击 编辑 | 全选 将结果复制并粘贴到电子表格计算程序中，以便进一步计算。
      4. 点击激活β-catenin灰度值图像，并在ROI管理器中点击 显示全部 以可视化所选的全细胞ROI和背景区域。观察在β-catenin图像中可见的所有选定区域。
      5. 在ROI管理器中点击 测量，或点击 分析 | 测量。注意新打开的 结果 窗口，其中显示了全细胞β-catenin信号的测量结果。
      6. 通过点击 编辑 | 全选 将结果复制并粘贴到电子表格计算程序中，以便进一步计算。通过点击 更多 | 保存… 保存ROI管理器，以便将来参考，无需重复细胞选择。
4. 使用公式 1 计算活性β-catenin的校正总核荧光（CTNF）。
   CTNF = 积分密度 - (面积 × 平均背景区域灰度均值) (1)
5. 使用公式 2 计算mTurquoise2的校正总细胞荧光（CTCF）。
   CTCF = 积分密度 - (面积 × 平均背景区域灰度均值) (2)
6. 通过从步骤8.3.2.5获得的全细胞β-catenin值中减去步骤8.2.3.3获得的核β-catenin值，区分活性核β-catenin与胞质β-catenin，从而得到胞质非活性β-catenin。
   注意：确保测量在同一细胞内进行。
   1. 计算背景区域平均灰度强度的平均值。使用公式 1 和 2 计算CTNF和CTCF。将 IntDen（所选区域内所有像素的总和）视为积分密度，而非 RawIntDen。
   2. 如有需要，计算IntDen值的标准差以用于绘图。在统计分析中考虑最多200个独立细胞，使用Mann-Whitney U-检验。
7. 将结果绘制为单个数据点图，并将y轴标注为CTNF或CTCF值，单位为 相对荧光单位（RFU）。

结果

为了研究经典Wnt信号通路的作用，已测试了Axin2-mTurquoise2经典Wnt报告基因模型与β-catenin蛋白表达的联合应用。已知胸腺细胞较为脆弱，在胸腺细胞成熟过程的多个阶段中经典Wnt信号活性较低，且胞质与细胞核的比值较小；这些因素均会阻碍对胞质内mTurquoise2或β-catenin的检测。按照本方案，从小鼠胸腺中分离出Axin2-mTurquoise2胸腺细胞，并制备为单细胞悬液，用于流式细胞术及细胞离心涂片共聚焦显微镜分析（图1），以同时检测Axin2-mTurquoise2和总β-catenin的表达水平。

流式细胞术分析有助于鉴定不同胸腺细胞成熟阶段，并检测各细胞亚群中作为经典Wnt信号通路活性报告蛋白的mTurquoise2荧光蛋白的表达水平。在Axin2-mTurquoise2基因型中——野生型（wt）、杂合子（Tg/0）和纯合子（Tg/Tg）——mTurquoise2信号水平依次升高，反映了双阳性（DP）胸腺细胞内经典Wnt信号通路的激活程度（

讨论

目前有多种经典的Wnt报告基因可供选择，它们在报告基因的敏感性和实际表达的报告蛋白方面各不相同。利用人工引入的多串联TCF/LEF结合位点构建的报告基因模型可使用荧光报告蛋白；然而，这类转基因重复序列在繁育过程或长期的in vivo实验中可能发生丢失，并且可能受到邻近基因组序列中非Wnt信号的影响，从而干扰报告基因的表达。因此，尽管Axin2-LacZ在活细胞中使用较为困难，它仍然是目前最常用的报告基因类型。

Axin2-mTurquoise2 经典 Wnt 报告基因模型提供了与 Axin2-LacZ 相当的报告基因可靠性，同时具有明亮且相对稳定的荧光报告蛋白所带来的简便性。这种青色荧光蛋白适用于长期成像，并可轻松与最常用的抗体荧光染料联用²⁵。然而，在使用该模型时，应考虑其在三维穿透性和自发荧光方面可能存在的局限性²⁹。由于 β-catenin 的核内稳定化是经典 Wnt 报告基因的驱动机制，大多数分子实验需要检测总 β-catenin 或活性 β-catenin 的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACScantoII 流式细胞仪	BD Biosciences	不适用	序列号 V96300710。本方案中的流式细胞仪配置包含以下激光线路：405 nm 激光配 505 长通滤光片和 530/30 nm 带通滤光片，以及 470/20 nm 带通滤光片；488 nm 激光配 735 nm 长通滤光片和 780/60 nm 带通滤光片，670 nm 长通滤光片，655 nm 长通滤光片，610 nm 长通滤光片，550 nm 长通滤光片和 575/26 nm 带通滤光片，505 nm 长通滤光片和 530/30 nm 带通滤光片，以及 488/10 nm 带通滤光片；633 nm 激光线路配 735 nm 长通滤光片和 780/60 nm 带通滤光片，685 nm 长通滤光片，以及 660/20 nm 带通滤光片。
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μm 细胞筛网	Falcon/Corning	352350
Cytospin 4 型号 A78300101	Thermo Scientific	不适用
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNA酶 I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Greiner bio-one	227261
带细胞筛网卡扣盖的 Falcon 圆底聚苯乙烯试管	Fisher Scientific	352235
胎牛血清 (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	不适用	取决于来源
Fiji 软件	ImageJ	不适用	版本 1.53
滤纸卡（用于细胞离心涂片）	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 软件	Treestar	不适用	版本 10.5.3
防冻载玻片	Klinipath
Gibco IMDM 培养基	Fisher Scientific	12440053
HCX PL APO 40x 1.4 油镜	Leica Microsystems	不适用
疏水笔：Omm Edge 笔	Vector	不适用
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica Microsystems	不适用	本方案中的显微镜配置包括 HCX PL APO 40x/1.2 油浸物镜，8 位分辨率，1024 像素 × 1024 像素，400 Hz 扫描速度，针孔 68 µm，放大倍数 1.5，室温条件下操作。该系统配备 405 二极管激光器、氩离子激光器、DPSS 561 激光器、HeNe 594 激光器和 HeNe 633 激光器，以及 4 个混合探测器 (HyDs) 和 5 个光电倍增管 (PMTs)。
甲醇	VWR	1060091000
NaN3/叠氮化钠	医院药房	不适用
正常小鼠血清	自备小鼠	不适用
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Fisher Scientific	P36965
纯化小鼠抗-β-连环蛋白 (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 碘化物	ThermoFisher	T3605
透明指甲油	任意药店	不适用
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Zenon Alexa Fluor 568 小鼠 IgG1 标记试剂盒	ThermoFisher	Z25006