本文介绍了一种从多种哺乳动物（小鼠、大鼠、兔、猪和牛）中分离并转染原代虹膜和视网膜色素上皮细胞的实验方案。该方法非常适用于在多种实验条件下开展眼部基因治疗的研究，可用于可转化至人类的离体 分析以及 在体研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
分离、培养及遗传改造哺乳动物原代色素上皮细胞用于非病毒基因治疗
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致患者失明的最常见原因 >60年，影响全球约3000万人。年龄相关性黄斑变性是一种受环境和遗传因素共同影响的多因素疾病，其特征是视网膜色素上皮（RPE）细胞退化，继而导致光感受器降解，最终引起视网膜功能障碍。理想的治疗方法包括移植能够分泌神经营养因子的健康RPE细胞，以防止RPE细胞死亡和光感受器退化。由于虹膜色素上皮（IPE）细胞在功能和遗传上与RPE细胞具有相似性，且可通过创伤较小的活检获取，因此IPE细胞移植被提出作为退化RPE细胞的替代治疗方案。通过将少量细胞移植至视网膜下腔，即可实现神经营养因子的分泌 睡美人 (SB100X) 转座子介导的转染，导入编码色素上皮衍生因子（PEDF）和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的基因。我们建立了细胞的分离、培养和 SB100X介导的转染方法用于转染来自多种物种（包括啮齿类、猪和牛）的视网膜色素上皮（RPE）细胞和虹膜色素上皮（IPE）细胞。眼球被摘除后，去除角膜和晶状体以暴露虹膜和视网膜。使用自制刮匙从分离的虹膜上剥离IPE细胞。收获RPE细胞时，根据物种不同可能需要胰蛋白酶孵育。随后使用专用于RPE的刮匙将细胞悬浮于培养基中。接种后，细胞每周监测两次，待达到汇合状态后通过电穿孔进行转染。通过qPCR、WB、ELISA、免疫荧光及功能检测验证了基因整合、表达、蛋白分泌及生物学功能。根据不同物种，每只眼球可分离获得3万至500万个RPE细胞和1万至150万个IPE细胞。经基因修饰的细胞表现出显著的PEDF/GM-CSF过表达，具有减轻氧化应激的能力，并提供了一个灵活的实验系统 离体 分析和 体内 可转化至人类的研究，以开发眼部基因治疗策略。
引言
本研究团队致力于开发基于视网膜色素上皮细胞（RPE）和虹膜色素上皮细胞（IPE）的非病毒基因疗法，用于治疗神经视网膜退行性疾病，即年龄相关性黄斑变性（AMD）。此类疗法的临床前建立需要可转化至人类的体外模型。因此，本研究所提出的目标是提供原代RPE和IPE细胞的分离、培养及基因工程操作的技术方案。建立多种物种色素上皮（PE）细胞分离方法的科学依据在于，能够更可靠地验证该方法的安全性和有效性，并提高其可重复性与可转化性。目前可用的人RPE细胞系ARPE-19与原代细胞存在差异（例如色素含量较低），因此在临床前分析中的应用价值有限1。此外，非人哺乳动物细胞购买成本较低且可获得数量更大；人供体眼组织虽可从多家眼库获取，但来源有限且价格昂贵。最后，根据规定，新的先进治疗医药产品（ATMP，即细胞、组织或基因治疗医药 产品）在用于患者之前，需在至少两种不同物种中进行测试，而这些体内研究需要制备同种异体细胞移植物。
视网膜神经退行性疾病是工业化国家致盲的首要原因，包括年龄相关性黄斑变性（AMD）等常见疾病以及视网膜色素变性等罕见疾病，这些疾病最终因视网膜细胞死亡而导致失明。在某些情况下，视网膜色素上皮细胞（RPE）、光感受器和视网膜神经节细胞（RGC）的损伤可以被延缓，但目前尚无治愈性疗法。先进治疗药物（ATMP）具有纠正基因缺陷、整合治疗性基因或替代退化细胞的潜力，从而为AMD等疾病开发再生性....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
涉及动物的实验方案由经过认证的人员执行，并在获得瑞士日内瓦州安全、就业与健康部门（DSES）动物实验管理局批准后进行，同时遵循ARVO关于眼科与视觉研究中使用动物的声明（批准号：GE/94/17）。成年健康的Brown Norway大鼠、C57BL/6小鼠和新西兰白兔通过腹腔注射0.9% NaCl稀释的戊巴比妥钠（150 mg/kg）过量麻醉处死，牺牲后立即摘除眼球。猪眼和牛眼于屠宰后6小时内从当地屠宰场获取，并在冰上运输至实验室。
1. 准备前
- 配制完全培养基（DMEM/Ham's F12，添加10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素/80 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B）。将培养基、1× PBS和0.25%胰蛋白酶（如需要）置于37 °C水浴中预热。
- 在超净工作台内铺无菌巾，以准备无菌操作区域。将所有需要的无菌器械和材料放入超净工作台内。
注意：仅眼球摘除以及去除残留的肌肉组织和皮肤的操作可在超净工作台外进行，其余所有步骤必须在超净工作台内完成。
2. 大鼠/小鼠腹膜腔细胞的分离
- 动物安乐死后，使用弯剪和科利布里镊子摘除眼球。用剪刀和镊子（非无菌）清除眼球上残留的肌肉组织和皮肤。
注意：用于摘除和清洁眼球的剪刀和镊子的尺寸取决于物种（例如，大鼠和小鼠所用器械将....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
从不同哺乳动物物种中分离PE细胞
采用上述实验方案，已成功从五种不同物种中分离并培养了IPE和RPE细胞。每次实验所获得的细胞数量取决于物种及眼球大小（表1）。如图1所示，细胞呈现典型的PE细胞形态和色素沉积（所展示的兔源细胞除外，其来源于白化新西兰白兔（NZW））。在分离后21天，细胞达到汇合状态，可用于后续实验（例如转染）。需要注意的是，所有物种来源的细胞培养物均被持续监测和控制长达2年，证实其形态正常且外源基因表达稳定（数据未显示）。
通过RT-qPCR和免疫组织化学排除了去分化、细胞应激以及基因表达的变化。在转染的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞）中分析了一组基因（VEGF、CRALBP、CATD、ZO-1、KRT8），证实其具有正常的视网膜色素上皮表达模式1；通过RPE65的免疫荧光染色也在原代牛虹膜色素上皮细胞中得到了验证（图2
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
建立标准化的PE细胞分离与培养方法，对于开发视网膜变性疾病的新疗法至关重要。通过本文所述的方案，可成功从不同物种中分离PE细胞，并进行长期培养（迄今为止，最长的培养时间已达2年1,38）；在此过程中观察到了典型的PE细胞形态、色素沉着及功能（图1，图2）。需注意的是，在进行纯RPE细胞培养时，必须彻底去除视网膜，以避免神经视网膜细胞的污染；而对于IPE细胞，则应按照方案所述，从虹膜上完全去除睫状体。细胞在相对较短的时间内即可达到汇合状态（约21天），此后即可用于治疗性基因转染或其他实验（如暴露于毒性物质、蛋白质等）。此外，这些方案不仅对临床前的体外和体内测试至关重要，也对人类临床应用具有重要意义，即验证经转染的PE细胞移植效果；特别是我们团队正在开发的针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗方法，其中将从患者虹膜活检中分离IPE细胞，立即进行基因转染，并在同一手术过程中.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Gregg Sealy和Alain Conti提供的出色技术支持。本工作由欧盟第七框架计划、瑞士国家科学基金会以及Schmieder-Bohrisch基金会资助。Z.I.获得了欧洲研究理事会高级资助[ERC-2011-ADG 294742]的支持，B.M.W.获得了富布赖特研究奖学金和瑞士政府卓越奖学金的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔板 | Corning | 353043 | |
| 24孔板 | Corning | 353047 | |
| 48孔板 | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6孔板 | Greiner | 7657160 | |
| 贝塔碘 | Mundipharma | ||
| Bonn显微镊子（平头） | |||
| Colibri镊子（无菌） | |||
| CytoTox-Glo细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham's F12培养基 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| 手术巾（无菌） | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| 电穿孔缓冲液3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| 镊子（不同规格）（无菌） | |||
| 纱布敷料 | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| 氯化钠（0.9%） | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| 针头（18G） | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon转染试剂盒10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon转染系统 | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| 血细胞计数板（Neubauer型） | Marienfeld-superior | 640010 | |
| 巴斯德吸管（火焰抛光） | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| 戊巴比妥（Thiopental Inresa） | Ospedalia AG | 31408025 | |
| 培养皿 | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor等，2018年。由Scherman教授和Marie教授惠赠 | ||
| pSB100X（250 ng/µL） | Mátés等，2009年。由Izsvak教授提供 | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen等，2012年 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His质粒DNA（250 ng/µL） | 本实验室克隆 | ||
| pT2-CMV-PEDF-His质粒DNA（250 ng/µL） | Pastor等，2018年 | ||
| 10号手术刀片 | Swann-Morton | 501 | |
| 11号手术刀片 | Swann-Morton | 503 | |
| 尖-尖头弯型超细Bonn剪刀（无菌） | |||
| 尖-尖头直型超细Bonn剪刀（无菌） | |||
| Tali图像型细胞计数仪 | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| 胰蛋白酶0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| 胰蛋白酶5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas弹簧剪刀（弯型）（无菌） |
参考文献
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
