Method Article

原代小鼠胚胎腭间充质细胞的分离和延时成像，以分析集体运动属性

DOI:

10.3791/62151

⸱

February 13th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

In This Article

Summary

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我们提出了一种分离和培养原代小鼠胚胎腭间充质细胞的方案，用于二维（2D）生长和伤口修复测定的延时成像。我们还提供了分析延时成像数据的方法，以确定细胞流形成和方向运动。

Abstract

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腭的发育是一个动态过程，它涉及舌头旁边的双侧腭架的垂直生长，然后是舌头上方的抬高和融合。这个过程中的缺陷导致腭裂，这是一种常见的出生缺陷。最近的研究表明，腭架抬高涉及重塑过程，该过程将大陆架的方向从垂直转变为水平。腭架间充质细胞在这种动态重塑中的作用一直难以研究。基于延时成像的定量分析最近已被用于表明原代小鼠胚胎腭间充质（MEPM）细胞可以自我组织成集体运动。定量分析可以识别来自具有上颚抬高缺陷的小鼠模型的突变MEPM细胞的差异。本文描述了从E13.5胚胎中分离和培养MEPM细胞的方法 - 特别是用于延时成像 - 并确定集体运动的各种细胞属性，包括河流形成，形状排列和方向持久性的测量。它假设MEPM细胞可以作为研究腭架间充质在动态抬高过程中的作用的代理模型。这些定量方法将使颅面领域的研究人员能够评估和比较对照细胞和突变细胞的集体运动属性，这将增加对腭架抬高期间间充质重塑的理解。此外，MEPM细胞为研究集体细胞运动提供了一种罕见的间充质细胞模型。

Introduction

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腭发育已被广泛研究，因为腭发育缺陷导致腭裂 - 一种常见的出生缺陷，发生在孤立的病例或数百种综合征的一部分1，2。胚胎腭的发育是一个动态过程，涉及胚胎组织的运动和融合。这个过程可以分为四个主要步骤:1）诱导腭架，2）舌头旁边的腭架垂直生长，3）舌头上方腭架的升高，以及4）中线1，3，4的腭架融合。在过去的几十年里，已经鉴定出许多小鼠突变体表现出腭裂5，6，7，8。这些模型的表征表明腭架诱导，增殖和融合步骤存在缺陷;然而，腭架抬高缺陷很少见。因此，了解腭架抬高的动态是一个有趣的研究领域。

对一些具有腭架抬高缺陷的小鼠突变体的仔细分析导致目前的模型显示，腭架的前部区域似乎向上翻转，而腭架的垂直到水平运动或"重塑"发生在上颚的中后区域

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Protocol

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所有涉及动物的实验均按照KUMC机构动物护理和使用委员会批准的协议进行，符合其指南和法规（协议编号:2018-2447）。

1. 收获E13.5胚胎

  1. 使用CO2 吸入室或机构动物护理和使用委员会批准的程序对怀孕的雌性小鼠实施安乐死。立即进行解剖。
  2. 通过去除皮肤和腹膜来暴露腹腔的下半部分。切除含有E13.5胚胎的子宫的两个角。
  3. 将子宫短暂置于预热的37°C无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，以冲洗掉多余的血液，头发或其他碎屑。将子宫置于充满无菌PBS的无菌10厘米培养皿中。
  4. 使用小剪刀，沿着子宫的长度穿过子宫壁，露出每个胚胎，仍然在其卵黄囊中。去除胚胎周围的卵黄囊，但如果需要，请将其保存以进行基因分型。当胚胎被移除时，将每个胚胎放在充满PBS的12孔板中。

2. 从胚胎中解剖腭架（图1）

注意:在处理每个胚胎后，首先将器械放入100%乙醇（EtOH）的烧杯中，然后在350°C的仪器灭菌器中灭菌10秒，然后在100%EtOH的第二个烧杯中冷却它们，对不锈钢解剖器械（见 材料表）进行灭菌。

  1. 使用无菌穿孔的勺子，将胚胎放入装有MEPM培养基的新10厘米培....

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Results

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腭架的解剖如图1所示。切口的顺序旨在最大限度地减少组织的滑移。在取下头部（图1A，B）后，下颚被移除（图1B，C）。头部上部（图1C，D）的切口是用来稳定倒置时的组织（图1E）以可视化（图1E，虚线），捏（图1F）和切除（图1G）腭架。

从单个胚胎中切除的腭架对胰蛋白酶消化并在35mm培养皿或6孔培养皿的孔中培养。较大的培养皿不是首选，因为细胞密度太低，无法实现最佳生长。汇合后.......

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Discussion

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腭架高程构成垂直到水平的重塑事件1、3、4、9、11。据推测，这种重塑过程需要腭架间充质细胞协调行为。对野生型MEPM细胞的分析表明，这种细胞行为是内在的，可以定量21。因此，这些测定可用于揭示新的和现有的腭裂小鼠模型中的原发性腭架抬高缺陷。第1节和第2节中概述的方法应允许研究人员分离，培养和冷冻原代MEPM细胞的等分试样。然后，这些细胞可用于各种应用，包括此处描述的2D培养和伤口修复测定。2D培养与延时成像相结合时，提供了一种简单的方法来确定一系列细胞密度的基本细胞属性。这里介绍的是一种评估细胞比对和细胞流形成的方法，它们是集体细胞运动的属性（图4）。伤口闭合测定通常用于评估细胞迁移

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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该项目部分得到了美国国立卫生研究院拨款DE026172（I.S.）和GM102801（A.C.）的支持。I.S.还得到了生物医学卓越研究中心（COBRE）赠款（国家普通医学科学研究所P20 GM104936），堪萨斯州IDeA生物医学研究卓越网络赠款（国家普通医学科学研究所P20 GM103418）和堪萨斯州智力和发育障碍研究中心（KIDDRC）赠款（U54 Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所）的部分支持， HD090216）。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
烧杯，250 mL （x2）Fisher ScientificFB-100-250
CO2Matheson GasUN1013
锥形管，15 mL （x1）Midwest ScientificC15B
Debian作系统时图像的计算分析
Dulbecco 改良的 Eagles 中/高葡萄糖，4 mML-谷氨酰胺和丙酮酸钠Cytiva 生命科学SH30243.01
乙醇，100%Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisher ScientificAMAFD1000
EVOS 台式培养箱ThermoFisher ScientificAMC1000
EVOS 台式容器支架，多孔板ThermoFisher ScientificAMEPVH028
牛血清Corning35-010-CV
细点 #5 不锈钢镊子 （x2）Fine Science Tools11295-10解剖
仪器 消毒珠浴Fine Science Tools18000-45
微量解剖管，1.5mLAvant2925
微量解剖不锈钢剪刀，直RobozRS-5910解剖
NucBlue （Hoechst） Live Ready 探针ThermoFisher ScientificR37605
青霉素链霉素溶液，100x康宁30-002-CI
硅胶插件，2 孔Ibidi80209
小穿孔不锈钢勺精细科学工具MC17C解剖
弹簧剪刀，4 mm精细科学工具15018-10
无菌 10 cm 培养皿康宁430293
无菌 12 孔板PR1MA667512
无菌 6 孔板Thermo Fisher Scientific140675
无菌 PBS康宁21-031-CV
无菌塑料球移液管ThermoFisher Scientific202-1S
胰蛋白酶，0.25%ThermoFisher Scientific25200056
延胎

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. La....

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