我们介绍了一种分离和培养原代小鼠胚胎腭部间充质细胞的方案，用于进行二维（2D）生长和伤口修复实验的延时成像。同时提供了分析延时成像数据的方法，以确定细胞流的形成及定向运动能力。
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方法文章
分离与原代小鼠胚胎腭间充质细胞的延时成像以分析集体运动特性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
腭的发育是一个动态过程，包括两侧腭突在舌侧垂直生长，随后抬升并融合至舌上方。该过程中的缺陷可导致腭裂，这是一种常见的出生缺陷。近期研究表明，腭突抬升涉及一个重塑过程，使腭突的方向从垂直转变为水平。腭突间充质细胞在此动态重塑过程中的作用一直难以研究。基于延时成像的定量分析最近被用于显示小鼠胚胎原代腭间充质（MEPM）细胞能够自组织形成集体性运动。定量分析可识别出具有腭突抬升缺陷的小鼠模型中突变型MEPM细胞的差异。本文描述了从E13.5胚胎中分离和培养MEPM细胞的方法，特别适用于延时成像，并确定集体运动的各种细胞特性，包括细胞流形成、形态排列以及运动方向持续性的量化指标。本文提出，MEPM细胞可作为研究腭突间充质在抬升动态过程中作用的替代模型。这些定量方法将使颅面研究领域的研究人员能够评估和比较对照细胞与突变细胞中集体运动的特性，从而加深对腭突抬升过程中间充质重塑的理解。此外，MEPM细胞为研究集体细胞运动提供了一种罕见的间充质细胞模型。
引言
腭的发育已被广泛研究，因为腭发生过程中的缺陷会导致腭裂——一种常见的出生缺陷，可单独出现，也可作为数百种综合征的一部分发生。1,2胚胎腭的发育是一个涉及胚胎组织运动和融合的动态过程。该过程可分为四个主要阶段：1）腭突的诱导，2）腭突在舌侧垂直生长，3）腭突抬升至舌上方，4）腭突在中线处融合。1,3,4在过去几十年中，已鉴定出许多表现出腭裂的小鼠突变体5,6,7,8. 对这些模型的表征已 表明在腭突诱导、增殖和融合阶段存在缺陷；然而，腭突抬升缺陷却较为罕见。因此，探究腭突抬升的动态过程成为一个引人关注的研究领域。
对一些具有腭突提升缺陷的小鼠突变体进行细致分析后，目前的模型表明，腭突的最前部区域似乎发生向上翻转，而在腭部中后区域则发生从垂直方向到水平方向的运动或 “重塑”""
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方案
所有涉及动物的实验均依照堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准的方案进行，并遵循其指南和规定（方案编号：2018-2447）。
1. 收集 E13.5 胚胎
- 使用 CO₂ 处死怀孕雌性小鼠2 吸入式麻醉室或经机构动物护理与使用委员会批准的程序。立即进行解剖。
- 通过去除皮肤和腹膜暴露腹腔下半部分。切除包含E13.5胚胎的两侧子宫角。
- 将子宫短暂置于预热的 37 °C 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗掉多余的血液、毛发或其他碎屑。将子宫置于盛有无菌PBS的无菌10 cm培养皿中。
- 使用小剪刀沿子宫的长度方向剪开子宫壁，以暴露每个仍处于卵黄囊中的胚胎。移除包围胚胎的卵黄 sac，但如有需要，应保留用于基因分型。每取出一个胚胎后，立即将其放入含有 PBS 的 12 孔板的独立孔中。
2. 从胚胎中分离腭突（图1）
注意：每次处理完一个胚胎后，需对不锈钢解剖器械（参见材料表）进行灭菌，先将其放入盛有100%乙醇（EtOH）的烧杯中，然后置于350 °C的器械灭菌器中加热10秒，最后再放入第二个盛有100%乙醇的烧杯中冷却。
- 使用无菌的....
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结果
腭突的解剖过程如图1所示。切口顺序的设计旨在最大限度减少组织滑动。在移除头部后（图1A、B），去除下颌（图1B、C）。对头部上部进行切开（图1C、D），以便将组织倒置后固定（图1E），从而观察（图1E，虚线）、夹取（图1F）并切除腭突（图1G）。
将单个胚胎中切除的成对腭突在35 mm培养皿或6孔板的孔中进行胰蛋白酶消化并培养。不推荐使用较大的培养皿，因为细胞密度过低，不利于最.......
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讨论
腭突板抬升是一种从垂直方向到水平方向的重塑事件1,3,4,9,11。据推测，这一重塑过程需要腭突板间充质细胞协调一致地活动。对野生型MEPM细胞的分析表明，这种细胞行为是内在的，并且可以被量化21。因此，这些检测方法可用于揭示新建立或已有腭裂小鼠模型中腭突板抬升的原发性缺陷。第1和第2节中所述方法可使研究人员分离、培养并冻存多份原代MEPM细胞。这些细胞可用于多种实验应用，包括本文所述的二维培养和伤口修复检测。二维培养结合延时成像，提供了一种简单的方法，可在不同细胞密度条件下测定细胞的基本特性。本文介绍了一种评估细胞排列和细胞流形成的方法，这两者是细胞集体运动的特征（图4）。伤口闭合检测常用于评估细胞迁移能力.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目部分得到了美国国立卫生研究院基金 DE026172（I.S.）和 GM102801（A.C.）的支持。I.S. 还部分得到了生物医学研究卓越中心（COBRE）基金（美国国立普通医学科学研究所 P20 GM104936）、堪萨斯生物医学研究卓越创新网络基金（美国国立普通医学科学研究所 P20 GM103418）以及堪萨斯智力与发育障碍研究中心（KIDDRC）基金（尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所 U54 HD090216）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 250 mL 烧杯（x2） | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| 15 mL 圆锥管（x1） | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian 操作系统 | 延时图像的计算分析 | ||
| 含 4 mM L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基/高糖 | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| 乙醇，100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS 载台培养箱 | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS 载台容器架，多孔板用 | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| 胎牛血清 | Corning | 35-010-CV | |
| 精细 #5 不锈钢镊子（x2） | Fine Science Tools | 11295-10 | 解剖 |
| 器械灭菌珠浴仪 | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 1.5 mL 微型离心管 | Avant | 2925 | |
| 直头不锈钢显微解剖剪 | Roboz | RS-5910 | 解剖 |
| NucBlue（Hoechst）活细胞即用型探针 | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| 青霉素-链霉素溶液，100x | Corning | 30-002-CI | |
| 硅胶插件，双孔 | Ibidi | 80209 | |
| 小型带孔不锈钢勺 | Fine Science Tools | MC17C | 解剖 |
| 弹簧剪，4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| 无菌 10 cm 培养皿 | Corning | 430293 | |
| 无菌 12 孔板 | PR1MA | 667512 | |
| 无菌 6 孔板 | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| 无菌 PBS | Corning | 21-031-CV | |
| 无菌塑料球状移液管 | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| 胰蛋白酶，0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
参考文献
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- La....
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重印与许可
