一种新的静态平台被用于在天然细胞环境中表征蛋白质结构及相互作用位点，该方法利用了一种称为细胞内快速光化学氧化蛋白质（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术。
本文内容
摘要
摘要
结合质谱（MS）的快速光化学氧化蛋白质技术（FPOP）已成为结构蛋白质组学中一种不可或缺的工具，可用于研究蛋白质相互作用、结构以及蛋白质构象动态变化，其原理基于溶剂可及性的变化。近年来，FPOP作为一种羟基自由基蛋白质足迹技术（HRPF），其应用范围已扩展至活细胞培养体系中的蛋白质标记，从而能够在复杂的细胞环境中研究蛋白质相互作用。在细胞内进行的蛋白质修饰可揭示配体诱导的结构变化，或伴随蛋白质复合物形成而发生的构象变化，且全部处于真实的细胞背景下。以往的蛋白质足迹实验通常采用传统的流动式系统，并结合248 nm的KrF准分子激光器，通过过氧化氢的光解产生羟基自由基，每份细胞样品的分析需耗时20分钟。为了实现时间分辨的FPOP实验，研究人员率先开发了一种基于6孔板的细胞内FPOP（IC-FPOP）新平台。在当前系统中，单次激光脉冲即可辐照整个孔，从而大幅缩短FPOP实验的时间框架，使单次分析时间减少至20秒，较之前缩短了60倍。这一显著缩短的分析时间使得研究人员能够以时间依赖的方式探究细胞机制，例如生化信号级联反应、蛋白质折叠过程以及差异性实验（如无药物 vs. 药物结合状态）。该新型仪器名为带可移动XY平台的培养箱（PIXY），允许用户直接在光学平台上进行细胞培养和IC-FPOP操作，其集成的培养箱具备温度、CO2和湿度控制功能。该平台还包括定位平台、蠕动泵以及用于激光束引导的镜面光学元件。PIXY系统中的IC-FPOP条件，如光学配置、流速、瞬时转染参数以及H2O2浓度，均已优化并通过同行评审。系统各组件的自动化将减少人为操作，提高通量。
引言
蛋白质足迹技术能够揭示有关蛋白质结构的深刻信息。这些基于质谱（MS）的关键结构生物学技术是质谱分析工具箱的重要组成部分。这些方法通过共价标记来探测蛋白质的高级结构（HOS）及其协同效应1,2,3,4。快速光化学氧化蛋白质法（FPOP）利用羟基自由基对氨基酸的溶剂可及侧链进行氧化修饰5,6（表1）。该方法采用波长为248 nm的准分子激光器对过氧化氢（H2O2）进行光解，从而生成羟基自由基。理论上，20种氨基酸中的19种均可发生氧化修饰，仅甘氨酸（Gly）例外。然而，由于不同氨基酸与羟基自由基的反应速率各异 ，实验中仅观察到其中一部分氨基酸被修饰。尽管如此，该方法仍具备在整个蛋白质序列范围内进行分析的潜力5。FPOP在微秒时间尺度上对蛋白质进行修饰，因此适用于研究具有快速解离速率的弱相互作用。配体结合或蛋白质构象变化会引起溶剂可及性的改变，因此该方法的核心优势在于比较蛋白质在多种状态下的标记模式（例如，无配体状态与结合配体状态的比较）。因此，FPOP已成功用于鉴定蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体相互作用位点以及构象变化区域7,8,9,10。FPOP方法已从纯化蛋白质体系的研究拓展至细胞内分析。细胞内FPOP（IC-FPOP）可在细胞内对上千种蛋白质进行氧化修饰，从而提供全蛋白质组范围的结构信息11,12。传统的IC-FPOP平台采用流动系统，使细胞以单列形式依次通过激光束。该系统的设计使每个细胞都能接受均等的激光照射，从而使发生氧化标记的蛋白质数量提升了13倍12。然而，流动系统的一个局限在于单次样品实验所需时间较长：包括10分钟的照射期（在此期间发生修饰）以及额外10分钟的清洗周期。IC-FPOP的时间限制使其难以适用于研究寿命短暂的蛋白质折叠中间体，或生物化学信号级联中相互作用网络的瞬时变化。这一时间上的局限促使研究人员设计出一种具备更高通量的新型IC-FPOP平台。
为了在天然细胞环境中准确测量蛋白质的高级结构，新设计允许直接在激光平台上进行细胞培养，从而使IC-FPOP实现高通量。该装置还可最大限度减少对细胞环境的干扰，相比之下，在使用流动系统的IC-FPOP中，贴壁细胞必须从基质上剥离。新平台可在无菌培养系统中进行IC-FPOP，该系统采用由CO2和温度控制的顶置式培养室，并结合了用于激光束引导的镜面光学组件、实现XY方向运动的定位系统以及用于化学试剂交换的蠕动泵。该用于实施IC-FPOP的新平台被称为“带可移动XY载物台的培养箱平台”（Platform Incubator with Movable XY Stage, PIXY）（图1）。在PIXY中，IC-FPOP在平台培养箱室内六孔板中培养的人源细胞上进行。在此配置下，激光束通过与光束兼容的反射镜向下反射至培养板；当承载培养箱的定位载物台在XY平面移动时，激光束被精确对准，每次仅照射一个孔。验证研究表明，与流动系统相比，PIXY可更快地完成IC-FPOP，并导致每种蛋白质的氨基酸修饰数量增加。这一新型IC-FPOP平台的开发将拓展从细胞实验中获得的知识深度13。
方案
1. 带可移动XY平台的培养箱组装
注意：新平台包括培养系统、定位平台及控制器、蠕动泵、248 nm KrF 准分子激光器，以及组装在英制光学面包板上的光学反射镜。
- 组装孵育系统：温度控制单元、二氧化碳控制单元、加湿器、空气泵和触摸监控系统（图 2A-E）。
注意：制造商提供详细的组装说明。在将细胞放入孵育箱培养之前，孵育系统必须稳定在 5% CO2、37 °C 和 85% 湿度。这些参数可能因细胞系而异。 - 组装定制的六孔板孵育器、纳米定位驱动平台和 XY 驱动平台。前者分别通过螺钉固定于后者之上。
注意：制造商提供详细的组装说明。 - 通过 RS-232 电缆将四个蠕动泵以“级联”方式连接，并使用 RS-232 转 USB 电缆连接至控制计算机。将内径为 3.18 mm 的聚合物管路（例如 Tygon）连接至每个泵通道的滚轮上。
注意：每台泵有四个滚轮。滚轮的方向和流速需手动调节。 - 在每根内径为 3.18 mm 的聚合物管末端安装 1/16" × 1/8" 接头。将接头的 1/16" 端插入内径为 1.59 mm 的聚合物管中，再将聚合物管通过定制端口引入孵育器内。将管路的另一端置于 IC-FPOP 实验过程中将要灌注的溶液中。
注意：灌流管路在孵育器周围设有 36 个定制端口，可容纳所有试剂所用的管路。 - 将一个 50 mm、248 nm、45° 氙准分子激光线反射镜安装在用于 Ø2" 光学元件的运动学镜架中，并将其固定在距 248 nm 激光出射口 10-11 个网格点的光学平台上。在孵育器另一侧，将第二个反射镜以 90° 角相对于第一个反射镜放置，并将其向下倾斜约 45°，以引导激光束进入孵育器（图 2F-J）。
2. 通过集成软件实现系统的同步与初始自动化
- 安装最新版本的集成软件，以控制驱动器和泵。
- 参考泵的使用手册，将泵的名称从“5”开始依次递增命名。可通过集成软件中的 手动控制 子程序向泵系统发送命令。
注意：将泵设置为通道模式会自动将泵的命名规则更改为组别 1、2、3 和 4，对应四个泵通道。 - 打开用于自动化平台培养箱的集成软件程序。
- 在标有 泵用串口 的下拉菜单中，选择与泵系统 USB 电缆对应的正确 USB 串口设备名称（例如 COM4）。
- 点击 脚本构建器 按钮，以编辑或创建平台培养箱自动化的脚本。点击 保存脚本 将序列保存为文本文件（图 3A）。
注意：脚本构建器提供用户界面，可用于定义泵编号、方向、流速、体积、管路直径、通道模式及定时延迟等参数。 - 若在编写脚本时需要使用通道模式，则脚本中必须包含专门用于将泵切换至或退出通道模式的步骤，后续对应泵通道的操作步骤必须标记为泵 1–4。
注意：这可确保在平台培养箱运行脚本期间，不会有两个泵同时处于通道模式，并且在向所需通道发送命令后，每个泵都会切换回传统模式。 - 点击 读取脚本 按钮，并选择适用于平台培养箱运行的相应脚本文件。
- 将 运行序列 按钮切换至开启位置（绿色），以执行脚本，然后点击 启动 按钮（图 3B）。
3. 在平台培养箱中培养细胞
注意：细胞必须在实验前一天于细胞培养罩内的无菌条件下放置于平台培养箱中。
- 从纳米定位台上拧下平台培养箱，并断开温度、气体和加湿管线。用70%乙醇喷洒培养箱后，将其放入细胞培养操作台中。
- 在转接前，将细胞在T-175培养瓶中培养至约80-90%汇合度。
注意：汇合度用于衡量细胞培养皿或培养瓶中细胞的数量/覆盖面积。 - 移除培养基，并用缓冲液清洗。
- 按照制造商的说明书，使用胰蛋白酶-EDTA消化使细胞脱离。
- 将细胞重悬于8 mL培养基中，并进行细胞计数。
- 在每孔中接种约90-95 μL重悬的细胞至预先包被纤维连接蛋白/胶原蛋白14的六孔板中。此体积可确保次日每孔达到80-90%汇合度（约120万个细胞）。
注意：六孔板在接种前必须包被胶原蛋白。IC-FPOP实验过程中试剂以快速流速灌注，包被可防止细胞因试剂灌注而提前脱落。 - 将接种后的六孔板放入平台培养箱中，并盖上石英盖。
注意：在设计与开发过程中，将玻璃培养箱盖更换为石英材质，以兼容紫外激光光源。 - 将平台培养箱重新安装并固定到纳米定位驱动台上，重新连接温度、气体和加湿管线。
- 让细胞过夜生长至汇合。
注意：以下细胞培养步骤为可选步骤，适用于需对人源细胞进行瞬时转染的实验。这些步骤用于评估在细胞培养条件下转染的效率。 - 使用商用阳离子脂质体转染试剂盒，将编码嵌合蛋白GCaMP2的质粒转染至HEK 293细胞中。
- 在两个六孔板中对HEK293T细胞进行GCaMP2的瞬时转染。
- 将其中一个六孔板放入平台培养箱中孵育，另一个六孔板放入标准CO2培养箱中孵育。
- 通过荧光显微镜进行荧光成像，比较各板内的转染效率。
4. 配制淬灭缓冲液和 H2O2
- 配制 100 mL 淬灭缓冲液，其中含有 125 mM N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）和 125 mM N, N′-二甲基硫脲（DMTU）。
注：DMTU 和 PBN 为自由基清除剂，具有细胞膜通透性。 - 将 H2O2 稀释至 200 mM。每个样品需要 6 mL H2O2 以完全浸没每个孔底部的细胞层。
注：淬灭缓冲液需在实验前一天配制，并于 4 °C 避光过夜保存。H2O2 需在实验当天稀释。
5. 为 IC-FPOP 设置平台培养箱
注意：平台培养箱必须在无菌条件下组装。请在无菌细胞培养罩内组装培养箱。
- 将平台培养箱从定位载物台上拧下，并断开温度、气体和加湿管线。
- 用70%乙醇喷洒培养箱后，将其放入细胞培养超净台中。
- 从平台培养箱中取出六孔板，盖上原装板盖，并在显微镜下确认细胞汇合度。
- 确认细胞汇合度后，将含有融合细胞的六孔板重新放回细胞培养超净台内的平台培养箱中。
- 通过嵌入式接口，向每个孔中插入三根预先裁剪（15 cm）的1.59 ID聚合物管。将管道沿孔壁推入，并用定制的3D打印环固定。
注意：六个直径为33 mm的PLA丝材3D打印环为定制设计，用于将管路固定在板壁上，同时避免干扰细胞或阻碍激光脉冲。 - 用培养箱的石英盖盖住平台培养箱。将顶部培养箱重新安装并固定到定位系统上，重新连接温度、气体和加湿管线。
- 将1.59 ID聚合物管连接至1/16"外径的1/16×1/8"接头端口。
6. 在平台培养箱中进行 IC-FPOP
- 为泵吸液准备集成软件程序。使用一台蠕动泵（泵 8）完全移除所有六个孔中的细胞培养基。
- 对另外三台蠕动泵（泵 5-7）的每个通道进行溶剂预灌注。分别向交替的管路中灌注 H2O2 和淬灭缓冲液，直至试剂到达孵育器端口。
- 通过反射镜确认激光束已正确调整角度并可无阻碍地到达孵育器。
注意：使用激光时必须佩戴激光防护眼镜。在调整/对准过程中不得提前照射细胞。对准时应使用硬纸板完全覆盖石英盖板。此外，可在白纸上打印六孔板的轮廓图，进一步确认激光束是否准确照射到每个孔的中心。对准时使用连续脉冲模式，并设置为最低频率和能量。 - 使用外部传感器检测激光能量。采用单次激光脉冲，能量为 160 mJ，频率为 50 Hz，电压为 27 kV。
注意：后续步骤需要使用计时器。 - 在确认光束对准后，准备用于泵灌注的集成软件程序。
- 启动计时器的同时，按下集成软件泵程序中的开始按钮。
- 在计时器显示 6-10 秒时，以 35 mL/min 的流速向第一孔灌注 200 mM H2O2。
注意：泵启动灌注前有五秒延迟。激光触发脉冲也需要七秒时间。激光脉冲必须紧随 H2O2 灌注之后立即进行。 - 在计时器显示 5 秒时，按下激光软件上的开始按钮，使激光脉冲在 11 秒时触发。
- 激光脉冲结束后，立即以 35 mL/min 的流速向第一孔灌注 125 mM 淬灭溶液。手动移动定位平台，使下一个孔与激光束对齐。
- 重复上述步骤 6.5-6.9，直至所有孔均完成处理。
注意：IC-POP 实验以技术重复三次进行，包括三个激光处理样本和三个非激光处理样本。一张处理完成的六孔板构成一个生物学重复。 - 在细胞培养超净台中，使用细胞刮将各孔中的细胞转移至各自的 15 mL 圆锥管中。以 1,200 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，并将细胞重悬于 100 μL RIPA 裂解缓冲液中。
- 将细胞转移至各自的 1.2 mL 聚丙烯管中。
- 将所有样品在液氮中速冻后，置于 -80 °C 冰箱中保存备用。
注意：本方案可在此处暂停。
7. 蛋白质提取、纯化与蛋白酶解
- 将样品解冻，并在热块中 95 °C 加热 5 分钟。
- 加热后，在冰上冷却 5 分钟。
- 向细胞裂解液中加入 25 单位的核酸酶，以降解单链、双链、线性和环状 DNA 及 RNA，并在室温下孵育 15 分钟。
- 在 4 °C 条件下，以 16,000 × g 离心样品 10 分钟。
- 收集上清液并转移至洁净的聚丙烯管中。
- 使用比色法蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。
- 取 100 µg 样品转移至洁净的聚丙烯管中，并用细胞裂解缓冲液补足至 100 µL。
- 在 50 °C 条件下，用 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）还原样品 45 分钟。
- 将样品在室温下冷却 10 分钟。
- 在室温下用 50 mM 碘乙酰胺（IAA）烷基化 20 分钟。
NOTE: IAA 需避光保存 - 加入 460 µL 预冷（-20 °C）的丙酮。涡旋混匀样品后，置于 -20 °C 过夜。
NOTE: 本方案可在此处暂停。 - 次日，在 4 °C 条件下，以 16,000 × g 离心样品 10 分钟。
- 小心去除丙酮，避免扰动蛋白沉淀。
- 加入 50 µL 预冷（-20 °C）的 90% 丙酮。涡旋混匀样品后，在 4 °C 条件下再以 16,000 × g 离心 5 分钟。
- 去除丙酮，让样品干燥 2–3 分钟。
- 用 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）重悬蛋白沉淀。
- 将质谱级胰蛋白酶（20 µg 储液）溶于 40 µL 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）中，并向每个样品中加入 2.5 µg 胰蛋白酶。
- 在 37 °C 下孵育样品过夜。
NOTE: 本方案可在此处暂停。 - 使用比色法肽段检测试剂盒测定肽段浓度。
- 用 5% 甲酸淬灭样品。
- 将 10 µg 样品转移至洁净的聚丙烯管中。
- 使用真空离心浓缩仪干燥样品，并用 20 µL 质谱级水中的 0.1% 甲酸（FA）重悬。
- 将各样品转移至带有预切开口盖的洁净自动进样小瓶中。
8. 高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
- 为了定位 FPOP 修饰，请使用 LC-MS/MS 分析对消化后的细胞裂解液进行分析。
- 使用含 0.1% 甲酸的水溶液（A）和含 0.1% 甲酸的乙腈（ACN）（B）作为流动相。
- 将 0.5 µg 样品加载至 180 µm × 20 mm C18（5 µm，100 Å）捕获柱，并用 99%（A）和 1%（B）洗涤柱子 15 分钟。
- 使用 75 µm × 30 cm C18（5 µm，125 Å）分析柱，以 0.300 µL/min 的流速对消化后的肽段进行洗脱和分离，持续 120 分钟。
- 按以下条件运行 LC 梯度：0−1 分钟，3% 溶剂 B；2−100 分钟，10−45% B；100−110 分钟，45−100% B；110−115 分钟，100% B。
- 在 115−116 分钟期间将柱子重新平衡至 3%（B），并在 116−120 分钟期间保持在 3%（B）。
- 采用纳米电喷雾电离，在正离子模式下分析洗脱的肽段。
- 在 m/z 375−1500 的扫描范围内，以 60,000 的分辨率采集 MS1 谱图。
- 设定自动增益控制（AGC）目标值为 5.0e5，最大注入时间为 50 ms，强度阈值为 5.0e4。
- 通过数据依赖性采集（DDA）选择电荷态为 2−6 的前体离子，隔离窗口为 1.2 m/z，循环时间为 4 秒。
- 对 MS2 离子进行高能碰撞解离（HCD），归一化能量为 32%。
- 在完成一次 MS/MS 采集后，将肽段排除 60 秒。
- 设定 MS/MS 分辨率为 15,000，AGC 目标值为 5.0e4，最大注入时间为 35 ms。
9. 蛋白质组学发现/数据处理
- 使用现有的自下而上蛋白质组学分析软件，针对相关的人类（Homo sapiens）蛋白质数据库和消化酶对串联质谱原始数据文件进行搜索。
- 设置蛋白质分析的搜索参数。
- 设定碎片离子容差为 0.02 Da，母离子容差为 10 ppm。
- 设定酶切特异性为胰蛋白酶，并允许一个漏切位点。
- 设定质荷比（m/z）质量范围为 375–1500。
- 设定肽段置信度为 95%（中等）和残基置信度为 99%（高）。
- 若至少鉴定出两条不同的肽段，并通过 5% 的发现率错误率（FDR）过滤，则接受该蛋白质鉴定结果。
- 设定羧甲基化为固定修饰，所有已知的羟基自由基侧链修饰15,16 为动态修饰。
- 当文件完成搜索后，将序列、修饰位点、蛋白质登录号、质谱文件、前体离子丰度及保留时间信息导出至电子数据库。
- 根据以下公式计算每个肽段或残基的修饰程度：
注：修饰的EIC面积是指带有氧化修饰的肽段或残基的提取离子色谱面积（EIC），EIC总面积是指同一肽段或残基无论是否发生氧化修饰的总色谱面积。随着时间推移，在过氧化氢存在下蛋白质会发生氧化，导致背景氧化。为计算修饰程度，将修饰肽段的面积除以总面积。未辐照的对照样品用于评估背景氧化水平。通过从激光处理样品中扣除对照样品的背景氧化值，以识别FPOP特异性修饰。
结果
为确认激光平台上的培养箱条件是否足以满足细胞培养，将GCaMP2瞬时转染至HEK293T细胞中，并通过荧光成像评估两块培养板的转染效率（图4A）。GCaMP2是一种钙离子感应型荧光蛋白，可作为基因编码的细胞内钙离子指示剂，由绿色荧光蛋白（GFP）与钙结合蛋白钙调蛋白（calmodulin）融合而成。为定量分析转染效率，对转染了prl-TK质粒的HEK 293细胞进行了荧光素酶检测（图4B）。结果表明，平台培养箱的性能优于标准培养箱，转染效率提高了1.13倍，为优化细胞培养环境提供了定量基准。
流式系统中标记的HEK293T细胞的FPOP修饰与平台培养箱中标记的结果进行了比较，结果显示，平台培养箱在发生修饰的蛋白质数量方面优于流式系统（图5) 以及这些蛋白质的总FPOP覆盖率。在平台培养箱中获得的FPOP修饰蛋白数量约为1051种，是典型实验中获得数量的2.2倍。每个实验的两次生物学重复之间的修饰数据进行了合并。此外，PIXY具有更高的通量。
为了展示在整个蛋白质范围内更高修饰覆盖率的优势，本研究在肽段水平上定位了IC-FPOP的修饰位点，并对修饰程度进行定量，以比较肌动蛋白（一种由375个氨基酸组成的蛋白质）在不同系统中的修饰结果差异。在流动系统中仅检测到两个被修饰的肽段，提供的结构信息有限（图6A）。然而，在平台培养箱系统中，共检测到五个覆盖肌动蛋白序列不同区域的修饰肽段。串联质谱结果表明，残基Pro322在每次实验中均被修饰并被检测到（图6B）。平台培养箱样品中检测到的五个肽段共包含十二个被修饰的残基，而流动系统中仅有四个残基被修饰（图6C）。氧化修饰覆盖率的提升使得在整个蛋白质范围内获得了更丰富的结构信息。
Espino 等人证明了进行 FPOP 的能力 在体 （IV-FPOP）内 C. elegans一种用于人类疾病状态的蠕虫模型17虽然IV-FPOP也通过流动系统进行，但PIXY系统已针对线虫进行了兼容性测试。约10,000条线虫在平台培养箱中每孔孵育 20 °CLC−MS/MS 分析显示，在平台培养箱中经 IV-FPOP 修饰的蛋白质有 792 种，而流动系统中修饰的蛋白质为 545 种。图7）。这些结果表明，除了二维细胞培养外，这种新方法还适用于其他生物系统的研究，例如 秀丽隐杆线虫.
图 1。PIXY 系统示意图。系统组件：（A）载台式培养箱，（B）定位系统，（C）蠕动泵，以及（D）灌注管路。在预设的时间点，通过泵从每个孔中移除细胞培养基，随后注入 H2O2 和淬灭溶液。图中白色线条表示用于照射的激光路径。经 Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. 允许重印，摘自《分析化学》，92(2), 1691-1696 2019。版权所有 2020 美国化学会。 请点击此处查看此图的高清版本。
图2．完全组装的PIXY系统。（A）触控监测系统，（B）二氧化碳单元，（C）温度单元，（D）空气泵，（E）加湿器，（F）光学反射镜，（G）平台培养箱，（H）定位平台，（I）248 nm KrF准分子激光器，以及（J）蠕动泵。请点击此处查看此图的放大版本。
图 3. 蠕动泵的自动化控制。（A）LABVIEW 中的示例命令脚本。命令选项包括体积、流速、暂停时间和流动方向。目前正对转速、阶段距离和位置进行自动化控制。（B）LABVIEW 中的脚本读取界面。在此处上传命令脚本后，点击“运行序列”和“启动”按钮以启动泵。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4．HEK 细胞转染效率。（A）标准培养箱（对照）与载台式培养箱（PIXY）中 GCaMP2 转染的平均荧光强度比较。点和方块代表每个孔中测量位置的数据点。（B）使用不同载体质粒 pRL-TK 对转染效率进行定量和验证。P 值< 0.005。经 Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. 允许重印，原文发表于《分析化学》，92(2), 1691-1696, 2019。版权所有 2020 美国化学学会。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5单细胞流动系统与PIXY中修饰蛋白质的比较 流控系统（紫色）与PIXY系统（绿色）中发生修饰的蛋白质的维恩图。经Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M.许可重印，摘自《分析化学》，92(2), 1691-1696, 2019年。版权所有 2020年美国化学会。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6. IC-FPOP修饰的定位。不同系统间IC-FPOP修饰的比较。（A）来自流动系统（紫色）与平台培养箱（绿色）中肌动蛋白内发生氧化修饰的肽段的柱状图。（B）肌动蛋白（肽段316-326）的串联质谱图，显示两个系统中均存在修饰的脯氨酸，以及未修饰的肌动蛋白肽段。（C）肌动蛋白的FPOP修饰残基（PDB: 6ZXJ，链A）；平台培养箱中11个修饰残基（绿色），流动系统中3个修饰残基（紫色），1个重叠的修饰残基（黄色）。经Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M.许可转载，摘自《在配备可移动XY平台的培养箱中实施细胞内快速光化学蛋白质氧化》，《分析化学》，92(2), 1691-1696, 2019年。版权所有2020年美国化学会。请点击此处查看此图的放大版本。
图7. FPOP 修饰蛋白质的比较 C. elegans 通过流式分析与PIXY比较。 与流动系统相比，使用PIXY时氧化修饰蛋白增加了1.5倍。经许可转载自Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., 《在带有可移动XY平台的培养箱中实现细胞内快速光化学蛋白质氧化》, 《分析化学》, 92(2), 1691-1696, 2019年。版权所有 2020 美国化学学会。 请点击此处以查看此图的放大版本。
表1. 工作流程修改分布及质量变化 (Da)。 请点击此处下载 该表格。
讨论
蛋白质在活细胞中承担着大部分生命活动。鉴于其重要性，需要获取有关蛋白质功能及其在细胞环境中的高级结构（HOS）的详细数据，以深入理解细胞内大分子复合物和酶促反应的复杂机制，而非仅限于纯化体系中的研究。为此，采用了一种名为细胞内快速光化学蛋白质氧化（In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins, IC-FPOP）的羟基自由基蛋白质足迹技术。目前大多数FPOP研究均在体外体系中开展 体外 在相对纯净的蛋白质体系中，这与影响结合相互作用及蛋白质构象动力学的拥挤分子环境形成显著对比。因此，研究结果之间存在巨大鸿沟 体外 实验18 以及在真实细胞环境中将获得的结果之间的差距。为了弥合理想化实验条件与 体外 FPOP 实验 由于细胞的复杂性，已开发出一种新型自动化六孔板式细胞内FPOP平台。该新型FPOP技术能够鉴定和表征这些分子种类，并追踪其在健康与疾病状态下的动态分子相互作用。这一新平台称为带可移动XY载物台的培养箱平台（PIXY）。
FPOP 已成功用于表征蛋白质组内的结构信息。然而，每种生物学技术都存在一定的局限性，需要进一步改进。激光光解过程中需要特定的试剂，并需高效淬灭未反应的羟基自由基。消化后肽段的分离可能需要大量时间以最大化获取结构信息。这些丰富的信息在质谱后数据分析过程中也可能需要进行大量的定量工作1。该平台培养系统，包括细胞培养和激光平台上实现 IC-FPOP 所需的外围设备，成本较高，可能并不适用于某些实验室。随着研究的不断进展，更完善的软件和分析工具应能进一步推动该技术的发展；本研究展示其中部分成果。目前在该平台培养系统中已开展的研究对象包括 HEK293T 细胞和 C. elegans。IC-FPOP 方法已被证实适用于多种细胞系，包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、Vero 细胞、MCF-7 细胞和 MCF10-A 细胞19。由于通用的 IC-FPOP 方法可适用于该静态平台，因此这些细胞系也应可利用 PIXY 进行研究。
IC-FPOP 利用 H2O2 对氨基酸中溶剂可及的侧链进行氧化修饰，从而进一步解析活细胞内的蛋白质相互作用、结构及代谢效应，这对于提供生物学背景具有重要意义。在开展 IC-FPOP 实验前，必须确认细胞在加入 H2O2 后仍保持活性。细胞活力研究表明，细胞在 H2O2 浓度高达 200 mM 时仍具有活性13。此外，必须确保在去除培养基后，将 H2O2 直接以终浓度 200 mM 加入细胞中。若未能完全去除细胞培养基，将导致 H2O2 浓度不一致。与标准条件相比，在平台孵育器中将孵育时间延长至 10 秒并提高 H2O2 浓度，可使被 IC-FPOP 修饰的蛋白质数量增加。使用前必须对蠕动泵进行预启动，以确保泵正常工作并能均匀分散液体。若未执行此步骤，可能导致管路中产生气泡、H2O2 加入量不足而无法充分浸没细胞，和/或淬灭溶液加入量不足。
另一个可能出现的问题是系统中的非预期延迟。例如，在使用集成软件时，校验泵系统接收指令的过程会引入显著延迟，通常在1000毫秒或更长。该问题可通过在实验过程中尽量减少与泵的通信，并尽可能提前使用预设指令来解决。
未来，PIXY的目标是构建一个完全自动化且集成化的系统。除了蠕动泵之外，激光脉冲的触发也将实现自动化。还将采用一种新的定位系统，以实现平台培养箱的快速移动，从而提高速度和精度。系统的所有组件将继续通过集成软件进行编程，以进一步提高通量。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
本文所呈现的研究与以下引用的专利申请相关：
美国非临时专利申请号：17/042,565
标题："用于确定蛋白质折叠的装置和方法"
UMB 案卷号：LJ-2018-104 UMass 参考号：UMA 18-059。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM128983-01 项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ismatec Reglo ICC 蠕动泵 | Cole-Palmer | 122270050 | |
| 用于Ø2"光学元件的运动学镜架 | Thor Labs | ||
| 10X 胰蛋白酶−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
| 50.0 mm 248 nm 45° 激光器反射镜（准分子激光线） | Edmond Optics | ||
| 丙酮，HPLC 级 | Fisher Scientific | ||
| 含 0.1% 甲酸（v/v）的乙腈，LC/MS 级 | Fisher Scientific | ||
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 捕获柱，100Å，5 µm，180 µm x 20 mm，2G，V/M，1/包 | Waters | 23275 | 其他高分辨率仪器（例如 Q exactive Orbitrap 或 Orbitrap Fusion）也可使用 |
| ACQUITY UPLC M-Class 系统 | Waters | A53225 | |
| Afinia H480 3D 打印机 | （马里兰大学巴尔的摩校区图书馆创新空间） | ||
| 气泵 | OKOlabs | D12345 | |
| 铝箔 | Fisher Scientific | 库存号 #63-120 | |
| Aqua 5 µm C18 125 Å 填料 | Phenomenex | ||
| 二氧化碳单元 | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
| 离心机 | Eppendorf | ||
| 接头（Y 型聚丙烯 1/16” 和 1/16x1/8”） | Cole-Palmer | 116891000 | |
| 精密任务擦拭纸 | Fisher Scientific | 022625501 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | AmericanBio | ||
| DMSO，无水级 | Invitrogen | LS118-500 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS） | Corning | SK-78001-82 | |
| EX350 准分子激光器 | GAM Laser | PI89900 | |
| 胎牛血清（FBS） | Corning | SK-12023-78 | |
| 甲酸，LC/MS 级 | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L 的量并非必需 |
| HEK293T 细胞 | 马里兰大学巴尔的摩分校 Paul Shapiro 实验室 | ||
| 加湿器 | OKOlabs | Nano-LPMW 平台 | |
| HV3-2 阀门 | Hamilton | BP152-500 | |
| 过氧化氢 | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| 碘乙酰胺（IAA） | ACROS Organics | ||
| LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
| MadMotor 定位系统及控制器 | Mad City Labs | W6-4 | |
| 甲醇，LC/MS 级 | Fisher Scientific | 01-213-100 | 任何品牌均可满足要求 |
| 微量离心机 | Thermo Scientific | H301-T 单元-BL-PLUS | |
| N,N′-二甲基硫脲（DMTU） | ACROS Organics | ||
| 纳米定位平台 | Mad City Labs | ||
| N-叔丁基-α-苯基亚硝基化合物（PBN） | ACROS Organics | ||
| OKO Touch 监测系统 | OKOlabs | ||
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪 | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
| PE50-C 热电能量计 | Ophir Optronics | ||
| 青霉素-链霉素 | Corning | ||
| Pierce 定量比色肽测定试剂盒 | Thermo Scientific | ||
| Pierce Rapid Gold BCA 蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | ||
| Pierce 胰蛋白酶，质谱级 | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Pierce 通用核酸酶（用于细胞裂解） | Fisher Scientific | 06-666A | |
| 压力表 | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
| PTFE 滤膜 | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
| 六个 33 mm PLA 丝材环 | （马里兰大学巴尔的摩校区图书馆创新空间） | ||
| 无菌培养箱 | OKOlabs | ||
| 温控单元 | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA 缓冲液 | Fisher Scientific | A117-50 | |
| TiNKERcad | （马里兰大学巴尔的摩校区图书馆创新空间） | ||
| Tris 碱 | Fisher Scientific | H325-100 | 任何 30% 的过氧化氢均可满足要求 |
| 管路（Tygon，内径 3.18 和 1.59） | Cole-Palmer | 177350250 | |
| 含 0.1% 甲酸（v/v）的水，LC/MS 级 | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L 的量并非必需 |
| 水，LC/MS 级 | Fisher Scientific | 88702 | |
| 90058 | |||
| KM200 | |||
| 186007496 |
参考文献
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).
- Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).
- Zhao, B., et al. Covalent Labeling with an α,β-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins. Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).
- Hambly, D., Gross, M. Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).
- Yan, Y. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).
- Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).
- Bangel-Ruland, N., et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy. The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Xu, G. C., et al. Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics. Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).
- Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
- Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).
重印与许可
标签
