我们已开发出一种通用方案，可从胚胎期和成年小鼠舌部的上皮组织及间充质/结缔组织中分离出大量高质量的单细胞。
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本文内容
摘要
摘要
细胞解离是进行单细胞水平和/或细胞群体水平研究的关键步骤（例如 单细胞RNA测序和原代细胞培养）。获得大量具有活性且健康的细胞至关重要，而实现这一目标的最佳条件则依赖于组织类型。舌上皮及其下方间充质/结缔组织中的细胞群体具有异质性，且在不同区域和不同发育阶段，组织结构存在差异。我们已测试了从小鼠舌上皮及间充质/结缔组织中分离细胞的实验方案，涵盖早期发育阶段［胚胎第12.5天（E12.5）］和年轻成年阶段（8周龄）。上皮与下方间充质/结缔组织之间的清晰分离较易实现。然而，为进一步处理并分离出大量具有高活性的健康细胞，需谨慎选择酶消化缓冲液、孵育时间以及离心速度和时间。将分离后的上皮或下方间充质/结缔组织在37 °C条件下用0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育30分钟，随后以200 × g离心8分钟，可在不同小鼠发育阶段和舌部区域均获得高产量且高活力（>90%）的细胞。此外，我们发现来自胚胎期和成年期舌头的解离上皮细胞和间充质/结缔组织细胞在细胞培养基中至少可存活3小时，且细胞活力无明显下降。该方案将有助于需要从小鼠舌头不同组织区室中分离细胞的研究，适用于早期发育阶段（E12.5）和年轻成年阶段（8周龄）的细胞解离制备。
引言
哺乳动物的舌头是一个复杂的器官，在味觉、言语和食物处理中起着关键作用。它由多种高度有序的组织构成，这些组织被间充质/结缔组织分隔，并覆盖有一层包含味乳头和味蕾的复层上皮。舌上皮和间充质/结缔组织中的细胞群体均具有异质性。为了更深入地理解舌中特定类型细胞的功能与分布，需要开展基于解离细胞的研究。例如，单细胞RNA测序是一种强大且高通量的方法，可用于单个细胞的转录组分析，旨在以单细胞分辨率解析复杂组织的转录组1,2,3,4。原代细胞培养已被证实是研究味蕾干细胞/前体细胞功能与分化的重要工具5,6。这些研究需要大量高质量的分离细胞群体（例如，足够总数、适当浓度且高活力的细胞）。
因此，需要从舌组织的不同区域以及不同发育阶段分离细胞。目前尚无针对舌上皮及其下方间充质/结缔组织进行细胞解离的详细实验方案。本文报道了一种优化的细胞解离方法，可用于制备高质量活细胞，适用于单细胞RNA测序和原代干细胞培养等实验。我们发现，酶消化缓冲液的选择、轻柔吹打、重悬培养基的选用，以及最佳离心时间和速度，对于获得大量高质量细胞至关重要....
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方案
动物使用（本研究全程使用 C57BL/6 小鼠）已获得佐治亚大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院关于科研动物照护与使用的指南。
1. 动物使用
注意：小鼠在佐治亚大学动物与乳品科学系动物饲养设施中饲养和维持，环境温度为 22 °C，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。
- 将小鼠阴道栓检测当天的中午定为胚胎（E）0.5天。后续实验使用E12.5胚胎及8周龄的出生后小鼠。
2. 实验前准备
注意：本实验方案所需的仪器列于材料表中。
- 实验前对器械进行高压灭菌。实验过程中使用玻璃珠灭菌器对器械进行灭菌。
- 使用 70% 乙醇擦拭液清洁手术区域、解剖显微镜和生物安全柜。在实验操作开始前 20 分钟打开生物安全柜的紫外灯，并保持开启状态。
- 配制 1:1 的分散酶（5.0 mg/mL）和胶原酶（2.0 mg/mL）混合酶液，使其终浓度分别为 2.5 mg/mL 和 1.0 mg/mL，并使用 0.22 µm 注射器滤器过滤溶液7。
- 成年舌组织准备 1 mL 混合酶液，舌部特定区域（如舌后部或舌前....
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结果
舌上皮与其下方间充质/结缔组织的分离
在小鼠胚胎舌中，经过适当的酶消化后，上皮下间隙可见明显空隙。部分舌的上皮层在孵育过程中无需施加机械力即可自然分离。
在成年小鼠的舌组织中，成功的酶注射表现为注射区域出现肿胀（图1B2），这表明酶能够被舌组织保留。酶量不足和/或针头插入过深至间充质组织和/或针头刺穿舌上皮，将导致注射区域仅出现部分肿胀或完全无肿胀。经过酶消化后，若消化充分，下方的结缔组织会变得疏松且具有黏性。当轻轻提起上皮片边缘时，可在上皮下区域观察到明显的间隙。
细胞解离对总细胞数和细胞活力的影响
通过步骤4，分别收集了E12.5胚胎的舌组织、舌上皮片层以及上皮下方的薄层间充质组织。使用血细胞计数板进行人工细胞计数（图2）结果显示，从上皮片层（每舌组织约0.3 mm<.......
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讨论
迄今为止，尚无针对舌上皮及其下方间充质/结缔组织进行细胞解离的详细实验方案。本细胞解离方案提供了一种可重复的操作流程，能够从胚胎期及出生后各阶段的小鼠舌组织（包括上皮层和间充质/结缔组织）中获得高细胞活力（>90%）的单细胞悬液，即使E12.5阶段与成年小鼠分离所得细胞在大小上存在差异。例如，E12.5小鼠舌部上皮和间充质来源的细胞大小均一且较小，而8周龄小鼠舌组织分离出的细胞则表现出较大异质性（从小到大不等）。得益于高细胞活力（>90%），所获得的单细胞悬液可有效支持对活细胞质量要求较高的下游实验（如单细胞RNA测序和原代细胞培养）。
为了确保细胞具有较高的存活率，必须仔细关注几个重要因素。使用分散酶和胶原酶混合液进行适当时间的消化，可有效将上皮组织与间充质/下方结缔组织分离，同时保持细胞活性。建议胚胎舌组织消化20分钟，成体舌组织消化30分钟。尽管酶消化后上皮层可轻易剥离，但仍建议使用剪刀进行分离，这有助于保护舌上皮基底层中的干细胞群体9。在细胞解离过程中，强烈推荐使用0.25%胰蛋白酶-EDTA而非单独的胰蛋白酶，因.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为R01DC012308和R21DC018089，授予HXL。我们感谢Brett Marshall（美国佐治亚大学，雅典，佐治亚州）和Egon Ranghini（10X GENOMICS，普莱森顿，加利福尼亚州）在细胞解离方面的技术支持与咨询；感谢Francisca Gibson Burnley（美国佐治亚大学，雅典，佐治亚州）在英文编辑方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 小鼠（C57BL/6J） | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| 胶原酶（Collagenase A） | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| 培养皿（直径 35 mm） | Genesee Scientific | 32-103G | |
| 培养皿（直径 100 mm） | Genesee Scientific | 32-107G | |
| 中性蛋白酶（Dispase II） | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| 解剖剪刀（学生用精细剪刀） | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | C838U82 | |
| 精细镊子（Dumount #3 镊子） | Find Science Tool | 11293-00 | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 3520 | |
| 带成像系统的倒置显微镜（EVOS XL Core 细胞成像系统） | Life Technologies | AMEX1000 | |
| 低吸附移液器吸头 | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| 微型剪刀（Evo 弹簧剪刀） | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| 塑料封膜 | VWR | 46610-056 | |
| 刮勺（Moria 勺） | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| 手术镊（Dumount #2 椎板切除镊） | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s 溶液 | Sigma-Aldrich | T2145-10L | 由 Tyrode's 盐配制 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS） | Hoefer | 33946 | 由 1 M PBS 配制 |
| 0.22-μm 注射器滤器 | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% 乙醇 | Koptec | 233919 | 由 100% 乙醇配制 |
| 1-mL 注射器 | BD | 8194938 | |
| 5-mL 低吸附微量离心管 | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G 针头 | BD | 9193532 | |
| 35-μm 细胞筛 | Falcon | 64750 | |
| 70-μm 细胞筛 | Falcon | 64752 |
参考文献
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple....
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重印与许可
