我们已开发出一种通用方案，可从胚胎期和成年小鼠舌部的上皮组织及间充质/结缔组织中分离出大量高质量的单细胞。
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本文内容
摘要
摘要
细胞解离是进行单细胞水平和/或细胞群体水平研究的关键步骤（例如 单细胞RNA测序和原代细胞培养）。获得大量具有活性且健康的细胞至关重要，而实现这一目标的最佳条件则依赖于组织类型。舌上皮及其下方间充质/结缔组织中的细胞群体具有异质性，且在不同区域和不同发育阶段，组织结构存在差异。我们已测试了从小鼠舌上皮及间充质/结缔组织中分离细胞的实验方案，涵盖早期发育阶段［胚胎第12.5天（E12.5）］和年轻成年阶段（8周龄）。上皮与下方间充质/结缔组织之间的清晰分离较易实现。然而，为进一步处理并分离出大量具有高活性的健康细胞，需谨慎选择酶消化缓冲液、孵育时间以及离心速度和时间。将分离后的上皮或下方间充质/结缔组织在37 °C条件下用0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育30分钟，随后以200 × g离心8分钟，可在不同小鼠发育阶段和舌部区域均获得高产量且高活力（>90%）的细胞。此外，我们发现来自胚胎期和成年期舌头的解离上皮细胞和间充质/结缔组织细胞在细胞培养基中至少可存活3小时，且细胞活力无明显下降。该方案将有助于需要从小鼠舌头不同组织区室中分离细胞的研究，适用于早期发育阶段（E12.5）和年轻成年阶段（8周龄）的细胞解离制备。
引言
哺乳动物的舌头是一个复杂的器官，在味觉、言语和食物处理中起着关键作用。它由多种高度有序的组织构成，这些组织被间充质/结缔组织分隔，并覆盖有一层包含味乳头和味蕾的复层上皮。舌上皮和间充质/结缔组织中的细胞群体均具有异质性。为了更深入地理解舌中特定类型细胞的功能与分布，需要开展基于解离细胞的研究。例如，单细胞RNA测序是一种强大且高通量的方法，可用于单个细胞的转录组分析，旨在以单细胞分辨率解析复杂组织的转录组1,2,3,4。原代细胞培养已被证实是研究味蕾干细胞/前体细胞功能与分化的重要工具5,6。这些研究需要大量高质量的分离细胞群体（例如，足够总数、适当浓度且高活力的细胞）。
因此，需要从舌组织的不同区域以及不同发育阶段分离细胞。目前尚无针对舌上皮及其下方间充质/结缔组织进行细胞解离的详细实验方案。本文报道了一种优化的细胞解离方法，可用于制备高质量活细胞，适用于单细胞RNA测序和原代干细胞培养等实验。我们发现，酶消化缓冲液的选择、轻柔吹打、重悬培养基的选用，以及最佳离心时间和速度，对于获得大量高质量细胞至关重要。
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方案
动物使用（本研究全程使用 C57BL/6 小鼠）已获得佐治亚大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院关于科研动物照护与使用的指南。
1. 动物使用
注意：小鼠在佐治亚大学动物与乳品科学系动物饲养设施中饲养和维持，环境温度为 22 °C，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。
- 将小鼠阴道栓检测当天的中午定为胚胎（E）0.5天。后续实验使用E12.5胚胎及8周龄的出生后小鼠。
2. 实验前准备
注意：本实验方案所需的仪器列于材料表中。
- 实验前对器械进行高压灭菌。实验过程中使用玻璃珠灭菌器对器械进行灭菌。
- 使用 70% 乙醇擦拭液清洁手术区域、解剖显微镜和生物安全柜。在实验操作开始前 20 分钟打开生物安全柜的紫外灯，并保持开启状态。
- 配制 1:1 的分散酶（5.0 mg/mL）和胶原酶（2.0 mg/mL）混合酶液，使其终浓度分别为 2.5 mg/mL 和 1.0 mg/mL，并使用 0.22 µm 注射器滤器过滤溶液7。
- 成年舌组织准备 1 mL 混合酶液，舌部特定区域（如舌后部或舌前部）准备 0.5 mL。
- 胚胎舌组织准备 2 mL 混合酶液。
- 配制 10 mL 含 2.5% BSA 的 0.1 M PBS 溶液，并使用 1 mL 注射器和 0.22 µm 注射器滤器过滤。
- 配制 500 µL 含 5% FBS 的 DMEM/F12 培养基。
- 配制 3 mL 含 10% FBS 和 1% BSA 的 DMEM/F12 培养基，并使用 1 mL 注射器和 0.22 µm 注射器滤器过滤。
3. 分离舌上皮与间充质/下方结缔组织
- 分离 E12.5 小鼠舌的上皮组织与间充质组织
- 将携带 E12.5 胚胎的定时妊娠雌鼠置于 CO2 腔室中实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
注：E12.5 小鼠胚胎在妊娠雌鼠检测到阴道栓后第 12 天下午（12 点之后）采集。 - 将小鼠转移至手术区域。用 70% 乙醇润湿小鼠腹部，防止毛发进入操作区域。
- 使用解剖剪刀切开腹部，暴露携带胚胎的子宫角。用解剖剪刀分离子宫角，并将其转移至含 15 mL 新鲜 Tyrode 溶液的 100 mm 培养皿中。
- 在解剖显微镜下使用微型剪刀和精细镊子将胚胎（图 1A1）从子宫角中分离出来。
- 使用精细镊子小心地将口腔充分打开，用微型剪刀从下颌处分离舌组织（图 1A2）。
- 在 100 mm 培养皿中用 15 mL 新鲜无菌 Tyrode 溶液清洗舌组织。
- 在生物安全柜中，使用刮铲和精细镊子将舌组织转移至含 2 mL 酶混合液（dispase 2.5 mg/mL，collagenase 1.0 mg/mL）的 35 mm 培养皿中。在 37 °C 下孵育 20 分钟。
- 将舌组织转移至含 15 mL 新鲜无菌 Tyrode 溶液的 100 mm 培养皿中，使用精细镊子从腹侧轻轻将间充质组织从上皮组织上分离。
注：在孵育过程中，上皮层可能无需机械力即可自然分离。 - 在 100 mm 培养皿中用 15 mL 新鲜无菌 Tyrode 溶液对分离的上皮组织和间充质组织各清洗两次。
注：在细胞解离步骤（步骤 4.1）中，EDTA 将抑制 dispase 和 collagenase 的活性。
- 将携带 E12.5 胚胎的定时妊娠雌鼠置于 CO2 腔室中实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
- 分离成年小鼠舌上皮组织与其下方结缔组织
- 将 8 周龄小鼠置于 CO2 腔室中实施安乐死。通过确认无呼吸及前肢夹捏无反应来判断小鼠已死亡。
- 将小鼠转移至手术区域。用 70% 乙醇润湿小鼠头部，防止毛发进入口腔。
- 使用解剖剪刀沿面颊剪开口角以打开口腔。将舌连同下颌一起解剖取出（图 1B1），并置于铺有塑料薄膜的塑料皿中。
- 在解剖显微镜下使用手术镊固定舌组织，通过舌后部切口边缘（图 1B1，箭头）向舌上皮下间隙注射 dispase（2.5 mg/mL）和 collagenase（1.0 mg/mL）的酶混合液。
- 为从前部和后部舌组织均采集样本，将 1 mL 酶混合液均匀注射至整个舌组织。
- 若仅从前部舌采集组织（如舌尖）或从轮廓乳头区域采集组织，可局部注射 0.5 mL 酶混合液至前部或后部舌组织。
注：随着酶液积聚，舌组织将出现肿胀（图 1B2）。轻柔注射酶液可防止压力损伤上皮组织，并尽可能使酶保留在舌组织内。
- 用塑料薄膜包裹舌组织，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
- 使用微型剪刀解剖舌尖和/或轮廓乳头，使用刮铲和精细镊子将组织转移至含 15 mL 新鲜无菌 Tyrode 溶液的 100 mm 培养皿中。
- 使用微型剪刀在酶消化后的上皮下间隙将上皮组织与其下方的结缔组织分离。根据下游实验需求，将组织修剪至合适大小。
- 在 100 mm 培养皿中用 15 mL 新鲜无菌 Tyrode 溶液对分离的上皮组织及其下方结缔组织各清洗两次。
注：在细胞解离步骤（步骤 4.1）中，EDTA 将抑制 dispase 和 collagenase 的活性。
4. 细胞解离
注意：此处所述的细胞解离方案可用于 E12.5 胚胎期和 8 周龄小鼠的舌部上皮组织及间充质/结缔组织。为减少细胞悬液在振荡和转移过程中的细胞损失，建议使用商用低吸附移液器吸头，或用 pH 7.4 的 0.1 M PBS 配制的 2.5% BSA 预先包被的移液器吸头8。
- 使用 spatula 和精细镊子将组织转移至新的 35 mm 培养皿中，加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 下孵育 30 min。每隔 5 min 用 1 mL 吸头轻轻振荡组织。
注意：请勿剪切吸头尖端，因为切割边缘可能对解离的细胞造成物理损伤。 - 加入 500 µL 含 5% FBS 的 DMEM/F12 以终止反应，并将液体转移至 5 mL 低吸附离心管中。
- 在室温下以 200 × g 离心 8 min，弃去上清液。
- 用 1 mL 吸头将细胞轻柔重悬于 3 mL 含 10% FBS 和 1% BSA 的 DMEM/F12 培养基中，随后依次通过 70 µm 和 35 µm 细胞滤器过滤细胞。
- 在室温下以 200 × g 离心 8 min。吸除大部分上清液，保留 50–300 µL 作为最终体积用于重悬细胞。
注意：可通过调整单细胞悬液的最终体积，根据下游实验需求调节细胞浓度。
5. 使用血细胞计数板进行细胞计数和活力检测
注意：为提高测量准确性，建议每个样本设置 3 个技术重复。
- 轻轻混匀5-10 µL 将单细胞悬液与等体积的台盼蓝混合后，加入血细胞计数板。
注意：使用70%乙醇在使用前彻底清洁血细胞计数板。血细胞计数板上的灰尘颗粒会被染成深蓝色，影响细胞活力检测的准确性。在显微镜下检查血细胞计数板。 - 计数总细胞数、活细胞数（白色）以及经台盼蓝染色的死细胞数（深蓝色）图2，箭头）分别位于含16个网格的4个方格中（图2使用配备成像系统的倒置显微镜进行观察。
- 计算细胞浓度：
细胞浓度 =
- 计算细胞活力：
存活率 =
- 计算细胞活力：
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结果
舌上皮与其下方间充质/结缔组织的分离
在小鼠胚胎舌中，经过适当的酶消化后，上皮下间隙可见明显空隙。部分舌的上皮层在孵育过程中无需施加机械力即可自然分离。
在成年小鼠的舌组织中，成功的酶注射表现为注射区域出现肿胀（图1B2），这表明酶能够被舌组织保留。酶量不足和/或针头插入过深至间充质组织和/或针头刺穿舌上皮，将导致注射区域仅出现部分肿胀或完全无肿胀。经过酶消化后，若消化充分，下方的结缔组织会变得疏松且具有黏性。当轻轻提起上皮片边缘时，可在上皮下区域观察到明显的间隙。
细胞解离对总细胞数和细胞活力的影响
通过步骤4，分别收集了E12.5胚胎的舌组织、舌上皮片层以及上皮下方的薄层间充质组织。使用血细胞计数板进行人工细胞计数（图2）结果显示，从上皮片层（每舌组织约0.3 mm<...
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讨论
迄今为止，尚无针对舌上皮及其下方间充质/结缔组织进行细胞解离的详细实验方案。本细胞解离方案提供了一种可重复的操作流程，能够从胚胎期及出生后各阶段的小鼠舌组织（包括上皮层和间充质/结缔组织）中获得高细胞活力（>90%）的单细胞悬液，即使E12.5阶段与成年小鼠分离所得细胞在大小上存在差异。例如，E12.5小鼠舌部上皮和间充质来源的细胞大小均一且较小，而8周龄小鼠舌组织分离出的细胞则表现出较大异质性（从小到大不等）。得益于高细胞活力（>90%），所获得的单细胞悬液可有效支持对活细胞质量要求较高的下游实验（如单细胞RNA测序和原代细胞培养）。
为了确保细胞具有较高的存活率，必须仔细关注几个重要因素。使用分散酶和胶原酶混合液进行适当时间的消化，可有效将上皮组织与间充质/下方结缔组织分离，同时保持细胞活性。建议胚胎舌组织消化20分钟，成体舌组织消化30分钟。尽管酶消化后上皮层可轻易剥离，但仍建议使用剪刀进行分离，这有助于保护舌上皮基底层中的干细胞群体9。在细胞解离过程中，强烈推荐使用0.25%胰蛋白酶-EDTA而非单独的胰蛋白酶，因...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为R01DC012308和R21DC018089，授予HXL。我们感谢Brett Marshall（美国佐治亚大学，雅典，佐治亚州）和Egon Ranghini（10X GENOMICS，普莱森顿，加利福尼亚州）在细胞解离方面的技术支持与咨询；感谢Francisca Gibson Burnley（美国佐治亚大学，雅典，佐治亚州）在英文编辑方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 小鼠（C57BL/6J） | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| 胶原酶（Collagenase A） | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| 培养皿（直径 35 mm） | Genesee Scientific | 32-103G | |
| 培养皿（直径 100 mm） | Genesee Scientific | 32-107G | |
| 中性蛋白酶（Dispase II） | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| 解剖剪刀（学生用精细剪刀） | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | C838U82 | |
| 精细镊子（Dumount #3 镊子） | Find Science Tool | 11293-00 | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 3520 | |
| 带成像系统的倒置显微镜（EVOS XL Core 细胞成像系统） | Life Technologies | AMEX1000 | |
| 低吸附移液器吸头 | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| 微型剪刀（Evo 弹簧剪刀） | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| 塑料封膜 | VWR | 46610-056 | |
| 刮勺（Moria 勺） | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| 手术镊（Dumount #2 椎板切除镊） | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s 溶液 | Sigma-Aldrich | T2145-10L | 由 Tyrode's 盐配制 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS） | Hoefer | 33946 | 由 1 M PBS 配制 |
| 0.22-μm 注射器滤器 | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% 乙醇 | Koptec | 233919 | 由 100% 乙醇配制 |
| 1-mL 注射器 | BD | 8194938 | |
| 5-mL 低吸附微量离心管 | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G 针头 | BD | 9193532 | |
| 35-μm 细胞筛 | Falcon | 64750 | |
| 70-μm 细胞筛 | Falcon | 64752 |
参考文献
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367(2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
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