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方法文章

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

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DOI：

10.3791/62166

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2021年2月10日

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University, 3Cell Physiology, Zoological institute, Technische Universität Braunschweig

本文内容

摘要

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。

摘要

要理解大脑发育和成熟过程中发生的短暂变化，需要在细胞和亚细胞分辨率下，对空间和时间进行高分辨率的详细成像。分子与成像技术的进步使我们能够深入洞察透明斑马鱼胚胎中大脑发育的细胞与分子机制。近年来，研究的关注点已转向受精后数周的幼虫后期阶段发生的神经连接精细化过程，例如社会行为、决策或动机驱动行为的调控机制。在这些发育阶段，斑马鱼皮肤的色素沉积会阻碍光线进入脑组织，而胚胎期常用的解决方案（如药理学抑制色素生成）已不再可行。

因此，提供了一种源自电生理学 方法的微创外科手术方案，可实现对清醒斑马鱼大脑进行显微成像的通路。在硬骨鱼类中，可通过显微剥离技术小心去除皮肤和柔软的颅骨软骨层，从而暴露下方的神经元和轴突通路，且不造成损伤。该方法可用于记录神经元形态，包括突触结构及其分子组成，并可观察生理变化，如钙离子（Ca2+）瞬变或细胞内运输事件。此外，还可通过药理学抑制或光遗传学操控手段对这些过程进行干预研究。这种脑部暴露方法可在数分钟至数小时的时间尺度上，提供活体脑组织中神经元结构与生理变化的信息，以及这些事件之间的相关性和相互依赖关系。该技术适用于受精后长达30天的斑马鱼幼鱼的活体脑成像，这是目前测试的最晚发育阶段。因此，该方法可用于研究突触精细化与缩放、轴突和树突运输、细胞骨架货物的突触靶向以及局部活动依赖性表达等重要科学问题。综上所述，这种固定与成像方法具有广泛的应用前景。

引言

在最近几十年中，斑马鱼（Danio rerio斑马鱼已成为胚胎和幼体发育研究中最受欢迎的脊椎动物模式生物之一。雌性斑马鱼具有较高的繁殖力，且其胚胎发育迅速 子宫外 胚胎的发育过程及其在早期胚胎发育阶段的透明性，是使斑马鱼成为研究发育问题的强大模式生物的几个关键因素之一1分子遗传技术的进步与高分辨率相结合 体内 成像研究有助于揭示发育过程背后的细胞生物学机制2特别是在神经元分化、生理学、连接性和功能领域，斑马鱼以前所未有的细节揭示了分子动态、脑功能与有机体行为之间的相互作用。

然而，大多数研究仅限于发育第一周内的胚胎期和早期幼虫阶段，因为神经系统组织的透明度会逐渐丧失。在这些阶段，由于颅骨分化和色素沉着的形成，脑组织被遮蔽，无法被高分辨率显微镜技术所观察3。

因此，神经元分化、成熟和可塑性等关键问题，例如神经元连接的精细化或突触缩放，难以进行研究。这些细胞过程对于阐明驱动社会行为、决策或基于动机行为的细胞机制至关重要；近年来，针对数周龄斑马鱼幼鱼的行为学研究已在这些领域取得了重要发现4。

使用药理学方法抑制斑马鱼幼鱼的色素沉着长达数周，几乎不可行，甚至可能产生不利影响5,6,7,8。具有特定色素缺陷的双突变或三突变品系（如 casper9 或 crystal10）已成为极为有价值的工具，但其繁殖过程繁琐，子代数量少，并且由于过度近亲繁殖，存在积累遗传畸形的风险。

本文提供了一种适用于任何斑马鱼品系的微创替代方法。该方法借鉴自电生理学研究，用于记录活体且清醒的斑马鱼幼鱼中的神经元活动。在硬骨鱼类中，由于皮肤和柔软的颅骨软骨与脑部血管系统并未紧密交织，因此可通过显微剥离技术小心地去除这些组织层。这种方法能够在不造成损伤的情况下暴露包含神经元和轴突纤维束的脑组织，从而记录神经元形态，包括突触结构及其分子组成，并进一步观察长达数小时的生理变化，如Ca2+瞬变或细胞内运输事件。此外，除了描述性表征外，由于能够直接接触脑组织，还可通过神经药理学物质施加和光遗传学手段来探究成熟神经元的功能。因此，利用这种脑组织暴露策略，可在幼年斑马鱼脑中揭示真实的结构-功能关系。

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方案

本文所述所有动物实验均符合相关法律法规（欧盟指令2010/63）。鱼类的饲养与操作已获得当地主管部门以及布伦瑞克工业大学动物福利代表的批准。

1. 人工脑脊液（ACSF）、低熔点琼脂糖和尖细玻璃针的制备

  1. 通过将所列化学物质以以下浓度溶解于蒸馏水中来配制人工脑脊液（ACSF）：134 mM NaCl（58.44 g/mol）、2.9 mM KCl（74.55 g/mol）、2.1 mM CaCl2（110.99 g/mol）、1.2 mM MgCl2·6H2O（203.3 g/mol）、10 mM HEPES（238.31 g/mol）和10 mM d-葡萄糖（180.16 g/mol）。
    注意：对于MgCl2、CaCl2和KCl，使用去盐无菌水配制1 M的储存液，并于4 °C保存，用于后续新鲜ACSF的配制。葡萄糖、HEPES和NaCl以固体形式直接溶解于新鲜ACSF溶液中。溶解化学品时，请遵循制造商的说明。
  2. 使用10 M NaOH将ACSF的pH值调节至7.8。ACSF的配制需要精确称量化学品并精细调节pH值，因为它将替代脑脊液，维持神经元正常功能所需的生理条件；否则可能导致脑功能异常和神经元死亡。
  3. 将新配制的ACSF于4 °C保存，最长不超过4周。实验时，取当日或当次实验所需体积的ACSF分装，并预热至25–28 °C（可选择性地进行氧合，见步骤2.5）。
    注意：新配制的ACSF在1天内使用为宜。若计划在多日内使用，ACSF需经过无菌过滤。
  4. 为后续麻醉幼鱼，用蒸馏水配制50 mM的d-筒箭毒碱（d-Tubocurarine）储存液，并以100 µL分装后于-20 °C冰箱中保存，直至使用。
  5. 为包埋鱼类样本，称取1.25 g低熔点（LM）琼脂糖（材料表），溶于50 mL ACSF中，加热至完全溶解，制成2.5%的低熔点琼脂糖溶液。
    注意：根据实验设置，也可使用更高或更低浓度的LM琼脂糖。然而，若琼脂糖过软，在打开颅骨时将无法固定鱼类样本。
  6. 将琼脂糖溶液置于37 °C水浴中保存，以防止凝固，同时该温度在包埋过程中不会对幼鱼造成损伤。待煮沸后的琼脂糖在水浴中冷却至37 °C后，向当日所需的分装琼脂糖中加入适量d-筒箭毒碱，使其工作浓度达到10 µM。剩余琼脂糖应于4 °C保存，以防污染，供后续使用。
  7. 使用拉针仪，根据以下参数从玻璃毛细管（补充图1）制备尖锐且细薄的玻璃针。
    1. 拉针仪I，毛细管类型1：加热1：65.8；加热2：55.1；两步拉制
      拉针仪II，毛细管类型2：加热 = 700；Fil = 4；Vel = 55；Del = 130；Pul = 55；一步拉制。
      注意：上述单位分别针对所使用的特定拉针仪和玻璃毛细管（见材料表）。也可使用其他毛细管和拉针仪制备玻璃针，但玻璃针不宜过细，否则接触颅骨时易断裂。毛细管规格：长度：100 mm（4英寸）；外径：1.5 mm；内径：0.84 mm；含丝：是

2. 幼虫麻醉及包埋前准备

  1. 每天开始实验时，使用塑料巴斯德吸管将所需的动物转移到一个直径为 90 mm 的培养皿中，该培养皿中装有 Danieau 溶液（用于仍饲养在含 Danieau 溶液培养皿中的幼体）或鱼房设施的水（用于饲养在鱼房设施中、年龄超过 7 天的幼体）。
    1. 吸取年龄超过 2 周的鱼时，应确保吸管开口足够大，以避免在转移过程中损伤鱼体。请勿使用网具，因其可能对尤其是较年轻的幼体造成物理损伤。
  2. 向培养皿中添加适合幼体大小的轮虫（rotifera）或卤虫（artemia）无节幼体，以确保幼体能够自由摄食，维持最佳健康状态，并减少应激。
  3. 进行包埋时，将选定的幼体转移至一个直径为 35 mm、盛有 ACSF 的培养皿中。加入适量的 d-筒箭毒碱（d-Tubocurarine），使其工作浓度/有效剂量达到 10 µM，静置数分钟，直至幼体完全 immobilized（固定）11。
    注意：当鱼体年龄增长，或需要更快实现完全麻醉（5 分钟内），可适当提高 d-筒箭毒碱的浓度（小鼠静脉注射的 LD50 为 0.13 mg/kg12）。也可选用其他麻醉剂，例如 α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin，工作浓度：1 mg/mL），其作用与筒箭毒碱相同，且可保持大脑完全活跃13。若研究目的不要求大脑完全活跃，也可使用非致死剂量的三卡因（Tricaine，0.02%）对幼体进行完全麻醉。但需注意，三卡因会阻断钠通道，从而抑制大脑活动14。
  4. 准备成像用载样腔室：取一个直径为 35 mm 培养皿的盖子，将其倒置，然后将一块方形玻璃盖玻片（24 × 24 mm）放置在盖子底部。具体操作示意图见 图 1（上半部分）。玻璃表面较光滑的一面可防止在开颅过程中含有幼体的琼脂糖块发生滑动。
  5. 将当天所需的 ACSF 量分装至合适的容器中（例如 50 mL 离心管、烧杯、Schott 瓶等），并用碳氧混合气（carbogen，5% CO2，95% O2）进行氧合。若仅对形态学进行成像（例如荧光模式），仍需使用 ACSF 以维持脑组织完整性，并避免细胞受到渗透压变化的不利影响，但此时无需对 ACSF 进行氧合。此步骤仅在需要保持大脑完全活跃以进行成像时才需执行。
    注意：为实现培养基的最佳氧饱和度，可在碳氧混合气管末端连接一个气石。为确保足够高的氧含量，需根据成像腔室中包埋幼体的数量和年龄，每隔 20–60 分钟更换一次成像腔室中的 ACSF（例如，单个包埋幼体每小时更换一次 ACSF 即可；若同时包埋六条年龄超过 14 dpf 的幼体，则需每 20 分钟更换一次）。请根据实验计划，预先准备足量的氧合 ACSF。

3. 幼虫包埋

  1. 使用塑料巴斯德移液管将完全麻醉的幼虫转移至（步骤 2.4 中）准备好的封片室中。然后小心去除多余的培养基，以避免低熔点琼脂糖（LM-agarose）被稀释。后续所有步骤均应在具有足够放大倍数的体视显微镜下进行。
    注意：倾斜封片室有助于彻底去除培养基。
  2. 立即进行下一步操作，即在幼虫上方加入足够大的低熔点琼脂糖液滴（约 1 mL，具体体积取决于幼虫大小），以防止幼虫干燥并减少不必要的应激。
  3. 在琼脂糖凝固前将幼虫调整至合适位置，确保幼虫的背侧朝上。同时，应尽量使幼虫嵌入位置靠近琼脂糖表面。
    注意：根据计划同时包埋的幼虫数量及其大小，可适当调整琼脂糖浓度。例如，对于 1–3 条 30 日龄的幼虫，推荐使用 1.8%–2% 的低熔点琼脂糖；对于 1–4 条 7 日龄的幼虫，最适宜使用 2.5% 的低熔点琼脂糖；而对于 5–8 条幼虫，则 2% 浓度更为合适。若需要保持脑部完全活跃状态，建议每次仅包埋三条鱼，以缩短操作时间。通常情况下，幼虫日龄越大或同时包埋的数量越多，越推荐使用较低浓度（1.8%–2%）的琼脂糖。
  4. 若使用倒置显微镜进行成像，需将包含幼虫的琼脂糖块修剪成较小的长方体形状，以便后续将幼虫转移至成像室。若使用正置显微镜，则无需修剪，因封片室本身也可作为成像室使用。在 图 1（上部）中可查看这些步骤的示意图。

4. 暴露脑组织

注意：以下所有步骤均需极其小心地操作，以避免对幼鱼造成不必要的损伤。如果实验需要完全活跃的脑组织，请注意，在幼鱼仍完全包埋于琼脂糖中且颅骨打开而未被充氧人工脑脊液（ACSF）覆盖的每一秒钟，脑组织都会因缺氧而受损，并且会逐渐干燥。缺氧的影响会随着包埋幼鱼日龄的增加而更加显著。因此，手术操作不仅需要在尽可能短的时间内完成，还必须做到最大程度的精确，以避免针头造成机械性脑损伤。经过训练后，每条鱼的步骤 4.2–4.4 所需时间不应超过 30 秒。

  1. 琼脂糖凝固后立即开始手术。首先剪除脑部目标区域上方所有多余的琼脂糖，以充分暴露头部并获得清晰的操作空间。如果头部背侧已部分露出琼脂糖表面，可跳过此步骤。
  2. 根据目标脑区选择手术起始位置。使用玻璃针在皮肤上做一个小切口，注意不要刺入过深。该切口将作为剥离覆盖皮肤的起始点。
    注意：为获得最佳效果，切勿直接在目标区域正上方开始操作，以降低损伤重要结构的风险。如有必要，甚至可从后脑后方开始，然后向前推进，直至将不需要的皮肤区域完全剥离。
  3. 沿拟去除的皮肤区域进行微小切割，操作时仅将针尖轻微移动于皮肤表层下方。通常无需围绕整个脑部完整切下一圈类似圆形的皮肤和颅骨，而只需在头部两侧各做一条切口，然后将皮肤向一侧推开即可。图2展示了为充分暴露小脑而采用的最佳切割策略示意图。
    注意：该显微手术操作精细，通常需要一定训练才能熟练地去除皮肤而不损伤下方脑组织。建议针对目标脑区确定最佳切割策略，并在实验期间保持一致。
  4. 在所有包埋幼鱼的皮肤去除后，立即向琼脂糖上灌注（含氧）人工脑脊液（ACSF），以冲走残留的皮肤碎片和血液，并维持脑组织的完全活性，防止其干燥。
    注意：若实验需要保持脑组织健康状态，建议每次处理最多不超过三条鱼。
  5. 若使用直立显微镜，可直接开始成像。
    1. 若使用倒置显微镜，用小刮铲插入立方体状琼脂糖块（步骤3.4）下方。
    2. 在成像腔室（如玻璃底培养皿）底部滴加少量低熔点琼脂糖（LM-agarose），立即用刮铲将含有幼鱼的琼脂糖块翻转180°，并轻轻压入成像腔室底部，此时液态琼脂糖起到粘合固定作用。
    3. 待琼脂糖凝固后，向成像腔室中加入（含氧）ACSF，随后开始成像。参见图1（下部）的示意图说明。
  6. 当实验需要维持全脑活性时，务必确保成像腔室中的ACSF具有足够高的氧含量。为保证这一点，应根据情况每20–60分钟小心更换一次培养基，使用新鲜氧合的ACSF（更换频率取决于鱼的数量与大小、成像腔室的尺寸与表面积以及成像持续时间）。

幼虫成像制备流程；显微镜使用实验装置示意图；麻醉剂、琼脂糖、排列步骤
图1开放颅骨斑马鱼制备的示意图流程 体内 逐步成像。 不同步骤的操作说明可在图示中找到。图示由Florian Hetsch设计，Paul Schramm修改。 请点击此处以查看此图的放大版本。

斑马鱼胚胎小脑暴露过程示意图；手术入路技术图示。
图2：对大脑目标区域上方的皮肤和颅骨进行切除的显微手术详细示意图。 红色圆圈标记了需要进行第一处切割的位置。红色虚线勾勒出用针切割的最佳路径，以无损地充分暴露小脑。绿色箭头指示了可轻松推开多余皮肤和颅骨碎片的方向。在整个操作过程中，务必避免刺入脑组织。成功剥离皮肤后，目标脑区（此处为小脑）将完全暴露，可用于各类高分辨率成像 体内 成像 请点击此处以查看此图的放大版本。

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结果

图3A，C 显示转基因品系 Tg[-7.5Ca8:GFP] 的 14 天龄幼鱼bz1215] 颅骨仍保持完整，覆盖其上的皮肤色素细胞分布于整个头部，在目标区域（此处为小脑）干扰了荧光信号。在此状态下，无法对幼鱼脑部获取高分辨率图像。 图3B 显示了同一转基因品系幼虫在完成开颅手术后的状态。此时，目标区域已完全暴露，激发激光和发射的荧光可直接穿透组织，避免了散射和反射。对该幼虫采集的图像将获得高分辨率的精细图像。图3D），可与离体脑成像相媲美，但其优势在于脑组织仍处于完全活跃状态。此外，由于无需使用多聚甲醛固定，脑组织不会像固定后摘除的脑样本那样发生荧光强度的损失。在颅骨打开的幼虫中，脑组织可直接接触，神经元保持完全活性，所有生理连接完整，并能正常接收来自感觉系统的感觉输入...

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讨论

所介绍的方法提供了一种替代方案，用于斑马鱼幼鱼脑组织的分离或通过药物处理抑制其色素沉着，以便对神经元进行高分辨率成像记录 体内 环境。采用该方法记录的图像质量可与离体脑组织的图像相媲美，且是在自然条件下实现的。

此外，由于无需使用固定剂处理18，因此可避免荧光强度的减弱。同时，该方法不像脑组织分离那样具有侵入性，且仅包含一个可能导致失败的关键步骤，因此与脑组织分离相比，成功制备的概率更高。最重要的优势在于，该方法适用于活体（in vivo）成像记录。只要颅骨开窗操作精确、迅速且成功，并定期监测人工脑脊液（ACSF）的氧饱和度，脑组织应可在数小时内保持完全功能和活性。根据电生理记录、血液循环、呼吸状况以及鱼类在术后数天的存活情况，我们认为去除皮肤和颅骨对整体健康无明显不利影响。因此，该方法可用于健康且功能正常的脑组织中细胞和亚细胞过程的实时成像，且不会受到干扰成像的色素沉着影响。本方法在本实验室是用于活体（in vivo）神经元活动电生理记录的标准操作，并在全球其他电生理实验室中也已...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们特别感谢 Timo Fritsch 在动物护理方面的出色工作，以及 Hermann Döring、Mohamed Elsaey、Sol Pose-Méndez、Jakob von Trotha、Komali Valishetti 和 Barbara Winter 提供的有益支持。我们还感谢 Köster 实验室所有其他成员给予的反馈。本项目部分得到了德国研究基金会（DFG, KO1949/7-2）项目 241961032（授予 RWK）以及德国联邦教育与研究部（BMBF；Era-Net NEURON II CIPRESS 项目 01EW1520，授予 JCM）的资助，特此致谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钙RothA119.1
共聚焦激光扫描显微镜LeicaTCS SP8
D-葡萄糖SigmaG8270-1KG
D-筒箭毒碱Sigma-AldrichT2379-100MG
玻璃毛细管类型1WPI1B150F-4
玻璃毛细管类型2Harvard ApparatusGC100F-10
玻璃盖玻片deltalabD102424
HEPESRoth9105.4
Hoechst 33342Invitrogen (Thermo Fischer)H3570
成像培养皿Ibidi81156
氯化钾Normapur26764298
LM-琼脂糖Condalab8050.55
氯化镁（六水合物）RothA537.4
显微镜相机LeicaDFC9000 GTC
针头拉制仪类型1NARISHIGEModel PC-10
针头拉制仪类型2Sutter InstrumentsModel P-2000
巴斯德移液管 3mlA.Hartenstein20170718
氯化钠RothP029.2
氢氧化钠Normapur28244262
三卡因Sigma-AldrichE10521-50G
水浴锅Phoenix InstrumentWB-12
35 mm 培养皿Sarstedt833900
90 mm 培养皿Sarstedt821473001

参考文献

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