方法文章

使用 E1A 微型工具研究 mRNA 拼接更改

DOI：

10.3791/62181

⸱

2021年4月22日

 ,  , 
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de Campinas

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议提供了一个快速和有用的工具，用于评估化疗后在替代拼接调节中具有非同寻常功能的蛋白质的作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA 处理涉及多个同时步骤，为翻译准备 mRNA，例如 5'封顶、多 A 添加和拼接。除了构成拼接外，替代mRNA拼接还允许从一个基因中表达多功能蛋白质。由于相互作用研究通常是对新蛋白质或未知蛋白质的第一次分析，诱饵蛋白与拼接因子的关联表明它可以参与mRNA拼接过程，但确定在什么情况下或在什么情况下调节基因是一个经验过程。评估此功能的良好起点是使用经典的迷你基因工具。在这里，我们介绍腺卵巢E1A微型基因的用法，用于评估不同细胞应激刺激后的替代拼接变化。我们评估了E1A微基因在 HEK293 中拼接，经过不同的应力处理后，稳定过度表达 Nek4 蛋白质。该协议包括E1A微基因转染、细胞治疗、RNA提取和cDNA合成，然后是PCR和凝胶分析和E1A拼接变种的量化。使用这种简单和成熟的方法与特定的治疗相结合是一个可靠的起点，可以揭示细胞过程或哪些基因可以通过mRNA拼接调节。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

拼接是真核 mRNA 处理中最重要的步骤之一，同时发生到 5mRNA 封顶和 3mRNA 聚腺化，包括内电拆除，然后是外向结。拼接点 （SS） 的识别由拼接体， 核糖核蛋白复合物包含小核糖核蛋白 （snRNP U1， U2， U4 和 U6）， 小RNA （snRNA） 和几个调节蛋白1 是拼接的必要条件。

除了内电拆卸（构成拼接），在真核生物中，可以保留内子，可以排除外在，配置称为 mRNA 替代拼接 （AS） 的过程。替代的mRNA前拼接扩展了真核基因组的编码能力，允许从相对较少的基因中产生大量和多样化的蛋白质。据估计，95-100%的含有多个外在物的人类mRNA可以进行替代拼接2，3。这是神经元发育、凋亡活化和细胞应激反应4等生物过程的基础，为生物体提供了利用相同的基因来调节细胞功能的替代方案。

替代拼接所需的机械与构成拼接所用的机械相同，SS 的使用是替代拼接发生的主要决定因素。构成拼接与使用强拼接点有关，通常更类似于拼接体识别5的共识主题。

替代外显子通常比构成外显子识别效率低，一旦其 ci....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 电镀细胞

注:在此描述的协议中，HEK293稳定细胞系，以前生成的稳定诱导表达Nek4被使用21，但是，相同的协议是适合许多其他细胞系，如HK29322，HeLa23，24，25，26，U-2OS27，COS728，SH-SY5Y29。在基础条件下，微基因E1A等形体的表达模式在这些细胞之间各不相同，应针对每个条件进行特征。此协议不限于稳定的单元格线。在候选蛋白质的评价中，最常见的方法是通过瞬态共变，增加其数量与小基因的固定量。相同的协议适用于淘汰单元格。

  1. 考虑车辆、未传输和 GFP 控制的板细胞。
  2. 培养 HEK293 细胞，稳定表达对杜尔贝科改良鹰介质 （DMEM） 感兴趣的基因，辅以 10% 的胎儿牛血清 （FBS）， 4.5 克/升葡萄糖， 4 mM L-Glutamine，在组织培养处理板上保持100微克/mL的催眠素B，在5%CO2....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用E1A迷你基因进行了5'拼接位点检测，以评估化疗后细胞拼接轮廓的变化。在评估了 Paclitaxel 或顺铂治疗后，Nek4 - 等形 1 在 HEK293 稳定细胞中的 AS 调节中的作用。

腺体E1A地区负责从一个RNA前体生产三个主要的mRNA，因为使用不同的拼接捐赠者。它们共享共同的 5' 和 3' 术语，但其消费税的大小不同。腺素 E1A mRNA 是根据沉积系数、13S、12S 和 9S 命名的。在腺病毒感染的早期阶段（约7小时），产生重要的蛋白质，为病毒DNA复制准备受感染细胞（13S - 723 aa和12S - 586 aa），并在后期（约18小时）除了这些，一个小蛋白质（9S-249 aa）产生20。使用含有E1A微基因的质粒，在转染后可观察到对替代拼接的影响，评估从每个同位素中产生的mRNA的比例:13S:631 bp，12S:493 bp和9S 156 bp（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微基因是确定全球替代拼接在体内的影响的重要工具。腺微基因E1A已经成功地使用了几十年，通过增加这些在细胞13，14中的数量来评估蛋白质的作用。在这里，我们建议使用微型E1A来评估化疗暴露后的替代拼接。使用了表达Nek4等离子体1的稳定细胞线，避免了瞬态瞬态感染引起的过度表达。Nek4的同位素1在基础条件下的微基因E1A替代拼接中没有显示出效果，但有许多拼接相关相互作用，因此，使我们能够评估这些细胞中E1A替代拼接的化疗治疗的具体效果。

尽管其灵敏度较低，主要与放射性方法相比，这里描述的方法很简单，不需要特殊的试剂或实验室条件。然而，重要的是要注意，迷你基因E1A是全球记者的5的SS选择，虽然3的SS选择可以评估与这个协议，特定的迷你基因记者必须使用14，33，34。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢圣保罗埃斯塔多·安帕罗基金会（FAPESP， 通过格兰特·特梅蒂科 2017/03489-1 到 JK 和研究金 FLB 2018/05350-3） 和康塞略国家德森沃尔维托科学公司 （CNPq） 资助这项研究。我们要感谢阿德里安·克雷纳博士提供了pMTE1A质粒和泽勒及其同事在E1A克隆方面所做的工作。我们还要感谢帕特里西亚·莫里尔教授、万达·佩雷拉·阿尔梅达教授、马塞洛·兰斯洛蒂教授和卡琳娜·科戈·科戈·穆勒教授允许我们使用他们的实验室空间和设备。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 pb DNA 分子量标准Invitrogen15628-050
6 孔板Sarstedt833920
琼脂糖SigmaA9539-250G
顺铂SigmaP4394
DEPC 水ThermoFisherAM9920
DMEMThermoFisher11965118
dNTP 混合物ThermoFisher10297-018
胎牛血清 - FBSThermoFisher12657029
荧光显微镜LeicaDMIL LED FLUO
凝胶成像采集系统 - ChemiDoc 凝胶图像系统Bio-Rad
GFP - pEGFPC3Clontech
HEK293 稳定细胞 - HEK293 Flp-In由 Flp-In&trade 生成;T-REx™293 - Invitrogen 和参考文献 21
中描述的潮霉素 BThermoFisher10687010用于 Flp-In 细胞维护
图像处理和分析软件 - 斐济软件参考文献 32
基于脂质的转染试剂 - jetOPTIMUS Polyplus 试剂Polyplus117-07
寡核苷酸 DTThermoFisher18418020
PaclitxelInvitrogenP3456
读板器/ 紫外吸光度生物技术Epoch Biotek/ Take3 适配器
pMTE1A 质粒由 Adrian Krainer 博士提供
pMTE1A FInvitrogen 5 分钟-ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A RInvitrogen5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'
冷冻离心机EppendorfF5810R
逆转录酶 - M-MLVThermoFisher28025013
逆转录酶 - SuperscriptIV，ThermoFisher18090050
糖核酸酶抑制剂 RNAseOUT，ThermoFisher10777-019
RNA 提取苯酚-氯仿试剂 - TrizolThermoFisher15596018
SybrSafe DNA 凝胶染料ThermoFisherS33102
Taq PlatinumThermo10966026
TetracyclinSigmaT3383用于 Flag 空或 Nek4- Flag 表达诱导
热循环仪 Bio-RadBio-RadT100
胰蛋白酶SigmaT4799
核

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

HEK293 RNA cDNA PCR

相关文章