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方法文章

利用E1A微基因工具研究mRNA剪接变化

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DOI：

10.3791/62181

⸱

2021年4月22日

 ,  , 
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de Campinas

本文内容

摘要

本方案提供了一种快速且实用的工具，用于评估在化疗处理后功能尚未明确的蛋白质在选择性剪接调控中的作用。

摘要

mRNA加工涉及多个同时进行的步骤，以准备mRNA进行翻译，例如5´端加帽、添加多聚A尾以及剪接。除了组成型剪接外，mRNA的选择性剪接使得单个基因能够表达多种功能的蛋白质。由于相互作用组研究通常是针对新蛋白或未知蛋白的初步分析，诱饵蛋白与剪接因子之间的关联提示其可能参与mRNA剪接过程；但要确定其在何种背景下或调控哪些基因，则需要通过实验验证。评估这一功能的一个良好起点是使用经典的微型基因（minigene）工具。本文介绍了利用腺病毒E1A微型基因来评估在不同细胞应激刺激后发生的选择性剪接变化。我们检测了在不同应激处理后，稳定过表达Nek4蛋白的HEK293细胞中E1A微型基因的剪接情况。该实验方案包括E1A微型基因转染、细胞处理、RNA提取与cDNA合成，随后进行PCR扩增、凝胶分析以及E1A剪接异构体的定量。将这一简单且成熟的方法与特定处理相结合，是揭示细胞过程或鉴定受mRNA剪接调控基因的可靠起点。

引言

剪接是真核生物mRNA加工过程中最重要的步骤之一，与5´端mRNA加帽和3´端mRNA多聚腺苷酸化同时发生，包括内含子的去除以及外显子的连接。剪接体对剪接位点（SS）的识别是剪接所必需的，剪接体是一种核糖核蛋白复合物，包含小核核糖核蛋白（snRNP U1、U2、U4和U6）、小核RNA（snRNA）以及多种调控蛋白1。

除了内含子的移除（组成型剪接）外，在真核生物中，内含子也可能被保留，外显子则可能被排除，从而形成称为mRNA可变剪接（AS）的过程。前体mRNA的可变剪接扩展了真核生物基因组的编码能力，使得从相对较少数量的基因中能够产生大量且多样化的蛋白质。据估计，95%至100%含有两个以上外显子的人类mRNA可以经历可变剪接2,3。这对于神经元发育、凋亡激活以及细胞应激反应等生物学过程至关重要4，使生物体能够利用相同的基因库调控细胞功能的多种选择。

实现可变剪接所需的机制与组成型剪接所用的机制相同，而剪接位点（SS）的使用是决定可变剪接是否发生的主要因素。组成型剪接通常与强剪接位点的使用相关，这些位点通常更接近剪接体识别的共识序列模体5。

与组成型外显子相比，选择性外显子通常被识别的效率较低，这是因为其cis-调控元件（即位于这些外显子侧翼的5´剪接位点（5´SS）和3´剪接位点（3´SS）中的序列）与剪接体的结合能力较弱。mRNA中还含有被称为增强子或沉默子的区域，它们位于外显子内（外显子剪接增强子（ESEs）和外显子剪接沉默子（ESSs））或内含子内（内含子剪接增强子（ISEs）和内含子剪接沉默子（ISSs）），分别促进或抑制外显子的使用5。这些序列由反式调控元件，即剪接因子（SF）识别。剪接因子主要由两类蛋白质代表：丝氨酸/精氨酸富集型剪接因子（SRSFs），其结合于ESEs；以及异质性核核糖核蛋白家族（hnRNPs），其结合于ESSs序列5。

可变剪接可通过剪接因子的转录因子发生磷酸化/去磷酸化来调控，从而改变剪接因子的相互作用伙伴及其细胞内定位6,7,8。发现新的剪接因子调控分子可为调控剪接过程提供新工具，并进而推动某些癌症治疗方法的发展。

Anufrieva 等人9通过 mRNA 微阵列基因表达谱分析，观察到在 101 种细胞系以及不同应激条件下（如铂类药物、γ射线辐照、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和紫杉烷类），剪接体组分水平均发生一致性的变化。剪接模式与化疗疗效之间的关系已在肺癌细胞中得到证实：化疗耐药的肺癌细胞表现出caspase-9异构体比例的改变10。经化疗药物处理的 HEK293 细胞显示出剪接模式的变化，促凋亡异构体的比例增加。Gabriel 等人11发现，在不同细胞系中经顺铂处理后，至少有 700 个剪接事件发生改变，表明剪接通路受到顺铂的影响。剪接调节剂已被证实具有抗肿瘤活性，说明剪接在肿瘤发生发展以及化疗反应中具有重要作用12。因此，鉴定在化疗药物等细胞应激因子作用后调控剪接的新蛋白，对于发现新的治疗策略具有重要意义。

来自相互作用组研究的可变剪接调控线索，对于表征新蛋白或功能未明蛋白的功能尤为重要，这需要一种更通用且简便的方法来验证蛋白在可变剪接（AS）中的真实作用。微型基因（minigene）是分析影响剪接调控的蛋白普遍功能的重要工具。它们包含来自目的基因的片段，这些片段含有可变剪接区域及其侧翼基因组区域13。使用微型基因工具可在体内分析剪接过程，具有多种优势：微型基因长度较短，因此不会限制扩增反应；同一微型基因可在不同细胞系中进行评估；所有细胞组分，尤其是调控性的翻译后修饰（如磷酸化）以及细胞区室的变化均存在并可被研究13,14。此外，可在细胞应激后观察到可变剪接模式的变化，而利用微型基因系统有助于鉴定被不同刺激所调控的信号通路。

已有多种针对不同剪接事件的微型基因系统被报道13,14，然而，作为初步检测手段，E1A微型基因15是一种非常成熟的可变剪接报告系统，可用于体内5′剪接位点（5′SS）选择的研究。仅从E1A一个基因，通过选择三个不同的5′剪接位点以及一个主要或一个次要的3′剪接位点，即可通过可变剪接产生五种mRNA16,17,18。E1A剪接变异体的表达随腺病毒感染时期的不同而发生变化19,20。

我们先前已证明，Nek4 的两种同工型均能与剪接因子（如 SRSF1 和 hnRNPA1）相互作用，其中同工型 2 可改变 E1A 微基因的可变剪接，而同工型 1 在该条件下无此作用21。由于同工型 1 是最丰富的同工型，且可影响化疗耐药性和 DNA 损伤应答，因此我们评估其是否在应激条件下改变 E1A 微基因的可变剪接。

微型基因检测是一种简单、低成本且快速的方法，仅需RNA提取、cDNA合成、扩增及琼脂糖凝胶分析，即可作为评估从目标蛋白对可变剪接的潜在影响到不同处理对细胞可变剪接模式影响的有用工具。

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方案

1. 铺板细胞

注意：在本方案中，使用了先前构建的 HEK293 稳定细胞系，用于实现 Nek4 的稳定诱导表达21，但该方案同样适用于其他多种细胞系，例如 HEK29322、HeLa23,24,25,26、U-2 OS27、COS728、SH-SY5Y29。在基础条件下，这些细胞中 minigene E1A 亚型的表达模式各不相同，应针对每种条件进行表征。本方案不仅限于稳定细胞系。评估候选蛋白最常用的方法是通过瞬时共转染，在固定 minigene 量的基础上逐步增加目标蛋白的表达量。该方案同样适用于基因敲除细胞。

  1. 接种细胞时需设置溶剂对照、未转染对照和GFP对照。
  2. 将稳定表达目的基因的HEK293细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、4.5 g/L葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并在含100 µg/mL潮霉素B的组织培养处理板中，于37 °C、5% CO2及湿润环境中维持培养。
  3. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，以每孔3 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
    ​注意：进行转染时，细胞融合度应达到70–80%，以降低转染后细胞死亡率。

2. 细胞转染

注意：此处使用了1-2 µg的pMTE1A微基因质粒，但为了防止毒性，DNA用量以及表达时间必须尽可能降低。例如，在转染1 µg pMTE1A DNA 30小时后，HeLa细胞中观察到较高的毒性。本实验所描述的转染操作采用了基于脂质的转染试剂。

  1. 铺板后24小时检查细胞融合度，仅在细胞融合度达到70-80%时对HEK293稳定细胞进行转染。
  2. 使用移液器小心吸除细胞培养基，避免使用真空泵系统。然后小心加入2 mL不含抗生素的完全DMEM培养基，并将培养板放回培养箱中。
  3. 准备一个含有转染缓冲液（每孔200 µL）的离心管，加入2 µg pMTE1A DNA，涡旋混匀后加入2 µL转染试剂。再次涡旋混匀，在室温下孵育10分钟。
  4. 从培养箱中取出培养板，小心地将转染混合物逐滴加入。
  5. 转染6小时后，向HEK293稳定细胞中加入四环素（0.5 µg/mL）以诱导Nek4表达。无需更换培养基。
    ​注意：本节所述体积/用量均为单孔用量。请在同一离心管中配制实验所用所有孔的混合液。
  6. 准备一孔细胞转染EGFP或其他表达荧光蛋白的质粒，以评估转染效率。当转染效率至少达到40%时可获得更佳结果，但以往研究中也观察到较低转染效率下仍可获得良好表现。
  7. 若进行共转染（目的蛋白与微型基因），应保留一孔未转染细胞，以避免检测结果受到内源性mRNA的干扰。以E1A为例，HEK293细胞本身已表达E1A基因30。

3. 药物的制备

注意：处理时间和浓度的选择基于文献结果，这些结果指出某些基因的可变剪接发生了变化。

  1. 在开始实验前进行剂量-反应曲线分析，以确定在不影响细胞活力的前提下诱导选择性剪接的最低浓度。
  2. 用乙醇配制浓度为 5 mM 的紫杉醇储备液。工作浓度为 1 µM。保存于 -20 °C。以 0.02% 乙醇作为溶剂对照。
  3. 将顺铂用 0.9% NaCl 稀释至约 0.5 mg/mL（1.66 mM）的浓度。避光操作，涡旋混匀后置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。工作浓度为 30 µM。现配现用，或于 2–10 °C 保存，最长不超过一个月。
    ​注意：所有药物均需避光保存。

4. 细胞处理与收集

注意：转染后48小时收集HEK293稳定细胞，因为转染后24小时开始处理，Nek4表达水平在48小时内达到最高。然而，此时观察到13S亚型的表达水平较高（高达90%）。为降低13S亚型所占比例，建议在转染后最多30小时进行处理并收集细胞。

  1. 使用无 RNA/DNase 的枪头和离心管。按照制造商的说明，使用苯酚-氯仿试剂进行总 RNA 提取。
  2. 转染后 24 小时，使用荧光显微镜观察细胞形态并验证转染效率。
  3. 移除细胞培养基，建议使用移液器而非真空泵系统。然后向孔中加入含有化疗药物的细胞培养基，终浓度如前所述。
  4. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 18 - 24 小时。
  5. 将细胞培养基弃入专用容器中，直接向孔中加入 0.5 - 1 mL RNA 提取试剂以收集 RNA。若细胞密度过高，建议使用 1 mL RNA 提取试剂以提高 RNA 质量。
  6. 用移液器充分混匀后转移至 1.5 mL 离心管中。此时可选择将样品在 -80 °C 保存以暂停实验流程，或立即进行 RNA 提取。
    ​警告：基于苯酚的 RNA 提取试剂具有毒性，所有操作应在化学通风橱中进行，并妥善处理废弃物。

5. RNA 提取与 cDNA 合成

  1. 在通风橱中解冻样品，并在室温下孵育5分钟。加入0.1–0.2 mL氯仿，剧烈振荡。
  2. 在室温下孵育3分钟。
  3. 在4 °C条件下，以12,000 × g 离心15分钟。
  4. 收集上层水相，转移至新的1.5 mL离心管中。收集总体积的约60%；但避免收集DNA或有机相（下层）。
  5. 加入0.25–0.5 mL异丙醇，颠倒混匀4次。在室温下孵育10分钟。
  6. 在4 °C条件下，以12,000 × g 离心10分钟，弃去上清液。
  7. 用75%乙醇（溶于焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中）洗涤RNA沉淀两次。在7,500 × g 条件下离心5分钟，弃去乙醇。
  8. 将离心管倒置在纸巾上以去除残留乙醇，然后将管口敞开置于通风橱中，使沉淀部分干燥5–10分钟。
  9. 将RNA沉淀重悬于15 µL DEPC处理过的水中。
  10. 通过测定230 nm、260 nm和280 nm处的吸光度来定量总RNA，以评估RNA质量。
  11. 为验证总RNA质量，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，该凝胶需预先用1.2%（v/v）的2.5%次氯酸钠溶液处理30分钟31。
  12. 使用1–2 µg总RNA进行cDNA合成。
    1. 用移液器加入RNA、1 µL寡聚dT引物（50 µM）、1 µL dNTP（10 mM），并用无核酸酶水补足至12 µL。在PCR仪中65 °C孵育5分钟。
    2. 从PCR仪中取出样品冷却，并配制反应混合液：4 µL逆转录酶缓冲液、2 µL二硫苏糖醇（DTT）和1 µL核糖核酸酶抑制剂。37 °C孵育2分钟。
    3. 加入1 µL耐热逆转录酶。37 °C孵育50分钟，然后70 °C孵育15分钟以灭活酶。
      ​注意：cDNA可在-20 °C保存数周。应设置无逆转录酶（NRT）对照，以排除基因组DNA污染，并用于鉴别潜在的内含子滞留事件。

6. pMTE1A 微基因 PCR

  1. 使用以下反应体系进行PCR（1.5 mM MgCl2、0.3 mM dNTP混合物、每种引物0.5 µM、2.5 U热启动Taq DNA聚合酶和150 ng cDNA），反应条件如下：
    94 °C 预变性2 min， 29 个循环：94 °C 变性1 min，50 °C 退火2 min，72 °C 延伸2 min， 最后72 °C 延伸10 min。
  2. 取20–25 µL PCR产物加入含核酸染料的3%琼脂糖凝胶中，100 V电泳约1小时。

7. 使用图像处理与分析软件分析凝胶32

  1. 电泳结束后，使用凝胶成像系统拍摄凝胶照片，避免条带饱和，并使用 图像处理软件对条带进行定量分析。
  2. 定量时，将约 631 bp、约 493 bp 和约 156 bp 处的条带分别对应于 13S、12S 和 9S 亚型。
  3. 在软件的 文件 菜单中，打开从成像系统获取的图像文件。将其转换为灰度图像，调整亮度和对比度，必要时去除异常噪声。
  4. 使用 矩形选择 工具在第一泳道周围绘制一个矩形，然后通过 分析 | 凝胶 | 选择第一泳道 命令或按下相应的键盘快捷键进行选中。
  5. 用鼠标点击并按住第一个矩形的中心位置，将其拖动到下一个泳道。进入 分析 | 凝胶 | 选择下一泳道，或按下相应的快捷键。对所有剩余泳道重复此步骤。
  6. 当所有泳道均被高亮并编号后，进入 分析 | 凝胶 | 绘制泳道，以生成每个泳道的轮廓图。
  7. 使用 直线选择 工具，在每个对应条带的峰底横跨画线，排除背景噪声。在所有泳道的每个峰均被封闭后，选择 魔棒 工具，并点击每个峰的内部区域。每个被高亮的峰，其测量值应自动出现在弹出的 结果 窗口中。
  8. 对每个样品的 3 个条带强度求和，并计算每种亚型占总量的百分比。
  9. 绘制每种亚型的百分比，或绘制相对于未处理样品的百分比差异。
    注意：三种 E1A 变体的总和必须等于 100%。

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结果

采用E1A微型基因进行5´剪接位点检测，以评估化疗药物处理后细胞剪接谱的变化。在经紫杉醇或顺铂处理的HEK293稳定细胞中，评估了Nek4-亚型1在可变剪接调控中的作用。

腺病毒E1A区域能够利用不同的剪接供体位点，从一个RNA前体产生三种主要的mRNA。这些mRNA具有相同的5'和3'末端，但被剪切的内含子大小不同。腺病毒E1A的mRNA根据其沉降系数命名为13S、12S和9S。在腺病毒感染的早期阶段（约7小时），会表达对病毒DNA复制准备至关重要的蛋白质（13S - 723个氨基酸和12S - 586个氨基酸）；而在晚期阶段（约18小时），除上述蛋白外，还会产生一种小分子蛋白（9S - 249个氨基酸）20。通过使用含有E1A微小基因（minigene）的质粒，可在转染细胞后评估各亚型mRNA的产生比例，从而观察其对可变剪接的影响：13S为631 bp，12S为493 bp，9S为156 bp（

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讨论

微型基因是用于确定体内全局选择性剪接效应的重要工具。腺病毒微型基因E1A已被成功使用数十年，通过增加细胞内特定蛋白的表达量来评估其功能13,14。本文中，我们提出利用E1A微型基因评估化疗药物处理后对选择性剪接的影响。实验采用稳定表达Nek4异构体1的细胞系，以避免瞬时转染导致的过表达假象。在基础条件下，Nek4异构体1对E1A微型基因的选择性剪接无显著影响21，但其具有多个与剪接相关的相互作用分子，因此可借此评估化疗处理对这些细胞中E1A选择性剪接的特异性效应。

尽管该方法的灵敏度较低，尤其是与放射性方法相比，但本文所述方法操作简便，且无需特殊试剂或特殊实验室条件。然而，需要注意的是，minigene E1A 是一种用于报告 5´剪接位点（5´SS）选择的通用报告系统，虽然本实验方案也可用于评估 3´剪接位点（3´SS）的选择，但必须使用特定的 minigene 报告系统14

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，通过项目号2017/03489-1对JK的资助及对FLB的奖学金2018/05350-3）以及国家科学技术发展委员会（CNPq）对本研究的经费支持。感谢Adrian Krainer博士提供pMTE1A质粒，感谢Zerler及同事在E1A克隆方面的工作。同时感谢Patrícia Moriel教授、Wanda Pereira Almeida教授、Marcelo Lancellotti教授和Karina Kogo Cogo Müller教授允许我们使用其实验室空间和设备。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 bp DNA LadderInvitrogen15628-050
6 孔板Sarstedt833920
琼脂糖SigmaA9539-250G
顺铂SigmaP4394
DEPC 水ThermoFisherAM9920
DMEM 培养基ThermoFisher11965118
dNTP 混合液ThermoFisher10297-018
胎牛血清 - FBSThermoFisher12657029
荧光显微镜LeicaDMIL LED FLUO
凝胶成像系统 - ChemiDoc 凝胶成像系统Bio-Rad
GFP - pEGFPC3 质粒Clontech
HEK293 稳定细胞系 - HEK293 Flp-In由 Flp-In™ T-REx™ 293 细胞（Invitrogen）构建，详见参考文献 21
潮霉素 BThermoFisher10687010用于 Flp-In 细胞的维持培养
图像处理与分析软件 - FIJI 软件参考文献 32
脂质体转染试剂 - jetOPTIMUS Polyplus 试剂Polyplus117-07
寡聚 dTThermoFisher18418020
紫杉醇InvitrogenP3456
酶标仪 / 紫外吸光度检测仪BiotechEpoch Biotek / Take3 适配器
pMTE1A 质粒由 Adrian Krainer 博士提供
pMTE1A FInvitrogen 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A RInvitrogen5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’
冷冻离心机EppendorfF5810R
逆转录酶 - M-MLVThermoFisher28025013
逆转录酶 - SuperScript IVThermoFisher18090050
核糖核酸酶抑制剂 RNase OUTThermoFisher10777-019
基于苯酚-氯仿法的 RNA 提取试剂 - TrizolThermoFisher15596018
SybrSafe DNA 凝胶染料ThermoFisherS33102
Taq Platinum DNA 聚合酶Thermo10966026
四环素SigmaT3383用于 Flag 空载体或 Nek4-Flag 表达的诱导
PCR 仪 Bio-RadBio-RadT100
胰蛋白酶SigmaT4799

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