利用E1A微基因工具研究mRNA剪接变化

摘要

本方案提供了一种快速且实用的工具，用于评估在化疗处理后功能尚未明确的蛋白质在选择性剪接调控中的作用。

摘要

mRNA加工涉及多个同时进行的步骤，以准备mRNA进行翻译，例如5´端加帽、添加多聚A尾以及剪接。除了组成型剪接外，mRNA的选择性剪接使得单个基因能够表达多种功能的蛋白质。由于相互作用组研究通常是针对新蛋白或未知蛋白的初步分析，诱饵蛋白与剪接因子之间的关联提示其可能参与mRNA剪接过程；但要确定其在何种背景下或调控哪些基因，则需要通过实验验证。评估这一功能的一个良好起点是使用经典的微型基因（minigene）工具。本文介绍了利用腺病毒E1A微型基因来评估在不同细胞应激刺激后发生的选择性剪接变化。我们检测了在不同应激处理后，稳定过表达Nek4蛋白的HEK293细胞中E1A微型基因的剪接情况。该实验方案包括E1A微型基因转染、细胞处理、RNA提取与cDNA合成，随后进行PCR扩增、凝胶分析以及E1A剪接异构体的定量。将这一简单且成熟的方法与特定处理相结合，是揭示细胞过程或鉴定受mRNA剪接调控基因的可靠起点。

引言

剪接是真核生物mRNA加工过程中最重要的步骤之一，与5´端mRNA加帽和3´端mRNA多聚腺苷酸化同时发生，包括内含子的去除以及外显子的连接。剪接体对剪接位点（SS）的识别是剪接所必需的，剪接体是一种核糖核蛋白复合物，包含小核核糖核蛋白（snRNP U1、U2、U4和U6）、小核RNA（snRNA）以及多种调控蛋白¹。

除了内含子的移除（组成型剪接）外，在真核生物中，内含子也可能被保留，外显子则可能被排除，从而形成称为mRNA可变剪接（AS）的过程。前体mRNA的可变剪接扩展了真核生物基因组的编码能力，使得从相对较少数量的基因中能够产生大量且多样化的蛋白质。据估计，95%至100%含有两个以上外显子的人类mRNA可以经历可变剪接^2,3。这对于神经元发育、凋亡激活以及细胞应激反应等生物学过程至关重要⁴，使生物体能够利用相同的基因库调控细胞功能的多种选择。

实现可变剪接所需的机制与组成型剪接所用的机制相同，而剪接位点（SS）的使用是决定可变剪接是否发生的主要因素。组成型剪接通常与强剪接位点的使用相关，这些位点通常更接近剪接体识别的共识序列模体⁵。

方案

1. 铺板细胞

注意：在本方案中，使用了先前构建的 HEK293 稳定细胞系，用于实现 Nek4 的稳定诱导表达²¹，但该方案同样适用于其他多种细胞系，例如 HEK293²²、HeLa^23,24,25,26、U-2 OS²⁷、COS7²⁸、SH-SY5Y²⁹。在基础条件下，这些细胞中 minigene E1A 亚型的表达模式各不相同，应针对每种条件进行表征。本方案不仅限于稳定细胞系。评估候选蛋白最常用的方法是通过瞬时共转染，在固定 minigene 量的基础上逐步增加目标蛋白的表达量。该方案同样适用于基因敲除细胞。

1. 接种细胞时需设置溶剂对照、未转染对照和GFP对照。
2. 将稳定表达目的基因的HEK293细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、4.5 g/L葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并在含100 µg/mL....

结果

采用E1A微型基因进行5´剪接位点检测，以评估化疗药物处理后细胞剪接谱的变化。在经紫杉醇或顺铂处理的HEK293稳定细胞中，评估了Nek4-亚型1在可变剪接调控中的作用。

腺病毒E1A区域能够利用不同的剪接供体位点，从一个RNA前体产生三种主要的mRNA。这些mRNA具有相同的5'和3'末端，但被剪切的内含子大小不同。腺病毒E1A的mRNA根据其沉降系数命名为13S、12S和9S。在腺病毒感染的早期阶段（约7小时），会表达对病毒DNA复制准备至关重要的蛋白质（13S - 723个氨基酸和12S - 586个氨基酸）；而在晚期阶段（约18小时），除上述蛋白外，还会产生一种小分子蛋白（9S - 249个氨基酸）²⁰。通过使用含有E1A微小基因（minigene）的质粒，可在转染细胞后评估各亚型mRNA的产生比例，从而观察其对可变剪接的影响：13S为631 bp，12S为493 bp，9S为156 bp（

讨论

微型基因是用于确定体内全局选择性剪接效应的重要工具。腺病毒微型基因E1A已被成功使用数十年，通过增加细胞内特定蛋白的表达量来评估其功能^13,14。本文中，我们提出利用E1A微型基因评估化疗药物处理后对选择性剪接的影响。实验采用稳定表达Nek4异构体1的细胞系，以避免瞬时转染导致的过表达假象。在基础条件下，Nek4异构体1对E1A微型基因的选择性剪接无显著影响²¹，但其具有多个与剪接相关的相互作用分子，因此可借此评估化疗处理对这些细胞中E1A选择性剪接的特异性效应。

尽管该方法的灵敏度较低，尤其是与放射性方法相比，但本文所述方法操作简便，且无需特殊试剂或特殊实验室条件。然而，需要注意的是，minigene E1A 是一种用于报告 5´剪接位点（5´SS）选择的通用报告系统，虽然本实验方案也可用于评估 3´剪接位点（3´SS）的选择，但必须使用特定的 minigene 报告系统¹⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050
6 孔板	Sarstedt	833920
琼脂糖	Sigma	A9539-250G
顺铂	Sigma	P4394
DEPC 水	ThermoFisher	AM9920
DMEM 培养基	ThermoFisher	11965118
dNTP 混合液	ThermoFisher	10297-018
胎牛血清 - FBS	ThermoFisher	12657029
荧光显微镜	Leica	DMIL LED FLUO
凝胶成像系统 - ChemiDoc 凝胶成像系统	Bio-Rad
GFP - pEGFPC3 质粒	Clontech
HEK293 稳定细胞系 - HEK293 Flp-In			由 Flp-In™ T-REx™ 293 细胞（Invitrogen）构建，详见参考文献 21
潮霉素 B	ThermoFisher	10687010	用于 Flp-In 细胞的维持培养
图像处理与分析软件 - FIJI 软件			参考文献 32
脂质体转染试剂 - jetOPTIMUS Polyplus 试剂	Polyplus	117-07
寡聚 dT	ThermoFisher	18418020
紫杉醇	Invitrogen	P3456
酶标仪 / 紫外吸光度检测仪	Biotech		Epoch Biotek / Take3 适配器
pMTE1A 质粒			由 Adrian Krainer 博士提供
pMTE1A F	Invitrogen	5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A R	Invitrogen	5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’
冷冻离心机	Eppendorf	F5810R
逆转录酶 - M-MLV	ThermoFisher	28025013
逆转录酶 - SuperScript IV	ThermoFisher	18090050
核糖核酸酶抑制剂 RNase OUT	ThermoFisher	10777-019
基于苯酚-氯仿法的 RNA 提取试剂 - Trizol	ThermoFisher	15596018
SybrSafe DNA 凝胶染料	ThermoFisher	S33102
Taq Platinum DNA 聚合酶	Thermo	10966026
四环素	Sigma	T3383	用于 Flag 空载体或 Nek4-Flag 表达的诱导
PCR 仪 Bio-Rad	Bio-Rad	T100
胰蛋白酶	Sigma	T4799