负载多西环素的胶原-壳聚糖复合支架促进糖尿病伤口的快速愈合

摘要

所制备的DOX-CL支架在机械强度、孔隙率、吸水性、降解速率、缓释性能、抗菌性、生物相容性和抗炎性能等方面均满足理想糖尿病创面敷料的基本要求，这些特性被认为是糖尿病创面受损组织修复所必需的。

摘要

糖尿病的主要并发症之一是糖尿病伤口（DW）。糖尿病中延长的炎症阶段会阻碍损伤的后续修复过程，导致伤口愈合延迟。我们选择多西环素（DOX）作为潜在的首选药物，因其具有抗菌特性以及已报道的抗炎作用。本研究旨在制备载有多西环素的胶原-壳聚糖非交联（NCL）和交联（CL）支架，并评估其在糖尿病条件下的愈合能力。支架的表征结果显示，与DOX-NCL支架相比，DOX-CL支架具有理想的孔隙率、较低的溶胀与降解速率，以及更持久的DOX释放效果。体外研究表明，与经CL支架处理组和对照组相比，DOX-CL支架具有良好的生物相容性，并能促进细胞生长。抗菌实验表明，DOX-CL支架对DW中最常见的细菌的抑制效果优于CL支架。在链脲佐菌素联合高脂饮食诱导的DW模型中，DOX-CL支架处理组的伤口收缩速率显著更快（p≤0.05），优于CL支架处理组和对照组。使用DOX-CL支架可能成为糖尿病伤口局部治疗的一种有前景的策略。

引言

糖尿病（DM）是一种由于机体无法正常分泌胰岛素或对胰岛素作用产生异常反应，导致简单糖类代谢紊乱，进而引起血糖升高的疾病¹。DM最常见且严重的并发症之一是糖尿病伤口（DW）。大约25%的DM患者在其一生中可能发生DW¹。DW愈合受阻归因于DM的三重病理机制：免疫病变、血管病变和神经病变。若DW未得到及时治疗，可能发展为坏疽，进而导致受累器官被切除²。

目前临床实践中采用多种治疗方法，例如指导患者（每日检查伤口、清洁伤口、避免对伤口造成压力的活动、定期监测血糖等）、控制血糖水平、清创、减压、医疗操作、高压氧治疗以及先进疗法等 ^3,4。由于糖尿病足（DW）具有多因素的病理生理条件，且相关药物常伴随不可预知的费用，大多数药物无法满足糖尿病足护理所需的所有关键条件 ⁵。尽管糖尿病足的发病机制是多因素的，但持续性炎症反应及不适当的组织调控被认为是导致糖尿病足伤口愈合延迟的根本原因^5,6。

糖尿....

方案

所有动物实验操作均经印度奥蒂耶 JSS 药学院机构动物伦理委员会批准。

1. 通过冷冻干燥法制备载多柔比星的多孔支架

1. 将 1.2 g COL 加入 100 mL 水（例如 Millipore 水）中，静置使其溶胀。
2. 将溶胀后的 COL 分散液在 2000 rpm 条件下搅拌过夜，以确保 COL 完全溶解。
3. 通过将约 0.8 g CS 溶解于 100 mL 1% 乙酸溶液中，制备 CS 溶液。
4. 将 CS 溶液在 2000 rpm 条件下搅拌过夜，以确保均匀分散。
5. 将 DOX（1% w/v）加入 COL 溶液中，随后加入 CS 溶液，搅拌 30 分钟。
6. 使用棉布过滤所得物理混合物，以去除颗粒物质。
7. 将所得滤液在 -85 °C ± 4 °C 条件下深度冷冻约 24 小时。
8. 在 -85 °C ± 4 °C 条件下对深度冷冻的混合物进行 72 小时的冷冻干燥。
9. 将所得支架材料储存于干燥器中，以备进一步分析^16,17。

2. 支架的交联

1. 将 MES（0.488 g）溶解于 50 mL 水中。

结果

DOX 负载的 NCL 和 CL 支架的表征
肉眼观察，NCL 和 CL 支架呈乳白色。此外，通过物理检查发现，两种支架均呈海绵状，质地坚硬且无弹性。图1展示了 NCL 和 CL 支架的扫描电镜（SEM）图像。从图中可以明显看出，由于形成了分子间交联结构，交联后孔径有所减小。NCL 和 CL 支架的孔隙率分别为 92.3±4.21 和 71.35±2.65。在 24 小时间隔时，NCL 和 CL 支架的吸水率分别为 750±11.4% 和 492±8.66%。

此外，在含有溶菌酶、pH 为 7.4 的模拟伤口液体中进行了为期七天的生物降解研究。NCL 支架在最初三天内表现出较快的降解速率，随后连续四天缓慢降低。相比之下，CL 支架则表现出更持久的降解速率。支架的交联增强了其机械性能和网络强度，从而导致降解速率降低，表明其对降解具有更高的抗性（图 2）。

此外，

讨论

本研究的主要目的是确定载有阿霉素的胶原-壳聚糖支架对大鼠皮肤创面愈合的影响。制备了CL和NCL，并对其形态学、溶胀指数、体外释放动力学及生物相容性进行了评价。

DOX 负载的 NCL 和 CL 支架的表征
制备的支架具有多孔结构，并带有相互连通的孔隙。这些相互连通的孔隙确保了支架的多孔海绵状特性，有助于氧气和营养物质向细胞的有效扩散，促进细胞增殖与迁移，从而加速愈合过程。此处，孔径大小主要取决于交联程度。通过 EDC/NHS 与壳聚糖（CS）和胶原蛋白（COL）形成强烈的分子内相互作用，对支架进行交联，导致孔径减小，同时提高了支架的机械强度。

孔隙率指数依赖于相对密度，而相对密度是海绵状支柱质量与体积的函数。通常情况下，如果交联剂通过将支柱相互拉近而改变其位置，会导致支架体积收缩，从而引起支架致密化。然而，在碳二亚胺化学反应的情况下，由于其独特的作用机制，即利用相邻肽链上的羧基（>COOH）和氨基（-NH）形成酰胺键（O=C-NH），而不进入支架结构本身，因此不会预期支架质.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-乙基-(3-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）	默克密理博，印度孟买	E7750
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）	默克密理博，印度孟买	137074
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）	赛默飞世尔科技，印度孟买	M6494
深冷立式冰箱	Labline Instruments，科钦，印度
透析袋	默克密理博，印度孟买	D6191-平均扁平宽度25 mm（1.0 in.），截留分子量12,000 Da
多西环素	Sigma化学有限公司，印度孟买	D9891
ELISA试剂盒	R&D Systems	RMP900
大肠杆菌 (E. coli)	印度浦那工业微生物国家保藏中心	NCIM 2567
乙醇	默克密理博，印度孟买	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero 实验室仪器公司，印度金奈
机械搅拌器-RQ-122/D	Remi 实验室仪器公司，印度孟买
中等分子量壳聚糖	Sisco研究实验室私人有限公司，孟买，印度	18824
Microtome-RM2135	徕卡，英国
小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）	印度浦那国家细胞科学中心
多功能酶标仪 - Infinite M200 Pro	Tecan Instruments，瑞士
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	Sigma 化学有限公司，印度孟买	130672
铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa)	印度浦那工业微生物国家保藏中心	NCIM 2036
扫描电子显微镜（SEM）-S-4800	日立，印度
氢氧化钠（NaOH）颗粒	印度孟买Qualigen精细化学品公司	Q27815
金黄色葡萄球菌 (S. aureus)	印度浦那国家工业微生物保藏中心	NCIM 5022
表皮葡萄球菌 (S. epidermidis)	印度浦那国家工业微生物保藏中心	NCIM 5270
链脲佐菌素（STZ）	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.，印度孟买	14653
I型大鼠胶原蛋白	Sigma化学有限公司，印度孟买	C7661
紫外线–可见光谱学-1700	岛津