所制备的DOX-CL支架在机械强度、孔隙率、吸水性、降解速率、缓释性能、抗菌性、生物相容性和抗炎性能等方面均满足理想糖尿病创面敷料的基本要求，这些特性被认为是糖尿病创面受损组织修复所必需的。
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摘要
摘要
糖尿病的主要并发症之一是糖尿病伤口（DW）。糖尿病中延长的炎症阶段会阻碍损伤的后续修复过程，导致伤口愈合延迟。我们选择多西环素（DOX）作为潜在的首选药物，因其具有抗菌特性以及已报道的抗炎作用。本研究旨在制备载有多西环素的胶原-壳聚糖非交联（NCL）和交联（CL）支架，并评估其在糖尿病条件下的愈合能力。支架的表征结果显示，与DOX-NCL支架相比，DOX-CL支架具有理想的孔隙率、较低的溶胀与降解速率，以及更持久的DOX释放效果。体外研究表明，与经CL支架处理组和对照组相比，DOX-CL支架具有良好的生物相容性，并能促进细胞生长。抗菌实验表明，DOX-CL支架对DW中最常见的细菌的抑制效果优于CL支架。在链脲佐菌素联合高脂饮食诱导的DW模型中，DOX-CL支架处理组的伤口收缩速率显著更快（p≤0.05），优于CL支架处理组和对照组。使用DOX-CL支架可能成为糖尿病伤口局部治疗的一种有前景的策略。
引言
糖尿病（DM）是一种由于机体无法正常分泌胰岛素或对胰岛素作用产生异常反应，导致简单糖类代谢紊乱，进而引起血糖升高的疾病1。DM最常见且严重的并发症之一是糖尿病伤口（DW）。大约25%的DM患者在其一生中可能发生DW1。DW愈合受阻归因于DM的三重病理机制：免疫病变、血管病变和神经病变。若DW未得到及时治疗，可能发展为坏疽，进而导致受累器官被切除2。
目前临床实践中采用多种治疗方法，例如指导患者（每日检查伤口、清洁伤口、避免对伤口造成压力的活动、定期监测血糖等）、控制血糖水平、清创、减压、医疗操作、高压氧治疗以及先进疗法等 3,4。由于糖尿病足（DW）具有多因素的病理生理条件，且相关药物常伴随不可预知的费用，大多数药物无法满足糖尿病足护理所需的所有关键条件 5。尽管糖尿病足的发病机制是多因素的，但持续性炎症反应及不适当的组织调控被认为是导致糖尿病足伤口愈合延迟的根本原因5,6。
糖尿病伤口（DW）中炎性及促炎介质水平升高，导致负责伤口愈合延迟的生长因子减少2,6。DW中不正常的细胞外基质（ECM）形成归因于基质金属蛋白酶（MMPs）水平升高，后者可导致已形成的ECM迅速降解。在MMPs中，MMP-9被报道为导致持续性炎症和ECM快速降解的主要中介因子7。研究表明，使用可降低MMP-9升高水平的抗炎药物进行局部治疗，能够重建皮肤稳态、恢复基质结构排列，并促进DW的更好愈合8,9。
多西环素（DOX）是一种基质金属蛋白酶-9（MMP-9）抑制剂，被选择用于抑制在糖尿病创面（DWs）中升高的MMP-9水平；MMP-9是导致持续性炎症的主要炎症介质10,11,12。此外，DOX具有抗氧化（可产生能够与活性氧结合的游离羟基和苯氧自由基）13和抗凋亡（抑制caspase表达及线粒体稳定化）14活性，这些特性对糖尿病创面（DW）的治疗至关重要。因此，选择了包含DOX、胶原蛋白（COL）和壳聚糖（CS）的复合支架结构。选择COL的原因在于其能够提供必要的结构框架，赋予机械强度并促进组织再生15。另一方面，CS在结构上与糖胺聚糖具有同源性，参与多个创面愈合阶段。已有报道表明，CS具有显著的抗菌性能15。因此，负载DOX的COL/CS支架旨在抑制长期炎症反应，并在糖尿病（DM）条件下促进基质形成，从而实现有效的创面愈合。
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方案
所有动物实验操作均经印度奥蒂耶 JSS 药学院机构动物伦理委员会批准。
1. 通过冷冻干燥法制备载多柔比星的多孔支架
- 将 1.2 g COL 加入 100 mL 水（例如 Millipore 水）中，静置使其溶胀。
- 将溶胀后的 COL 分散液在 2000 rpm 条件下搅拌过夜，以确保 COL 完全溶解。
- 通过将约 0.8 g CS 溶解于 100 mL 1% 乙酸溶液中，制备 CS 溶液。
- 将 CS 溶液在 2000 rpm 条件下搅拌过夜，以确保均匀分散。
- 将 DOX（1% w/v）加入 COL 溶液中，随后加入 CS 溶液，搅拌 30 分钟。
- 使用棉布过滤所得物理混合物，以去除颗粒物质。
- 将所得滤液在 -85 °C ± 4 °C 条件下深度冷冻约 24 小时。
- 在 -85 °C ± 4 °C 条件下对深度冷冻的混合物进行 72 小时的冷冻干燥。
- 将所得支架材料储存于干燥器中，以备进一步分析16,17。
2. 支架的交联
- 将 MES（0.488 g）溶解于 50 mL 水中。
- 将载有 DOX 的支架材料 50 mg 浸泡于 20 mL MES 缓冲液中 30 分钟。
- 在另一个烧杯中，将 19.5 mL MES 缓冲液与 0.1264 g EDC 和 0.014 g NHS 混合。
- 将支架浸入缓冲液混合物中反应 4 小时，以实现交联16。
- 保存载有 DOX 的交联（CL）和非交联（NCL）支架，用于后续评估。
3. 支架的表征
- 使用扫描电子显微镜（SEM）进行形态学观察
- 采用扫描电子显微镜（SEM）对支架进行形态学分析（尺寸为 1 cm × 1 cm × 0.5 cm）。
- 在支架的横截面和外表面镀上一层精细的金膜（约 150 Å）。
- 在激发电压为 5 kV 和 10 kV 的条件下拍摄图像。
- 将样品置于铝制样品台中，并在约 9 V 条件下进行镀金处理。
- 使用 SEM 在 10 kV 的高分辨率条件下对支架进行观测。
- 孔隙率测定
- 采用液体置换法（乙醇）测定支架的孔隙率18。
- 使用以下公式计算支架的孔隙率。
Ww = 支架的湿重
Wd = 支架的干重
Wv = 支架的体积
- 测定吸水能力
- 测量支架的干重。
- 将已称重的支架在 37 °C 的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中孵育 24 小时。
- 用滤纸吸去支架表面多余的 PBS。
- 使用以下公式计算吸水能力17。
WS = 吸水百分比
W1 = 支架的湿重
W0 = 支架的干重
- 支架降解实验
- 将支架（1 cm × 1 cm）置于含溶菌酶的 PBS（pH 7.4）中，在 37 °C 下孵育 7 天。
- 清洗支架以去除表面附着的离子。
- 将清洗后的支架进行冷冻干燥处理17。
- 使用以下公式计算降解率。
Ww = 支架的初始重量
Wd = 冷冻干燥后支架的重量
- 体外释放研究
- 采用透析袋法测定 DOX 从支架中的释放行为。
- 将支架分散于数毫升模拟伤口液（pH 7.4）中，并转移至透析袋内。
- 紧密封闭透析膜袋两端，并将其浸入 500 mL 模拟伤口液溶液中。
- 以 200–250 rpm 的速度搅拌含有透析袋的伤口液溶液。
- 在固定时间间隔收集上清液，并补充等量的新鲜缓冲液。
- 使用紫外-可见分光光度计在 240 nm 波长下测定上清液中 DOX 的释放百分比。
4. 体外 抗菌研究
- 采用微量肉汤稀释法测定 CL 和 DOX-CL 支架对金黄色葡萄球菌（S. aureus）、表皮葡萄球菌（S. epidermis）、大肠杆菌（E. coli）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的最低抑菌浓度（MIC）。
- 使用 Mueller-Hinton 肉汤以 1:1000 的比例制备细菌培养物，使其达到 0.5 麦氏浊度。
- 向细菌培养物中添加 D-葡萄糖（800 mg/dL），以诱导高糖化反应19,20。
- 将 CL 和 DOX-CL 在 DMSO 中切碎并溶解（阴性对照）。
- 在 96 孔板中对高糖化处理的细菌悬液（100 µL）和待测样品（100 µL 支架溶液）进行连续稀释。
- 将 96 孔板在 37 °C 下孵育 20–24 小时。
- 记录波长为 600 nm 处的吸光度值21。
5. 体外 生物相容性研究
- 采用 MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐] 法评估所制备支架的生物相容性。
- 将标准尺寸的支架进行灭菌处理，并置于24孔板中。
- 向24孔板中接种3T3-L1细胞，并培养72小时。
6. 体内 动物实验
- 糖尿病诱导与切除伤口模型建立
- 将Wistar白化大鼠（180-200 g）连续喂养高脂饮食两周，随后在柠檬酸盐缓冲液中腹腔注射链脲佐菌素（STZ）单次剂量（50 mg/kg体重），以诱导2型糖尿病。
- 选择血糖水平持续维持在250 mg/dL的大鼠用于实验研究。
- 将选定的大鼠随机分组，用于建立切除伤口模型。
- 使用乙醚（5 mL加入预先饱和的麻醉舱）对糖尿病大鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏法及黏膜颜色变化确认麻醉效果。
- 使用无菌修剪器和刀片（A40）剃除背部区域（胸背部、腰部）的毛发。
- 用酒精棉片对剃毛区域进行消毒。
- 在剃毛区域使用无菌外科A40刀片切除皮肤（面积2 × 2 cm2，深度1 mm），形成开放性伤口。
- 将动物分为三组（第1组：疾病对照组（对照组），第2组：CL支架组（安慰剂组），第3组：DOX CL支架组），每组6只大鼠。
- 使用手术胶带固定CL和DOX CL支架，对照组则覆盖无菌纱布，持续21天。
- 在无菌OHP片上描记伤口面积，并在第0、7、14和21天采用网格法测量各组伤口面积的缩小百分比。
- 使用以下公式计算伤口缩小百分比。
7. 组织病理学研究
- 在第7、14和21天分离愈合的伤口区域，置于10%福尔马林溶液中保存。
- 使用切片机对组织进行切片，获得厚度为6 µm的切片。
- 将切片贴附于载玻片上，并使用苏木精和伊红染色17。
- 使用数字显微镜在40倍放大倍数下采集图像。
8. 羟脯氨酸测定
- 在第0、7、14和21天分离愈合的伤口区域进行评估。
- 采用Reddy G等（1996）所述方法测定羟脯氨酸含量22。
9. ELISA 检测
- 根据制造商说明书，使用 ELISA 试剂盒测定 MMP-9 水平。
- 在第 21 天采集愈合伤口区域的组织样本，并使用组织匀浆器进行剪碎处理。
- 将获得的匀浆液离心，并收集上清液。
- 用检测缓冲液将上清液稀释 100 倍。
- 使用多功能酶标仪扫描酶标板。
10. 统计分析
- 以均值 ± 标准差表示获得的结果。
- 使用 Graph pad prism v5.01 进行统计分析。
- 采用单因素方差分析（One Way Analysis of Variance, ANOVA）及 Dunnet's 事后检验来确定统计学显著性。
- 将 p ≤ 0.05 的值视为具有统计学意义。
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结果
DOX 负载的 NCL 和 CL 支架的表征
肉眼观察，NCL 和 CL 支架呈乳白色。此外，通过物理检查发现，两种支架均呈海绵状，质地坚硬且无弹性。图1展示了 NCL 和 CL 支架的扫描电镜（SEM）图像。从图中可以明显看出，由于形成了分子间交联结构，交联后孔径有所减小。NCL 和 CL 支架的孔隙率分别为 92.3±4.21 和 71.35±2.65。在 24 小时间隔时，NCL 和 CL 支架的吸水率分别为 750±11.4% 和 492±8.66%。
此外，在含有溶菌酶、pH 为 7.4 的模拟伤口液体中进行了为期七天的生物降解研究。NCL 支架在最初三天内表现出较快的降解速率，随后连续四天缓慢降低。相比之下，CL 支架则表现出更持久的降解速率。支架的交联增强了其机械性能和网络强度，从而导致降解速率降低，表明其对降解具有更高的抗性（图 2）。
此外，
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讨论
本研究的主要目的是确定载有阿霉素的胶原-壳聚糖支架对大鼠皮肤创面愈合的影响。制备了CL和NCL，并对其形态学、溶胀指数、体外释放动力学及生物相容性进行了评价。
DOX 负载的 NCL 和 CL 支架的表征
制备的支架具有多孔结构，并带有相互连通的孔隙。这些相互连通的孔隙确保了支架的多孔海绵状特性，有助于氧气和营养物质向细胞的有效扩散，促进细胞增殖与迁移，从而加速愈合过程。此处，孔径大小主要取决于交联程度。通过 EDC/NHS 与壳聚糖（CS）和胶原蛋白（COL）形成强烈的分子内相互作用，对支架进行交联，导致孔径减小，同时提高了支架的机械强度。
孔隙率指数依赖于相对密度，而相对密度是海绵状支柱质量与体积的函数。通常情况下，如果交联剂通过将支柱相互拉近而改变其位置，会导致支架体积收缩，从而引起支架致密化。然而，在碳二亚胺化学反应的情况下，由于其独特的作用机制，即利用相邻肽链上的羧基（>COOH）和氨基（-NH）形成酰胺键（O=C-NH），而不进入支架结构本身，因此不会预期支架质...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢阿希什·D·瓦德瓦尼博士（印度奥蒂的JSS药学院药学生物技术系助理教授兼主任）在以下方面的协助： 体外 细胞活力研究
作者感谢印度新德里科学技术部——大学及高等教育机构科学技术基础设施改善基金（DST-FIST）对本部门的支持。
作者还要感谢 Mr. Sanju. S 和 Mr. Sriram. Narukulla M. Pharm 学生在视频拍摄过程中提供的支持。
本研究由JSS高等教育部提供资助 & 科学研究（JSSAHER）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-乙基-(3-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC） | 默克密理博，印度孟买 | E7750 | |
| 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES） | 默克密理博，印度孟买 | 137074 | |
| 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT） | 赛默飞世尔科技，印度孟买 | M6494 | |
| 深冷立式冰箱 | Labline Instruments，科钦，印度 | ||
| 透析袋 | 默克密理博，印度孟买 | D6191-平均扁平宽度25 mm（1.0 in.），截留分子量12,000 Da | |
| 多西环素 | Sigma化学有限公司，印度孟买 | D9891 | |
| ELISA试剂盒 | R&D Systems | RMP900 | |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 印度浦那工业微生物国家保藏中心 | NCIM 2567 | |
| 乙醇 | 默克密理博，印度孟买 | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero 实验室仪器公司，印度金奈 | ||
| 机械搅拌器-RQ-122/D | Remi 实验室仪器公司，印度孟买 | ||
| 中等分子量壳聚糖 | Sisco研究实验室私人有限公司，孟买，印度 | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | 徕卡，英国 | ||
| 小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1） | 印度浦那国家细胞科学中心 | ||
| 多功能酶标仪 - Infinite M200 Pro | Tecan Instruments，瑞士 | ||
| N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） | Sigma 化学有限公司，印度孟买 | 130672 | |
| 铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa) | 印度浦那工业微生物国家保藏中心 | NCIM 2036 | |
| 扫描电子显微镜（SEM）-S-4800 | 日立，印度 | ||
| 氢氧化钠（NaOH）颗粒 | 印度孟买Qualigen精细化学品公司 | Q27815 | |
| 金黄色葡萄球菌 (S. aureus) | 印度浦那国家工业微生物保藏中心 | NCIM 5022 | |
| 表皮葡萄球菌 (S. epidermidis) | 印度浦那国家工业微生物保藏中心 | NCIM 5270 | |
| 链脲佐菌素（STZ） | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.，印度孟买 | 14653 | |
| I型大鼠胶原蛋白 | Sigma化学有限公司，印度孟买 | C7661 | |
| 紫外线–可见光谱学-1700 | 岛津 |
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