通过低温软X射线断层扫描对细胞进行三维制图描述

摘要

本文介绍了一种用于冷冻软X射线断层成像（SXT）的实验方案，该方案描述了对完整冷冻保存的细胞进行超微结构成像所需的样品制备和数据采集步骤，成像分辨率达到25 nm半节距。

摘要

成像技术对于理解生物研究及相关领域中的细胞结构与机制至关重要。在这些技术中，低温软X射线断层成像（cryo soft X-ray tomography, Cryo-SXT）能够在水窗X射线能量范围（284–543 eV）内对完整冷冻保存的细胞进行成像。在此能量范围内，碳基结构对X射线的吸收率天然高于水，从而可实现对每个体素内物质线性吸收系数的三维重建。通过该方法，可获得厚度达10 µm的完整细胞水平的定量结构信息，空间分辨率可达25–30 nm半节距，且具有较高的通量。Cryo-SXT已证明其在当前生物医学研究中的重要价值，可提供有关细胞感染过程（病毒、细菌或寄生虫）、疾病引起的形态学变化（如隐性遗传病）的三维信息，并有助于理解药物在细胞水平的作用机制，或在三维细胞环境中定位特定结构。此外，借助同步辐射装置可调谐的波长特性，还可利用光谱显微术或其三维形式——光谱断层成像，对细胞内特定元素（如生物矿化过程中的钙）进行成像与定量分析。Cryo-SXT可为其他生物成像技术（如电子显微镜、X射线荧光或可见光荧光成像）提供互补信息，通常作为冷冻条件下二维或三维关联成像的联合方法，以关联功能、位置与形态。

引言

冷冻软X射线断层成像（Cryo-SXT）在生物成像研究中可发挥核心作用，因其能够提供水合完整细胞的三维中等分辨率（25–30 nm半节距）图像^1,2,3,4,5,6。在碳和氧的K吸收边之间的“水窗”能量范围内（4.4–2.3 nm），富含碳的细胞结构的吸收率比渗透和包围它们的富氧介质高出10倍。在此能量范围内，厚度达10 µm的玻璃态细胞无需切片或染色即可成像，从而获得具有高吸收对比度的定量投影图像；结合样品旋转能力，可实现细胞结构的断层重建。Cryo-SXT在样本尺寸和空间分辨率方面填补了其他成像技术难以企及的空白。

简而言之，冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）的吸收对比是定量的，因为光子穿过厚度为 t 的样品时的衰减遵循比尔-朗伯定律，如下所示：，其中 I₀ 表示入射光强，µ_l 表示线性吸收系数，其值取决于波长 λ 以及样品折射率的虚部 β（）。衰减程度取决于被成像结构的生化组成和厚度，每种生化组分都具有特定的X射线线性吸收系数 µ_l（LAC）。这意味着每个断层扫描体素的数值取决于该体素内化学元素的种类及其浓度⁷。因此，仅基于重建所得的固有LAC值，即可自然区分不同的细胞器（如细胞核、核仁、脂滴或线粒体）或染色质的不同压缩状态^2,8,9。

此外，冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）是一种高通量技术，可在几分钟内完成断层图像的采集。该技术特别适用于在关键时间点（如细胞分裂、分化和凋亡）对细胞群体进行介观尺度成像，同时也可用于研究细胞在不同响应状态下的结构变化，例如由特定药物治疗的化学暴露或病原体感染所诱导的状态。在这些关键时间点采集的数据将提供系统的三维描述，真实记录特定时刻下各种细胞器的空间组织结构。

通常，冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）会与其他技术结合使用，采用相关联的方法，以在三维细胞环境中定位特定结构、事件或大分子^{4,10,11,12,13,14,15,16}，或与硬X射线荧光数据关联^17,18。在低温条件下进行关联分析对于获得目标体系最完整且最有价值的信息至关重要。Mistral（Alba）和B24（Diamond）冷冻软X射线断层成像光束线的典型工作流程简要总结于图1中。

此外，利用同步辐射装置的波长调谐能力，除了获得样品中特定元素的结构信息外，还可以通过这些元素特有的差分吸收获取光谱信息。例如，在研究细胞生物矿化过程时，可以定位钙元素的分布^19,20,21。通过在不同光子能量（光谱）下采集二维图像或在目标X射线吸收边以下及处采集断层图像，可识别出含有选定元素的像素或体素。光谱数据还可用于区分不同的化学状态（例如，在上述生物矿化示例中，非晶态钙向羟基磷灰石的转化过程²⁰）。可在二维和三维条件下对不同元素进行定量分析。玻璃态细胞的光谱成像通常在水窗范围内进行，但如果样品含水量足够低，或采用包括脱水在内的其他样品制备方法，也可在其他能量范围内实现²²。详细的光谱学分步操作流程已超出本实验方案的重点范围。

以下方案简要概述了主要的样品制备步骤，尽管每个系统可能需要单独优化，随后详细描述了低温软X射线断层成像的数据采集流程。

方案

1. 样品制备

1. 制备网格支撑
   1. 将载网碳膜面向上放置，用紫外线照射3小时以进行灭菌。
   2. 可选：如果细胞无法贴附到网格上，可采用以下步骤之一。
      1. 通过等离子体处理载网，使碳支持膜亲水化，以增强样品铺展性和细胞黏附性。
         1. 将载网碳膜面朝上放入辉光放电仪腔体中，用氩气或/和氧气等离子体处理30秒至15分钟₂）取决于所用设备。
      2. 用多聚-L-赖氨酸（PLL）对载网进行功能化处理
         1. 在培养皿中加入60 µL PLL单滴，将载网置于PLL液滴上，碳膜面朝下。37 °C孵育30分钟，用滤纸吸去PLL溶液。
      3. 用胎牛血清（FBS）对载网进行功能化处理。
         1. 将载网浸入FBS中过夜。将载网浸入缓冲液中洗涤，并置于滤纸上以去除多余液体。
2. 在载网上培养贴壁细胞
   1. 在100 mm细胞培养皿中培养细胞，使其达到80%–90%汇合度（图2A).
   2. 种子 1-5 ×10⁵ 细胞/mL（根据系统调整数值），加入至P60培养皿中的Au载网上（总体积3 mL）。
      注意： 将细胞悬液加入细胞培养皿时，必须格外小心，确保载网的碳膜朝上，培养皿直径为60 mm。每种实验条件需准备多个载网，每种条件使用一个P60培养皿。图2B).
   3. 让细胞沉降，直至网格中每个网孔内的汇合度达到数个细胞（根据细胞大小，约为1至10个）；具体时间取决于细胞系，最长可能需要24小时。
      注意： 在冷冻之前，应使用光学显微镜（VLM）检查载网，评估每张载网的碳膜完整性和细胞融合度。图2C）。等待网格上的细胞密度达到合适状态。如果网格上的细胞过于密集或碳膜破损，则需重新开始。
3. 悬浮细胞在载网上沉积
   1. 使用镊子从冷冻载网盒中取出一个预先准备好的金（Au）或铜（Cu）载网（参见第1.6节）。
   2. 制备 1-5 x 10⁵ 细胞悬液（细菌的光密度吸光度为0.3）并取4 µL制备好的悬液加入网格中。
   3. 将载网水平放置于液滴中孵育数分钟，以使细胞沉降，随后将夹持载网的镊子放入已调节至适当温湿度条件的温控玻璃化冷冻室中（步骤1.6.1）。
4. 可选：样本的荧光标记
   注意： 对样品中的某些细胞器进行荧光标记可能具有优势。根据研究目的，可使用特异性荧光染料，或稳定表达荧光蛋白的细胞，或转染后瞬时表达目标蛋白的细胞。这有助于通过冷冻落射荧光显微镜轻松识别细胞，并辅助定位后续X射线成像所需的目标细胞。以下方案仅详细说明荧光染料的使用。
   1. 配制荧光染料的工作液（参见生产商推荐），并遵循特定实验方案。
   2. 将荧光染料加入含有网格的培养皿中，轻轻混匀。
   3. 在避光环境中孵育，孵育结束后直接进入步骤1.6。
      注意：孵育结束后需立即准备进行玻璃化处理，以避免非特异性标记，从而导致荧光信号模糊。
5. 用于断层图投影配准的金纳米颗粒（NPs）制备
   1. 取1 mL金标记物储备液（Mistral为100 nm，B24为250 nm）一份，低速离心1分钟（避免聚集），使纳米颗粒沉淀。
      注意： 如果可能，最好让标记物自然沉降过夜或更长时间，以避免聚集。
   2. 移除上清液。在冷冻前立即用20 µL无血清培养基或缓冲液重新悬浮纳米颗粒，以获得均一溶液。
      注意： 建议使用超声处理和涡旋振荡以帮助均质化溶液。
6. 载网冷冻
   ​警告：液氮可导致冻伤，操作时应穿戴适当的防护装备（长款实验服、护目镜、手套、长裤和封闭式鞋子）。乙烷 极易爆炸，应远离任何火花或明火。
   1. 按照制造商的说明准备和使用冷冻仪。
      注意： 湿度通常设定为80%–90%；温度则取决于细胞类型（酵母细胞最高30 °C，哺乳动物细胞37 °C，昆虫细胞28 °C等）。
   2. 用镊子从培养皿中夹取网格的边缘，小心不要弯曲网格，将其安装到冷冻固定装置上。确保细胞面朝向远离吸水纸的方向。
   3. 可选：对于贴壁细胞，用缓冲液将载网洗涤三次。
   4. 通过腔室右侧的孔洞，在细胞上方加入1.5 µL的Au NP定位标记，静置30秒后，吸去液体并将载网投入冷冻剂中。
      注意： 对于悬浮状态的细胞，在将镊子安装到位之前，当载网仍处于水平位置时，向载网上加入金纳米颗粒标记物 静置30秒。印迹步骤对获得高质量载网至关重要。开始前需校准印迹距离；印迹滤纸的平整度对印迹的可重复性具有重要影响（请遵循制造商的说明）。每种细胞类型的印迹时间均需单独评估。
   5. 每种条件准备多个载网。转移载网并置于低温条件下保存，以维持玻璃态冰的结构。
7. 使用冷冻可见光显微镜筛选载网
   1. 将载网在液氮中从冷冻盒转移至预冷的冷冻载台内的标准冷冻盒（可放置3个3 mm透射电镜载网）中（参见仪器制造商的说明书）。
   2. 将冷冻盒放置于冷冻台桥上，并将冷冻台安装在宽场落射荧光显微镜上。
   3. 在 -196.5 °C 下使用长工作距离物镜（10x、50x、100x）对载网进行成像，以定位适合进行冷冻软X射线断层成像的细胞，并评估载网质量（是否存在厚冰、碳支持膜的完整性、荧光信号的存在等）。
   4. 使用明场和/或荧光成像定位目标细胞。
      注意：在此阶段，若显微镜配备连接的相机，请采集图像以用于图像关联。
   5. 筛选后，将载网放回液氮储存杜瓦瓶中的冷冻盒内.
      ​注意： 如果未找到合适的样品，请重复样品制备步骤，并调整任意参数。通常需要调整的参数包括 blotting 时间（若冰层过厚）或细胞密度（若每个网格方格内细胞过多）。

2. 装载至透射X射线显微镜（TXM）

1. 用液氮冷却转移室，直至达到 <100 K，冷却工作站 (图3A）并打开工作站边缘的加热器，等待其停止沸腾。
2. 将装有载网的所需冻存盒放入工作站内的相应位置（图3A）。注意在低温条件下安全转移。
3. 将所选载网装入预先冷却的样品 holders 中图3B）；将 holders 装载到 shuttle 上，并用盖子保护好（图3C).
4. 将穿梭装置载入转移室 <100 K 并抽至低真空（图3D).
5. 将转移室连接到TXM图4A）并按照屏幕上的真空操作程序，将载样穿梭器从转移腔室装入透射X射线显微镜（TXM）中（图4B).
6. 一旦载有样品的穿梭器进入内部，TXM机器人臂便可依次将每个样品架送至样品台图 4C).

3. 使用TXM软件进行成像

注意：在使用 X 射线成像之前，首先通过在线可见光显微镜（VLM）以明场和/或荧光模式对样品台上的载网进行成像，以完成载网定位。使用左上方面板中对应于运动控制选项卡的操纵杆图标，打开运动控制界面。

1. 使用在线VLM对网格进行成像。
   1. 明场图像拼接采集
      1. 选择VLM相机（放大镜 > VLM）并打开VLM LED光源以进行明场成像（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 源设置 并选择 传播).
      2. 将样品旋转至 -60 度，使其对准 VLM 物镜（运动控制 > 样本 > 样本 θ）并将样品移至预期的中心位置（运动控制 > 样本 并改变 样本 X, 样本 Y).
      3. 在获取过程中 以20至50 µm的步长移动，首先将网格大致调至焦平面显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 采集模式 > 连续的 > 开始; 运动控制 > 样本 并改变 样本 Z).
      4. 以更小的步长逐步调整焦距，直至细胞和/或碳支持膜上的孔洞清晰对焦（步长可小至5 µm）显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 连续的 > 开始；运动控制 > 样本 并改变 样本Z）并以明场模式开始采集网格的完整拼接图。使用拼接图的默认参数。显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 嵌合体 > 开始).
         注意： 镶嵌图由单个图像拼接而成。应设置图像数量（列数、行数以及X和Y方向的步长）以可视化整个网格。步长取决于视场（FoV）的大小。此处使用默认值。如果网格在X-Y平面上相对于完整镶嵌图的视场未良好居中，请停止采集，校正样品的X和Y坐标，然后重新开始采集。
   2. 荧光模式马赛克图像采集
      1. 关闭用于明场成像的 VLM 光源（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 源设置 并取消选择 传播）并手动选择与所需激发波长（红色、绿色或蓝色）相对应的LED光源及相应的光学滤光片。
      2. 优化荧光图像的焦距（显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 采集模式 > 连续的 > 开始; 运动控制 > 样本 并改变 样本 Z），然后获取一幅保留明场拼接图中位置参数（X 和 Y）的拼接图显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 采集模式 > 嵌合体 > 开始).
      3. 关闭LED光源
      4. 可选：根据明场和荧光马赛克图，标注先前已确定的感兴趣区域（ROI）（步骤 1.7.4）或新的感兴趣区域（图像中的 X-Y 位置）。
2. X射线马赛克成像采集
   1. 选择CCD X射线探测器（放大镜 > 选择 Pixis），将样品旋转至0度位置（运动控制 > 样本 并改变 样品 θ）并将X射线光学元件（聚光器和波带片）移至对准位置（运动控制 > 冷凝器 > 改变 聚光镜 z; 运动控制 > 区域板 并改变 区域板 Z).
      注意： 将CCD芯片冷却至-65 °C后再进行成像（显微镜 > 相机温度 > Pixis 并改变 设定温度 至 -65 °C 并点击 应用).
   2. 将样品移至所选 ROI 的网格方格中心运动控制 > 样本 并改变 样本 X, 样本 Y).
   3. 使用2倍 binning 和5 µm出射狭缝以在Mistral上最小化辐照，并采用1 s曝光；在B24上使用1倍 binning 和60 µm，通过样品Z向平移调节焦距（显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 相机设置 并改变 分箱; 运动控制 > XS 并改变 XS; 显微镜 > 采集 > 采集参数设置> 采集模式 > 连续的 > 开始；运动控制 > 样本 并改变 样本 Z以5 µm为步长开始调整，逐步精细至0.5 µm步长，直至细胞或碳膜孔清晰聚焦。
   4. 获取网格方块的镶嵌图显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 采集模式 > 嵌合体 > 开始).
      注意： 镶嵌成像参数的确定方法与VLM镶嵌图像（第3.1.1.4节）相同。步长取决于光束线工作人员预设的放大倍数。
   5. 将样品移至平场（FF）位置（网格内的空白区域，优选碳支持膜上的孔洞）运动控制 > 样本 并改变 样本 X, 样本 Y).
   6. 在Mistral上将曝光时间设为1 s，在B24上设为0.5 s（显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 相机设置 并改变 曝光时间）并获取单张图像（显微镜 > 采集 > 采集模式 > 单个 > 开始).
   7. 将获取的拼接图像除以平场（FF）图像以获得透射率（数值范围为0到1），并保存归一化后的拼接图像（点击图像右侧右上角第一个图标以打开菜单）>选择参考文献选项卡> 点击“单次参考”，并浏览特定的 FF）。
3. 准备采集X射线倾斜系列图像
   注意： 为每个被成像的感兴趣区域确定旋转轴。
   1. 在镶嵌图中选择若干区域以进行断层扫描，即通过放置方形（点击） 工具 图像窗口左侧）与X射线马赛克图中视场（FoV）的大小进行比较。
      注意： 选择区域时，需考虑与边界（≥10 µm）及其他细胞的距离，以避免旋转过程中细胞重叠。此外，还需检查细胞状态（预期的细胞形态、冰层厚度、玻璃化效果、标志点分布等）。
   2. 样品在旋转轴上的对齐
      注意： 所报道的步骤是迭代性的。使用±60°作为最大旋转角度（θ）时，迭代收敛更快_M）。如果无法达到，应使用尽可能接近 ±60° 的角度。
      1. 将相机设置为2×2 binning，曝光时间1 s（显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 相机设置 并改变 曝光时间；改变 分箱; 显微镜 > 采集 > 采集模式 > 连续的 > 开始），将出射狭缝设为 5 µm。
         注意： 通过使用最小的出射狭缝孔径来尽可能降低剂量。
      2. 当旋转角度为0°时，使用样品X轴和Y轴平移移动至先前选定的区域，并通过样品Z轴平移对准细胞的特定结构，使其位于旋转轴上运动控制 > 样本 并改变 样品 x; 样品 y; 样品 z).
      3. 将样品旋转至 + θ 角度_M (运动控制 > 样本 并改变 样本 θ）并画一条线（L+）（点击 右侧的线条工具按钮 在图像窗口的一侧，选择细胞的某个特征以置于旋转轴上。
      4. 旋转至 -θ_M (运动控制 > 样本 并改变 样品 θ）并绘制一条线（L-）（单击右侧的线条工具按钮） 在图像窗口的一侧，点击你希望置于旋转轴上的细胞特征。
      5. 尽管处于+θ状态_M 或 -θ_M，使用样本Z平移将选定特征移动到两条线之间的中心位置（运动控制 > 样本 并改变 样本 Z).
      6. 重复步骤 3.3.2.3 的操作，直至达到 L+ 与 L- 之间的最小距离。
         注意： L+ 与 L- 两条线之间的距离应较上一次迭代更小。
      7. 在样品 θ = 0 时运动控制 > 样本 并改变 样本 θ），将样本X移动至所选特征位于两条线中心所需距离的两倍处 (运动控制 > 样本 并改变 样本 X）。移动ZP的X轴，使特征重新回到视场中心（运动控制 > ZP 并改变 ZP X每张网格仅执行此步骤一次。
      8. 通过记录ZP Z焦距系列（在不同ZP Z位置下采集的图像集合，通常以0.3 µm为步长）重新优化相对于新旋转轴的ZP Z位置显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 采集模式 > 焦点系列 > 开始）并将ZP Z移动至样品处于焦平面的位置（运动控制 > 衍射光栅 并改变 区域板 z).
      9. 设置倾转系列采集的参数。
         注意： 最大角范围最终受限于ZP的焦距（对于平面样品，40 nm和25 nm ZP分别为±70度或±65度）。优化信噪比（S/N）与辐射损伤以确定曝光时间。进行断层扫描时，在不同角度范围使用不同的曝光时间。
      10. 确定最高旋转角度范围，以防在达到最大旋转角度之前出现遮挡。
      11. 将相机二值化设置为1（显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 相机设置 并改变 分箱），在Mistral处将出口狭缝打开至15 µm运动控制 > XS 并更改 XS）并将旋转角度设置为 0°（运动控制 > 样本 并改变 样品 θ).
      12. 使用1秒曝光时间获取单张图像（显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 采集模式 > 单次 > 开始）并估算断层扫描中每个倾斜角度所需的曝光时间。
4. 断层扫描采集
   1. 移动至负向最大角度加0.1（例如，对于ZP 25 nm，移动至-65.1°）运动控制 > 样本 并改变 样品 θ).
   2. 将图像数量设置为角度总数（包含0度角处的图像）以及角度范围（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 断层扫描 并更改图像数量；然后，更改 角度起点 和 角度末端).
   3. 设定预定义的曝光时间并开始采集（显微镜 > 采集 > 采集参数设置 > 相机设置 并改变 曝光时间 然后点击 开始).
   4. 移动到 FF 位置（运动控制 > 样本 并改变 样本 X；然后，更换 样本 Y）并获取10张FF图像（显微镜 > 采集 > 采集模式 > 平均值 并更改图像数量，然后单击 开始).
      注意： 在Mistral，通过在扫描目标吸收边能量范围的同时采集投影，可实现谱显微术或能量依赖性显微术。最终输出为一组二维投影图像序列，其中每个像素均包含一个X射线吸收谱（XAS），即具有化学信息的图像。将该技术扩展至三维，结合光谱学与断层扫描在原理上是可行的，但所需的总剂量可能构成限制，此时可能需要采用差分吸收成像等特定策略。

4. 数据分析

注意：所有数据分析均使用现有的开源软件和通过自动化流程开发的脚本完成。

1. 在Mistral
   1. 该流程将 tomography 数据堆栈从 txrm 格式（TXM 软件格式）转换为 hdf5 格式（开源的分层数据格式），并保留所有必要的元数据，随后依据白场（FF）平均值和机器电流对数据堆栈进行归一化处理，最后利用针对特定菲涅耳波带片（ZP）透镜和能量条件下测得的光学系统点扩散函数对堆栈进行反卷积。^23,24对于去卷积，需找到合适的 k = 1/SNR 值（该值取决于样本厚度）。对于在 Mistral 开发的脚本，请输入命令： txrm2deconv "输入断层扫描" "输入 FF" -zp="ZP 使用过" - e= " 能量 " - dx= " 像素大小 " - k= " 1/SNR " - t = -1
   2. 由 Mistral 开发的脚本 用于自动对齐，请输入命令： ctalignxcorr "归一化去卷积图像栈.mrc" "归一化堆栈.hdf5".
      注意：可使用多种软件应用程序，利用金纳米颗粒（Au NP）标记物将投影图像对齐至共同的旋转轴^25,26投影的对齐需要达到亚像素精度。当金纳米颗粒（Au NP）标记物数量足够时，自动对齐才能令人满意。>7）在视野中分布均匀且铺展良好。通常需要手动校准 事后 以校正自动对齐，实现尽可能高的准确性。
   3. 使用多种可用算法中的任意一种来重建配准后的归一化图像序列。
      注意：对齐后的堆栈可在几分钟内使用加权反投影法（WBP）或同步迭代重建技术（SIRT）进行重构。然而，为了保持线性吸收系数（LAC）的准确性，建议采用代数重建技术（ART）。²⁷ART 需要更多的计算时间，因此采用 SIRT²⁸ 首先进行快速自动对齐的倾斜系列重建（几分钟内完成30次迭代）。一旦对齐结果令人满意，将使用ART方法。
2. 在B24处
   1. 一套定制的流程将 txrm 数据文件转换为包含所有必要元数据的标准 Tiff 文件，然后将其发送至批量运行的 tomo 工作流程，该流程以三种方式处理数据集：WBP、SIRT 和 patch。

结果

制备冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）样品可能具有挑战性。即使在同一块样品载网上，也可能同时存在理想区域和非理想区域，如图5所示，该图展示了同一块金标记网格（Au finder grid）上的两个方格。理想的样品应为单个细胞位于方格网孔中央，包埋于一层薄冰之中，并被均匀分散的金 fiducial 标记物包围，这些标记物用于在断层重建前对倾斜投影图像进行对齐。图5A展示了一个符合多项上述标准的成纤维细胞样细胞（NIH 3T3）。图5B显示了使用ART²⁷方法对红色方框标记区域（即视野范围，FoV）进行三维重建后的单一切片图像。由于对线性吸收系数（LACs）进行了定量重建，多种细胞器（如线粒体（M）、内质网（ER）、囊泡（V）和细胞核（N））均可清晰分辨。此外，重建图像的信噪比非常高，使得细胞结构具有良好的对比度。相反，图5C所示方格中的细胞密度较高。由于这一原因， blotting（滤纸吸除）通常效率较低，导致冰层较厚，甚至出现玻璃化不良的问题。在某些情况下，这种问题在X射线成像前通过落射荧光定位扫描载网时即可被发现，此类载网应坚决避免使用。在图5C中，可以观察到一条贯穿整个网孔方格的裂纹（由红色箭头标示），该裂纹存在于载网及玻璃化冰层中。由于载网在受到X射线束照射时可能发生不稳定，因此应避免在裂纹附近进行成像。此外，裂纹也可能是冰层过厚的征兆，本区域即属此种情况。在红色方框标记区域采集了一组倾斜系列图像，图5D展示了相应三维重建结果的单一切片。尽管仍可识别出一些较大的结构，但由于冰层过厚导致玻璃化质量差，精细结构细节淹没在噪声和颗粒状纹理中，例如箭头所指的上方线粒体区域即为明显例证。

图1：工作流程。 冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）数据采集前遵循的示意图工作流程。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：在网格上培养细胞。（A）在 P100 培养皿中生长的细胞，融合度约为 80%–90%。（B）接种细胞后的 P60 培养皿，其中含有多个网格。（C）细胞接种 24 小时后在网格表面生长的情况。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：将载网装载到样品架上并转入转移腔室。（A）充满液氮的工作站，转运器和冷冻盒已准备好用于装载载网。（B）已插入装载器并装载了载网的样品架。（C）转运器中位于3号位置且未加盖的样品架。（D）已连接转移腔室的工作站。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：将样品装入 TXM（A）将转移室连接至 TXM。（B）TXM 内部的样品穿梭装置。（C）TXM 机械臂将样品支架插入样品台。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：冷冻软X射线断层成像示例。 上排：理想样品，（A）网格方格的二维拼接图，显示位于中心的孤立细胞。（B）从重建的三维体积数据中提取的一个切片，展示图（A）中红框标记的区域。与（D）相比，该图像更加平滑且可见更多细节。下排：非理想样品，（C）网格方格的二维拼接图，显示细胞密度过高，且冰层和网格膜存在裂纹（红色箭头）。（D）从重建的三维体积数据中提取的一个切片，展示图（C）中红框标记的区域。图像的颗粒状纹理表明玻璃化效果较差或未达到最佳状态。N：细胞核；M：线粒体；ER：内质网；MV：多泡体；V：液泡；比例尺：A 和 C 为 20 µm；B 和 D 为 2 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

样品制备是获得高质量软X射线断层图像的关键步骤，因为图像质量直接取决于样品玻璃化效果以及细胞所嵌入的冰层厚度。在冰层较薄的区域可采集到高信噪比的投影图像，从而能够最小化实现最高可能分辨率所需的辐射剂量。此外，细胞的融合度也会影响最终断层图像的质量，因为在旋转过程中应避免邻近细胞进入视场（FoV）。最后，金（Au）标记物的合理分布将决定投影图像配准的准确性，从而最终影响三维重建体积的质量。需要注意的是，若金标记物在载网上分布得当，可实现投影图像配准步骤的自动化；否则，这一关键步骤将需要操作者具备较高的专业技能。

本文所述的方案仅代表一种可能的样品制备策略，该策略与冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中所采用的方法具有相似之处。在这两种情况下，改进苛刻的样品制备流程以提高可重复性，对于这些技术的成功应用至关重要，目前已有诸多努力致力于实现这一目标²⁹。值得指出的是，除了成像分离的细胞外，只要在高倾转角度下穿过切片的透射信号足够强，组织切片也可用于成像。通常情况下，这要求切片厚度为几微米（低于10 µm）。

为了对细胞内的特定结构或事件进行成像，必须确保该特定特征位于倾斜系列图像的视场（FoV）范围内。由于冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）中的视场通常限制在10 × 10 µm²到15 × 15 µm²之间（具体取决于物镜，并需考虑分辨率至少两倍的像素过采样），其范围往往小于整个细胞的延伸区域（参见图5中红色方框所示）。因此，必须找到感兴趣区域（ROI）并进行准确标记。这通常通过荧光标记和可见光关联成像方法实现。结合落射荧光的二维策略较为直接，因为软X射线透射显微镜集成了在线可见光荧光显微镜；但也可采用其他方法获取高分辨率的二维或三维荧光信号^{4,12,13,15,16}。在这些情况下，载网需首先在特定仪器（如超分辨率显微镜）中进行成像。需要注意的是，最有效的关联成像策略是在低温条件下进行数据采集。这是因为室温（RT）下的可见光荧光成像与样品玻璃化之间的时间延迟可能导致无法及时捕捉到目标细胞事件；此外，玻璃化过程还可能导致在室温下已成像的目标细胞从载网上脱落。尽管大多数关联成像方法都涉及将样品载网在不同仪器之间操作和转移，从而增加了载网污染或损坏的风险，但其优势显而易见：能够在细胞整体结构背景下精确定位特定事件或分子。

当需要进行全细胞成像时，只要总剂量不超过辐射损伤限度，就可以将不同的断层图像拼接起来。通常，在同一细胞上采集少数几个断层图像所沉积的剂量远低于可达到分辨率下的限值（10⁹ Gy），因此无需采取特定策略来降低剂量，尽管具体情况取决于样品和实验条件。然而，在进行如光谱断层成像等高强度数据采集时，则确实需要尽量减少剂量，并应采用相应的便捷数据采集方法和特定的处理策略。

冷冻软X射线断层成像技术（Cryo-SXT）存在若干局限性，此处应予以说明。第一个局限性是众所周知的“缺失楔形”问题，这是使用平面样品支撑材料所固有的缺陷。过去曾使用并仍在某些设施中采用允许180度旋转的毛细管样品支撑材料，但这类支撑材料也存在缺点，例如由于玻璃吸收导致对比度降低，以及仅限于使用悬浮状态的细胞。减轻缺失楔形影响的一种方法是进行双倾转断层成像，目前在Mistral光束线上已可实现该技术。第二个局限性来自此类显微镜中所使用的菲涅耳波带片透镜。该透镜决定了可达到的最终分辨率和景深（DoF），二者密切相关。这意味着提高分辨率将导致景深减小，而细胞的厚度通常较大。例如，一个40 nm的波带片透镜理论上具有3 µm的景深和24.4 nm的半节距分辨率。因此，分辨率与景深之间的权衡至关重要，透镜的选择将取决于细胞类型^30,31。最后，全球范围内的操作型透射X射线显微镜（TXM）远未达到理想显微镜的水平，目前正不断努力改进光学系统以实现理论预期性能。此外，重建体积数据的可视化与分割可通过特定的软件工具完成^25,32,33,34。

总之，冷冻软X射线断层成像技术（cryo-SXT）能够在中等分辨率（半节距25-30 nm）下对细胞进行定量成像，并实现统计意义上的成像数量（每天可获取数十个断层图像）。该技术可用于获取特定条件下细胞器的结构组织、空间分布和尺寸信息，例如在病原体感染或疾病过程中，或在精确的时间点及特定处理后。因此，cryo-SXT 是一种有用的生物成像补充技术，可与更常见的电子显微镜和可见光显微镜相互补充，各类技术分别适用于不同尺度的样品和分辨率范围。cryo-SXT 常与可见光荧光显微技术联用，实现关联成像，但也可与其他冷冻关联成像策略结合使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amira	赛默飞世尔科技		用于分割的软件
Au 穿孔碳膜  定位网格	（Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2 Au G200F1	Au Holey Carbon Films 寻找网格
金纳米颗粒	BBI集团，英国加的夫	100纳米金纳米颗粒	100 nm 金纳米颗粒（NPs）在 Mistral（Alba）的制备
金纳米颗粒	BBI集团，英国加的夫	250纳米金纳米颗粒	B24（Diamond）处的250 nm金纳米颗粒（NPs）
Axio Scope A1	Zeiss	430035 9060	荧光显微镜
1号滤纸印迹法	Whatman	WHA10010155	印迹滤膜
Bsoft			用于投影比对、重构与可视化的软件（Heymann 等，2008）
嵌合体			用于分割的软件（Pettersen 等，2004）
冷冻电镜电晕放电装置套件	PELCO easiGlow	91000S	辉光放电清洗系统
铜孔状碳膜  定位网格	（Quantifoil Micro Tools Gmbh）	R 2/2Cu G200F1	铜质带孔碳膜寻位网格
胎牛血清	Sigma	F9665	热灭活，经无菌过滤，适用于细胞培养
ImageJ			用于图像处理与分析的 Java 软件（NIH） & LOCI 威斯康星大学
IMOD			用于投影对齐、重构与可视化的软件（Kremer 等，1996）
Leica EM GP 网格冷冻制样仪	Leica	16706401	自动冷冻制样仪 EM
LINKAM 冷冻载台	Linkam科学仪器公司	CMS 196	冷冻关联显微镜载台
MIB			用于分割的软件（Belevich 等，2016）
P100 培养皿	Sigma	P6106	用于细胞培养和无菌处理
P60 培养皿	Sigma	D8054	用于细胞培养和无菌处理
聚赖氨酸	Sigma	P4707	聚-L-赖氨酸溶液 0.01%，经无菌过滤
软X射线显微镜 0.25–1.2 keV	Xradia	NCT-SB	透射软X射线显微镜
SURVOS			用于分割的软件  （Luengo 等，2017）
Tomo3d			用于重建的软件（SIRT，WBP）（Agulleiro 等，2011）
TomoJ			用于重构的软件（ART）（Messaoudi 等，2007）
XM 数据浏览器	Zeiss		TXM 软件