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TGF-β介导的内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对EndMT效应分子的功能评估

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DOI：

10.3791/62198

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2021年2月26日

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1Dept. Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center, 2Oncode Institute, Leiden University Medical Center

本文内容

摘要

我们描述了通过观察细胞形态变化以及利用免疫荧光染色检测内皮-间质转化（EndMT）相关标志物表达变化，来研究TGF-β2诱导内皮细胞发生EndMT的方法。同时介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术，并用于敲除编码Snail的基因，以探究其在TGF-β2诱导EndMT过程中的作用。

摘要

在特定外部信号刺激及某些转录因子被激活的情况下，内皮细胞可分化为类似间充质细胞的表型，该过程被称为内皮-间充质转化（EndMT）。越来越多的研究结果表明，EndMT 与多种人类疾病（如纤维化和癌症）存在因果关联。此外，来源于内皮的间充质细胞可能应用于组织再生，因为它们可进一步分化为多种细胞类型（例如成骨细胞和软骨细胞）。因此，对 EndMT 的选择性调控可能具有临床应用潜力。与上皮-间充质转化（EMT）类似，分泌型细胞因子转化生长因子-β（TGF-β）可强烈诱导 EndMT，TGF-β 能激活一类被称为 EndMT 相关转录因子（EndMT-TFs）的表达，其中包括 Snail 和 Slug。这些 EndMT-TFs 随后分别上调间充质蛋白的表达水平，并下调内皮细胞蛋白的表达水平。本文描述了在体外研究 TGF-β 诱导 EndMT 的实验方法，包括一套用于研究特定转录因子在 TGF-β 诱导 EndMT 中作用的实验方案。利用这些技术，我们提供了证据表明 TGF-β2 可在小鼠胰腺微血管内皮细胞（MS-1 细胞）中诱导 EndMT，而通过成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）介导的基因编辑技术对 Snail 基因进行遗传性敲除，可消除这一现象。该方法可作为研究内皮细胞生物学潜在调控因子的模型，并可用于开展遗传学或药理学筛选，以鉴定新的 EndMT 调控因子，从而为人类疾病的治疗提供潜在应用价值。

引言

内皮-间充质转化（EndMT）是一种多步骤且动态的生物学现象，与多种生理和病理过程相关1,2。在发生EndMT时，内皮细胞逐渐丧失其内皮特性，同时获得间充质特征3；因此，原本紧密排列且结构有序的内皮细胞会分化为细长的、类似间充质的细胞。EndMT过程中的形态学变化伴随着特定基因和蛋白质表达的改变。通常情况下，维持内皮特性的蛋白（如血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）、血小板/内皮细胞黏附分子-1（CD31/Pecam-1））的表达水平下降；与此同时，与间充质功能相关的蛋白（如α-平滑肌肌动蛋白（α-Sma）和22α平滑肌蛋白（Sm22α））则逐渐积累。越来越多的研究表明，出生后的EndMT参与了多种人类疾病的发展，包括癌症、心脏纤维化、肺动脉高压（PAH）、动脉粥样硬化（AS）、器官纤维化等2,4,5,6,7。深入理解EndMT的潜在机制及其调控方式，将为EndMT相关疾病的治疗以及再生医学提供新的治疗策略。

TGF-β 是内皮-间质转化（EndMT）的主要诱导因子之一，其他已知的参与因素包括 Wnt/β-catenin、Notch 通路以及某些炎性细胞因子1。由于细胞所处的微环境对 TGF-β 触发的反应至关重要，因此 TGF-β 与其他促进 EndMT 信号通路之间的相互作用，对于 TGF-β 诱导 EndMT 反应具有重要意义。当 TGF-β 激活其细胞表面的 I 型和 II 型丝氨酸/苏氨酸激酶受体后，细胞内经典的 Smad 信号通路被激活。TGF-β 受体介导的 Smad2/3 被磷酸化后，与 Smad4 形成异源复合物并转入细胞核，在核内上调与 EndMT 相关的转录因子的表达。类似于上皮-间质转化（EMT），TGF-β 信号通路可诱导 Snail、Slug、Twist、Zeb1 和 Zeb2 等转录因子的表达，从而参与 EndMT 过程中的基因重编程8。

Snail 常被认定为内皮-间充质转化（EndMT）中的关键因子。Snail 可结合于编码细胞间黏附蛋白的基因启动子区域，抑制其转录，同时促进间充质蛋白的表达，从而实现功能上的平衡9。内皮细胞具有高度异质性，不同细胞背景或细胞类型中，多种细胞外刺激对 EndMT 的相对影响可能存在差异10。由于 EndMT 与上皮-间充质转化（EMT）具有相似性，部分研究方法可用于共同探讨这两种机制8。在此方面，国际 EMT 协会（TEMTIA）特别强调，必须采用多种互补的技术手段，才能最终证实 EMT/EndMT 的发生11。

本文介绍了一种监测和可视化转化生长因子-β（TGF-β）诱导的内皮间质转化（EndMT）过程的方法。免疫荧光染色可提供目标蛋白/标志物表达变化的基本信息，这些标志物被用作判断EndMT过程是否发生的指标。此外，免疫荧光染色还可用于观察蛋白/标志物的定位以及细胞形态。为了研究特定转录因子（TFs）（或其他上游或下游调控因子）在TGF-β介导的EndMT过程中的潜在作用，本文以转录因子Snail为例，描述了一种利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）基因编辑技术从细胞中敲除特定基因的实验方案。Cas9是一种双RNA引导的DNA内切酶，可识别并切割细菌中与CRISPR序列互补的DNA序列12。目前CRISPR/Cas9系统被广泛应用，因其可在体外和体内高效实现基因工程操作13。在单导向RNA（sgRNA）的引导下，外源表达的Cas9可在特定基因位点的预选靶序列处产生双链断裂。随后通过非同源末端连接（NHEJ）机制修复Cas9诱导的断裂，该过程伴随随机的核苷酸插入或缺失，从而导致靶基因的破坏和失活。本文详细描述了设计特异性sgRNA以及构建包含所设计sgRNA的慢病毒兼容载体的方法。由此可高效、稳定地获得基因敲除的内皮细胞。

在本研究中，我们采用小鼠胰腺微血管内皮细胞（MS-1）14作为模型系统，以研究TGF-β2诱导的内皮-间质转化（EndMT）过程。我们之前的研究表明，Snail是TGF-β2上调的主要转录因子，介导MS-1细胞中的EndMT过程15。当通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在MS-1细胞中阻断Snail表达后，TGF-β2无法介导EndMT。该实验流程可用于研究其他（疑似）与EndMT相关的基因。

方案

1. TGF-β2 诱导内皮-间质转化

  1. MS-1 细胞 在杜氏改良伊格尔培养基中 含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于含5% CO₂的培养箱中培养2，37 °C）。所有培养皿/板在使用前用 0.1% w/v 明胶包被 10 分钟。
  2. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤MS-1细胞，向10 cm培养皿中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA），于37 °C孵育2分钟以使细胞脱落。随后加入5 mL完全培养基以终止反应。
  3. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，以200 x g离心 g 室温下持续3分钟。
  4. 弃去上清液，将细胞重悬于 4 mL 含 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜培养基中。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  5. 接种 1 × 103 每平方厘米细胞数2 用于进一步培养。例如，接种 9.5 x 103 细胞/孔（6孔板），或1.9 × 103 每孔细胞数/24孔板
  6. 将细胞孵育过夜，使其贴壁并恢复，随后用 TGF-β2 刺激 MS-1 细胞 3 天。在 TGF-β2 刺激前 30 分钟加入 TGF-β 受体激酶抑制剂 SB431542（5 µM）。其他细胞用溶剂（DMSO）处理。
    注意：将TGF-β2溶解于含0.1%人牛血清白蛋白（BSA）的4 mM HCl中。对照组加入等量不含TGF-β2的配体缓冲液。TGF-β2浓度可根据具体实验调整为0.1–1 ng/mL。参见相应图示说明。
  7. 3天后，使用明场成像（倒置显微镜）观察细胞形态，并进行免疫荧光染色（见步骤2），以评估与内皮-间质转化（EndMT）相关标志物的变化。至少重复三次独立实验，以获得生物学重复样本。

2. 免疫荧光染色

  1. 胰酶消化培养的 MS-1 细胞（步骤 1.2），然后将 1.9 × 103 个细胞重新接种于置于 24 孔板底部的 0.1% w/v 明胶包被的 12 mm 圆形盖玻片上。
  2. 细胞培养过夜后，加入 TGF-β2（终浓度为 1 ng/mL），继续培养 3 天。以含配体缓冲液的培养基作为阴性对照。
  3. 进行 Pecam-1 和 Sm22α 免疫染色。
    1. 经 TGF-β2（或对照）刺激细胞 3 天后，吸除培养基，并用 1× PBS 洗涤细胞。
    2. 每孔加入 300 µL 4% 多聚甲醛，在室温下孵育 10 分钟以固定细胞。孵育后用 1× PBS 洗涤 3 次。
    3. 每孔加入含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS 溶液 300 µL，在室温下孵育 10 分钟以通透细胞。孵育结束后吸除 Triton X-100 溶液，并用 1× PBS 洗涤 3 次。
    4. 用含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS 在室温下封闭细胞 45 分钟。
    5. 将识别小鼠蛋白的 Pecam-1 和 Sm22α 一抗按 1:500 比例用 1× PBS 稀释，然后在室温下与固定后的细胞孵育 45 分钟。
    6. 用 1× PBS 洗涤 3 次后，在室温下加入 1000 倍稀释的二抗（包括驴抗大鼠 Alexa 488 和羊抗兔 Alexa 594）孵育 45 分钟。
      ​注意：染色过程中需避免光照。
    7. 用 1× PBS 冲洗 3 次后，将接种有细胞的盖玻片细胞面朝下置于载玻片上的封片剂液滴中，该封片剂含有 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），用于细胞核染色。
    8. 用透明指甲油封固盖玻片边缘，并于 4 °C 保存。
    9. 使用共聚焦显微镜采集代表性图像。激光波长分别设定为 405 nm、488 nm 和 552 nm，用于检测 DAPI、Pecam-1 和 Sm22α。每个通道的所有图像均采用相同的参数和曝光时间拍摄。至少进行三次独立实验以获得生物学重复样本。

3. 使用 CRISPR/Cas9 编辑敲除 Snail

  1. 设计两个独立的靶向小鼠 Snail 基因的 sgRNA。
    1. 根据目标基因名称和物种，使用在线工具 CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/）和 Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）设计 sgRNA。
    2. 使用两种独立的算法（包括 Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/） 和 CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/））预测所设计的靶向 Snail 的 sgRNA 的脱靶活性。
    3. 选择脱靶活性最低的两个 sgRNA。设计带有 BveI 酶切位点的两条互补 sgRNA 寡核苷酸链。正义链以 5'-ACCG-3' 开头，反义链以 5'-AAAC-3' 开头。
    4. 订购寡核苷酸链进行商业合成，以供后续使用。
  2. 将互补的引导 RNA 寡核苷酸链克隆至经 BveI 酶切的 AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer 慢病毒载体质粒中，构建 AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16。
    1. 使用 BveI 酶16 对 AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer 质粒进行酶切。将 2 µg 的 AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer 质粒、5 µL 的 10x Buffer O 和 5 µL 的 BveI 酶混合，并加入无菌水至总体积为 50 µL。
    2. 涡旋混匀反应体系并短暂离心。在 37 °C 下孵育 1 小时。
    3. 将反应混合物上样至 1% 琼脂糖凝胶，在 1x Tris-乙酸-EDTA（TAE，50x TAE 储液：将 242 g Tris 碱溶于水中，加入 57.1 mL 冰乙酸和 100 mL 500 mM EDTA（pH 8.0）溶液，加水定容至 1 L）缓冲液中电泳，直至获得良好的条带分离效果。
    4. 从凝胶中切下骨架片段，按照试剂盒说明书（见材料表）使用凝胶回收试剂盒进行纯化，并用 40 µL 洗脱缓冲液（EB）洗脱骨架。
    5. 将 5 µL 的 100 pmol/µL 正义寡核苷酸和 5 µL 的 100 pmol/µL 反义寡核苷酸与 1 µL 的 1 M Tris-HCl（pH 8.0）混合，并加入无菌水至总体积为 100 µL，以退火形成 gRNA 寡核苷酸双链。在 100 °C 下孵育 5 分钟，然后用铝箔包裹管子，缓慢冷却至室温，作为插入片段备用。
    6. 将互补的 gRNA 寡核苷酸与经 BveI 酶切的骨架连接：混合 1 µL 纯化的 BveI 酶切 AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer 骨架、2 µL 插入片段（稀释 1:300）、2 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液和 1 µL T4 DNA 连接酶，并加入无菌水至总体积为 20 µL。短暂离心后，在室温下孵育 4 小时，以备后续使用。
      ​注意：进行连接反应时，需设置两个对照组。第一组对照：混合 1 µL 纯化的骨架、2 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液和 1 µL T4 DNA 连接酶，并加入无菌水至总体积为 20 µL，但不加入寡核苷酸 DNA。第二组对照：混合 1 µL 纯化的骨架和 2 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液，并加入无菌水至总体积为 20 µL，但不加入退火后的寡核苷酸 和 T4 连接酶。这两个对照连接反应用于确定下一步转化中的背景信号，并评估连接效率。
  3. 将连接反应产物转化至感受态 TOP10 E. coli 中。
    1. 从 -80 °C 冰箱中取出感受态 TOP10 E. coli 细胞，在冰上融化。
    2. 向 50 µL 感受态细胞中加入 2 µL 连接产物，冰上静置 30 分钟。
    3. 42 °C 热激 30 秒，然后立即放回冰上放置 2 分钟。
    4. 向混合物中加入 950 µL 新鲜的 LB（Lysogeny 培养基）培养基，于 37 °C 剧烈振荡培养 60 分钟。
    5. 离心收集细胞，涂布于预热的含氨苄青霉素（100 µg/mL）的 LB 平板上，37 °C 过夜培养。
  4. 验证 gRNA 寡核苷酸 在质粒中的正确插入。
    1. 从平板上挑取 3–5 个单菌落，接种于 1 mL 含氨苄青霉素（100 µg/mL）的 LB 培养基中，30 °C 振荡过夜培养。
    2. 按照质粒提取试剂盒说明书（材料表）提取质粒 DNA，并使用 U6 启动子引物 5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3' 进行测序，以确认 gRNA 寡核苷酸的正确插入。

4. 生成蜗牛基因敲除的 MS-1 细胞

  1. 制备携带 Cas9 或靶向 Snail 的 gRNA 的慢病毒颗粒。
    1. 在培养箱（5% CO2，37 °C）中，使用含 10% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基，在 14.5 cm 培养皿（或 T75 培养瓶）中培养 HEK 293T 细胞。
    2. 将 9.9 µg 靶基因质粒（AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA 或 pLV-Cas917 质粒）与辅助质粒混合：3.5 µg pCMV-VSVG（编码水疱性口炎病毒 G 蛋白，VSV-G）、6.6 µg rev 响应元件质粒 pMDLg-RRE（编码 Gag 和 Pol）以及 5.0 µg pRSV-REV（编码 Rev），溶于 500 µL 无血清培养基中。将 50 µL 聚乙烯亚胺（PEI）（2.5 mg/mL）重悬于 500 µL 无血清培养基中。通过移液器轻轻吹打混合质粒与 PEI 溶液。室温孵育 20 分钟。
    3. 将步骤 4.1.2 中的混合液加入至 14.5 cm 培养皿（或 T75 培养瓶）中 80% 汇合度的 HEK 293T 细胞中，细胞培养基为含 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。选用 HEK293T 细胞的原因是其易于转染且能高效产生病毒18。
    4. 将转染后的 HEK 293T 细胞转移至微生物与生物医学实验室生物安全实验室（BMBL）中继续培养 24 小时。
    5. 在 BMBL 实验室内，将 HEK 293T 细胞的转染培养基更换为 12 mL 新鲜的完全 DMEM 培养基（含 FBS 和青霉素/链霉素），继续孵育细胞 24 小时。
    6. 使用 20 mL 注射器和 0.45 µm 滤器收集并过滤培养基。将条件培养基转移至 15 mL 聚丙烯管中。
    7. 向 HEK 293T 细胞培养皿中加入 12 mL 新鲜的完全 DMEM 培养基（含 FBS 和青霉素/链霉素），继续培养 24 小时。
    8. 再次使用 20 mL 注射器和 0.45 µm 滤器收集并过滤培养基。将条件培养基转移至 15 mL 聚丙烯管中。将含有慢病毒颗粒的培养基分装为每管 1 mL，于 -80 °C 保存以备后续使用。
  2. 用 pLV-Cas9 病毒感染 MS-1 细胞。
    1. 在慢病毒感染前 24 小时，将 1 × 105 个 MS-1 细胞接种于 6 孔板的每孔中。
    2. 在 37 °C 水浴中解冻冷冻保存的 pLV-Cas9 病毒分装液。
    3. 将 1 mL 病毒培养基与 1 mL 含 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜 DMEM 培养基混合。向培养基中加入 polybrene（终浓度为 10 μg/mL），以提高感染效率。
    4. 吸除 6 孔板中的原有培养基，替换为病毒/polybrene 混合培养基，并在培养箱中继续培养 24 小时。感染后 24 小时，更换为新鲜培养基，再继续培养 24 小时。
      ​注意：始终保留一个未感染的孔作为对照组。
    5. 吸除感染组和对照组的培养基，更换为含 4 µg/mL 杀稻瘟菌素（blasticidin）的 DMEM 培养基。
    6. 将培养板放回 37 °C 培养箱中继续培养 1 周。未感染的细胞将因杀稻瘟菌素的作用而死亡。当存活细胞达到 80% 汇合度时进行传代，并持续进行杀稻瘟菌素筛选。
    7. 使用抗 Cas9 抗体通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测 MS-1 细胞中 Cas9 的表达（Cas9 的分子量约为 160 kDa）。
  3. 分别用两种独立的 gRNA 慢病毒对 pLV-Cas9 MS-1 细胞进行感染。
    1. 在感染前 24 小时，将 1 × 105 个 pLV-Cas9 MS-1 细胞接种于 6 孔板的每孔中。
    2. 按照步骤 4.2 所述相同方案，分别用两种 gRNA 慢病毒对细胞进行独立感染。
    3. gRNA 病毒感染 24 小时后，更换新鲜培养基，并继续培养 24 小时。
    4. 将培养基更换为含 1 µg/mL 嘌呤霉素（puromycin）的 DMEM 培养基。将培养板放回 37 °C 培养箱中继续培养 1 周，确保未感染的细胞完全死亡。当细胞汇合度达到 80% 时进行传代，并持续进行嘌呤霉素筛选。
    5. 使用抗 Snail 抗体通过蛋白质印迹法检测 MS-1 细胞中 Snail 基因的敲除情况（Snail 的分子量约为 35 kDa）。

结果

TGF-β2 在 MS-1 内皮细胞中诱导内皮-间充质转化并促进 Snail 表达
TGF-β 是最有可能诱导内皮-间充质转化（EndMT）的细胞因子之一。用 TGF-β2（1 ng/mL）处理 MS-1 细胞 3 天后，内皮 MS-1 细胞失去其铺路石样的结构，并分化为梭形的类间充质细胞（图 1A）15。为进一步验证 TGF-β2 在诱导细胞表型改变中的作用，我们在 TGF-β2 刺激前使用小分子激活素受体样激酶（ALK）4/ALK5/ALK7 抑制剂 SB431542 对细胞进行预处理19。SB431542 完全阻断了 TGF-β2 诱导的细胞形态变化（图 1A）。为进一步研究 TGF-β2 诱导的 EndMT 过程，我们检测了 EndMT 相关标志物表达的变化。如 图 1B 所示，TGF-β2 刺激后，内皮蛋白 Pecam-1 的表达显著降低，而间充质因子 Sm22α 的表达则被 TGF-β2 显著上调15。这些数据支持 TGF-β2 可触发 MS-1 细胞发生 EndMT 的观点。接下来，我们研究了 TGF-β2 对 Snail 和 Slug 表达的影响。如 图 1C 所示，Snail 的表达在 TGF-β2 处理后明显上调，而 Slug 的表达在 MS-1 细胞中不受 TGF-β2 的影响15。三次独立实验中 Snail 表达量化的结果如 图 1D 所示。

耗竭 蜗牛 通过CRISPR/Cas9在MS-1内皮细胞中
由于Snail可被TGF-β2诱导，并可能参与TGF-β2介导的内皮-间质转化（EndMT），我们采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在MS-1细胞中实现Snail表达的遗传性缺失。我们假设Snail的缺失将 蜗牛 足以抑制TGF-β2诱导的内皮-间质转化（EndMT）。如图所示 图 2A我们通过两步法生成了Snail基因敲除细胞。首先，通过用表达Cas9的慢病毒感染MS-1细胞，实现Cas9的异位表达。由于pLV-Cas9载体中含有杀稻瘟菌素抗性盒，我们通过Western blot分析检测了具有杀稻瘟菌素抗性的细胞中Cas9的表达情况（图 2D。随后，我们引入了特异性靶向 蜗牛 以破坏其蛋白表达。该操作还通过感染携带AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA构建体的慢病毒颗粒实现，该构建体包含嘌呤霉素表达盒。表达Cas9的细胞再次感染含有gRNA的慢病毒，并进一步用嘌呤霉素筛选。两条互补的sgRNA寡核苷酸靶向小鼠 蜗牛 预测的脱靶活性较低图2B，C）。在引入两个独立的 蜗牛 在表达Cas9的MS-1细胞中，sgRNA处理后Snail蛋白表达被完全抑制（图 2D)15.

Snail 缺乏抑制 MS-1 细胞中 TGF-β2 诱导的内皮-间充质转化（EndMT）
为阐明 Snail 在 TGF-β2 介导的内皮-间充质转化（EndMT）中的功能，我们在 Snail 缺失的细胞中进行了 EndMT 检测，并与亲本 MS-1 细胞进行比较。如图 3A所示，Snail 的敲除足以抑制 TGF-β2 在 MS-1 细胞中诱导的成纤维细胞样形态改变15。此外，在 Snail 缺失的 MS-1 细胞中，TGF-β2 介导的 Pecam-1 下降和 Sm22α 上调均被完全阻断。综上所述，我们证实 Snail 对 MS-1 细胞中 TGF-β2 介导的 EndMT 过程至关重要（图 3B）15。

细胞培养实验；TGF-β2作用；显微镜图像；Western blot分析；蛋白表达；时间进程图
图1．TGF-β2在MS-1细胞中诱导内皮-间充质转化（EndMT）及Snail表达。A．TGF-β2及/或TGF-β I型受体激酶抑制剂SB-431542对细胞形态的影响。MS-1细胞经TGF-β2（1 ng/mL）和/或SB-431542（SB，5 µM，于TGF-β2处理前30分钟加入）处理2天后的明场图像。比例尺为200 µm。B．在含TGF-β2（1 ng/mL）的培养基中培养3天的MS-1细胞中Pecam-1（绿色）和Sm22α（红色）的免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示（DAPI）。比例尺：50 µm。C．使用TGF-β2刺激后的MS-1细胞全细胞裂解液进行Western blot检测。如Ma等15先前报道，TGF-β2刺激增强了Snail的表达，而Slug的表达未见变化。D．通过整合三次独立的Western blot实验结果对Snail表达进行定量分析。请点击此处查看本图的放大版本。

CRISPR-Cas9 基因编辑示意图，展示在 MS-1 细胞中构建 Snail 基因敲除的策略；包括 gRNA 序列及脱靶活性分析。
图 2．通过 CRISPR-Cas9 基因编辑实现 Snail 基因的缺失。A． 构建 Snail 基因敲除细胞的示意图。Bsd：Blasticidin（杀稻瘟菌素）。Puro：Puromycin（嘌呤霉素）。B． 利用 CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/）和 Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）设计的两条独立靶向 Snail 的 sgRNA 寡核苷酸序列。C． 使用 Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）预测的两条 Snail gRNA 的脱靶活性。D． 通过 Western blot 分析检测野生型（WT）和 Cas9 过表达的 MS-1 细胞中 Cas9 和 Snail 的表达水平。E． 在 MS-1 细胞中使用两条独立的 gRNA 实现 Snail 基因敲除，通过 Western blot 分析验证。我们在 Ma 等人15 中已报道过类似结果。请点击此处查看该图的放大版本。

TGF-β2 在野生型与 Snail 基因敲除细胞中诱导内皮-间质转化；显微镜图像、免疫荧光、信号通路示意图。
图3．Snail 基因缺失抑制 TGF-β2 诱导的 MS-1 细胞内皮-间质转化。A. 野生型（WT，上图）和 Snail 基因敲除（下图）MS-1 细胞经 TGF-β2（0.1 ng/mL）处理 3 天后的明场图像。比例尺为 200 µm。B. 在含 TGF-β2（1 ng/mL）的培养基中培养 3 天的 MS-1 细胞中 Pecam-1（绿色）、Sm22α（红色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光染色。Snail 基因缺失可阻断 TGF-β2 诱导的 Pecam-1 表达下降及 Sm22α 表达上升。比例尺为 50 µm。C. Snail 基因敲除对 TGF-β 诱导 MS-1 细胞发生内皮-间质转化作用的示意图。TGF-β 通过 Smad 通路磷酸化 Smad2/3，促进 Snail 表达，进而驱动内皮-间质转化。利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除 Snail 可阻断 TGF-β 介导的内皮-间质转化。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

理解内皮-间质转化（EndMT）的机制对于调控该过程并靶向治疗EndMT相关疾病至关重要。本文介绍了通过CRISPR/Cas9介导的稳定基因敲除技术在细胞中敲除Snail基因，从而开展TGF-β诱导的EndMT实验，并探究转录因子Snail在TGF-β触发的EndMT过程中的作用。利用CRISPR/Cas9方法敲除Snail可成功阻断TGF-β2驱动的MS-1细胞EndMT过程（图3C）。为了研究诸如TGF-β等细胞因子对EndMT的影响，通常将内皮细胞（ECs）暴露于细胞因子中，随后根据细胞形态学变化以及内皮和间质标志物表达的变化来评估EndMT的发生情况。TGF-β2可强烈诱导MS-1细胞发生EndMT，并伴随转录因子Snail表达的显著上调。TGF-β诱导的EndMT相关转录因子（EndMT-TFs）可能因物种或组织特异性的内皮细胞类型不同而有所差异。例如，我们观察到在MS-1细胞中，TGF-β显著上调Snail的表达，而Slug无明显变化；但在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，暴露于TGF-β后Snail 和Slug 的表达均会上调20。

我们通过两种方式评估了内皮-间充质转化（EndMT）过程的程度：首先观察细胞形态的变化，然后检测与EndMT相关标志物的表达变化。经TGF-β处理3天后，细胞发生了EndMT，表现出一致的形态学改变以及EndMT相关标志物表达的变化。除了本实验中所采用的免疫荧光染色外，标志物的变化还可通过蛋白质水平的Western印迹法或基因水平的qRT-PCR（实时定量反转录PCR）进行监测21。除本方案中展示的这两种节省时间和成本的方法外，尚有其他方法可用于检测EndMT。例如，可通过转录组分析（如RNA测序或qPCR）比较处理组与对照组细胞中内皮源性和间充质相关基因的表达水平，从而精确评估EndMT22,23。此外，EndMT通常伴随着屏障功能的稳定丧失，该功能可通过阻抗谱技术进行评估24。进一步地，还可检测EndMT来源细胞是否获得了类似干细胞的特性。例如，在特定培养条件下，具有间充质样特征的EndMT细胞可进一步分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或（肌）成纤维细胞。因此，通过进一步分析这些细胞向中胚层谱系不同细胞类型的分化能力（如基因表达检测和基质染色），有助于证明EndMT来源细胞的多能性。最后，EndMT的评估方法不仅限于体外研究，还可推广应用于体内或离体器官中EndMT与某些疾病关系的研究。在此背景下，内皮特异性的谱系示踪策略已在EndMT相关研究中得到广泛应用25。

为了研究Snail在内皮-间质转化（EndMT）过程中的作用，本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除该基因。实验数据显示，在Snail缺失的MS-1细胞中，TGF-β2无法介导EndMT过程。该结果表明，Snail对于TGF-β2诱导的MS-1细胞EndMT是必需的。我们使用一个独立的U6启动子驱动的sgRNA表达盒，以引入特异性sgRNA，引导Cas9靶向Snail基因。除该方法外，Ran等人26描述了另一种策略，即将sgRNA寡核苷酸序列克隆至Cas9骨架中，从而构建同时包含Cas9和gRNA的表达载体。新兴的新型技术使CRISPR/Cas系统能够整合额外功能。例如，通过向表达Cas9的细胞中递送多个sgRNA，可实现双基因或三基因敲除27。经改造的Cas13蛋白可靶向并降解RNA分子，而不破坏内源性DNA28。除了使用CRISPR/Cas进行基因敲除外，短发夹RNA（shRNA）也可作为稳定抑制靶基因表达的替代方法29。对于所有CRISPR/Cas基因编辑技术，均需始终考虑脱靶切割的可能性。此外，小干扰RNA（siRNA）可瞬时沉默基因表达，且其浓度会随着细胞分裂而被稀释30。这两种方法均只能部分抑制靶基因的表达。相比之下，异位基因表达也被用于验证EndMT/EMT过程中的基因功能31。该方法可用于判断某一基因的上调是否足以引发EndMT反应。因此，目前已有多种技术策略可用于识别和验证EndMT的潜在调控因子。此外，转录组学分析也是识别和系统分析EndMT相关调控因子的有效手段。我们建议采用多种互补的技术方法来研究EndMT的调控机制。

综上所述，我们介绍了一种用于鉴定在 TGF-β 诱导的内皮-间质转化（EndMT）过程中可能发挥功能作用的因素的工作流程。该方法也可用于研究其他刺激因素（如细胞因子、生长因子、机械刺激、细胞间相互作用）是否能够调节 EndMT，以及 TGF-β 与其他刺激因素之间的相互作用。此外，我们重点介绍了一种利用 CRISPR/Cas 基因编辑技术来阐明特定基因是否为 TGF-β 诱导 EndMT 所必需的方法。为演示该方法，我们使用了强效 EndMT 诱导剂 TGF-β2 作用于 MS-1 细胞，但该实验方案可适用于其他细胞因子及其他细胞类型。我们期望本详细描述的实验方案能为今后与 EndMT 相关的研究提供基础。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由 CGC.NL 和荷兰心血管研究倡议组织（荷兰心脏基金会、荷兰大学医学中心联合会、荷兰健康研究与发展组织以及荷兰皇家艺术与科学学院）资助，资助项目为 Phaedra-Impact（http://www.phaedraresearch.nl）。JM 获得中国国家留学基金管理委员会的支持。GSD 获得 AFM-Telethon [22379] 的 Trampoline 项目资助、FOP Italia 以及 La Fundació La Marató de TV3（#202038）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 滤膜美国 Pall 公司4614
10× T4 DNA连接酶缓冲液赛默飞世尔科技公司，美国B69
12 mm圆形玻璃片克尼特尔玻璃，德国VD10012Y1A.01
20 mL 注射器BD Eclipse，美国300629
4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Vector Laboratories，美国H-1200VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂 封片剂
AA19_PLKO 载体Dr. M Gonçalves，荷兰莱顿大学医学中心礼物
氨苄青霉素Serva Electrophoresis，美国1339903
抗小鼠 IgGGE Healthcare，美国NA931
抗兔IgG细胞信号传导，美国7074
琼脂糖瑞士罗氏公司11388991001
BlasticidinInvitrogen，美国R21001
缓冲液 O (10X)赛默飞世尔科技公司，美国BO5
BveI (Bspm1)赛默飞世尔科技公司，美国ER 1741
共聚焦显微镜德国徕卡显微系统公司SP8
DMEM 赛默飞世尔科技公司，美国11965092
驴抗大鼠Alexa 488 Invitrogen，美国A21208
FBS 赛默飞世尔科技公司，美国16000044
甲醛 赛默飞世尔科技公司，美国28908
倒置显微镜德国徕卡显微系统公司DMi8
山羊抗兔 Alexa 594 Invitrogen，美国A11012
LabNed 质粒试剂盒LabNed，美国LN2400004
MS-1细胞系美国典型培养物保藏中心（ATCC）
指甲油HEMA，荷兰透明
Pecam-1 抗体 Becton Dickinson，美国553370
PEIPolysciences，美国23966-1
PLV-Cas9 质粒Sigma-Aldrich，美国Cas9BST-1EA
嘌呤霉素Sigma-Aldrich，美国P9620
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen，德国28706
Sm22a 抗体 Abcam，英国ab14106
蜗牛细胞信号传导，美国3879
T4 DNA连接酶赛默飞世尔科技公司，美国EL 0014
TC20 自动细胞计数仪Bio-Rad，美国1450102
人TGF-β2Joachim Nickel，维尔茨堡大学礼物其他商业推荐：302-B2, R&D 系统
Triton X-100默克，美国1086031000
SB431542Tocris Bioscience，英国1614
Tris罗氏，瑞士11814273001

参考文献

  1. Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -J., Ten Dijke, P. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  2. Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases. Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).
  3. Sánchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).
  4. Evrard, S. M., et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).
  5. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  6. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  7. Clere, N., Renault, S., Corre, I. Endothelial-to-mesenchymal transition in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  8. Saito, A. EMT and EndMT: regulated in similar ways. The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).
  9. Bolós, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).
  10. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429(2012).
  11. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).
  12. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
  13. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  14. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).
  15. MA, J., et al. TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).
  16. Chen, X., et al. Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).
  17. Hunter, F. W., et al. Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide. Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).
  18. Mao, Y., et al. Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells. International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407(2015).
  19. Liu, S., et al. Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGFβ-induced breast cancer metastasis. Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).
  20. Medici, D., et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells. Nature Medicine. 16 (12), 1400(2010).
  21. Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFβ-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
  22. Dong, J., et al. Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis. Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).
  23. Oatley, M., et al. Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition. Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).
  24. Halaidych, V., et al. Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).
  25. Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Grav, L. M., et al. One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).
  28. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).
  29. Paddison, P. J., et al. Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells. Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).
  30. Reynolds, A., et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).
  31. Lourenço, A. R., et al. C/EBPɑ is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition. Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).

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TGF CRISPR Cas9 PECAM 1 SM22 Snail
TGF-β介导的内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对EndMT效应分子的功能评估
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