本文介绍了一种利用14C-乙酸对酵母进行代谢标记的实验方案，并结合薄层色谱法分离中性脂质。
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本文内容
摘要
摘要
中性脂质（NLs）是一类疏水、不带电荷的生物分子，在能量和脂质稳态中发挥关键作用。NLs 从乙酰辅酶A从头合成 ，在真核生物中主要以甘油三酯（TGs）和甾醇酯（SEs）的形式存在。负责 NLs 合成的酶在从Saccharomyces cerevisiae（酵母）到人类的进化过程中高度保守，因此酵母是研究 NL 代谢酶功能与调控机制的有用模式生物。尽管关于乙酰辅酶A如何转化为多种 NL 分子的过程已有较多了解，但调控 NL 代谢酶的机制以及调控异常如何导致细胞病理变化的研究仍在持续进行中。数十年来，研究人员已开发并使用了多种用于分离和表征 NL 分子的方法；然而，尚缺乏对主要 NL 分子进行全面表征的定量且简便的实验方案。本文介绍了一种简单且可灵活调整的方法，用于定量酵母中主要 NL 分子的从头 合成过程。我们采用14C-乙酸代谢标记结合薄层色谱技术，分离并定量一系列具有重要生理功能的中性脂质。此外，该方法还可简便地用于研究 NL 酶在体内的反应速率或 NL 分子随时间的降解情况。
引言
乙酰辅酶A是多种生物分子的基本组成单元，包括中性脂质（NLs），后者作为多功能的生物分子“货币”，可用于构建细胞膜、生成ATP以及调控细胞信号传导1,2。NLs能否被分配至上述特定代谢通路，在一定程度上受其储存状态的调控。脂滴（LDs）是存在于细胞质中的细胞器，其核心由甘油三酯（TGs）和甾醇酯（SEs）等疏水性脂质构成，是大多数细胞内中性脂质的主要储存场所。因此，脂滴能够隔离并调控中性脂质，这些脂质可在需要时被降解并用于各种生化与代谢过程3,4。已知中性脂质及相关蛋白的异常调控与多种病理状态的发生相关，包括脂肪营养不良和代谢综合征5,6。正因如此，当前脂滴研究的重点集中在多细胞生物不同组织中，中性脂质合成在空间、时间和组织特异性上的调控机制。由于中性脂质在各类细胞中具有普遍而重要的功能，参与其合成与调控的许多酶在真核生物中高度保守7。事实上，某些原核生物也能在脂滴中储存中性脂质8。因此，遗传操作便捷的模式生物，如Saccharomyces cerevisiae（芽殖酵母....
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方案
1. 用14C-乙酸标记酵母细胞的培养与标记
- 接种酵母培养物时，从平板上挑取单菌落，并将其接种至含有2%葡萄糖的20 mL合成完全（SC）培养基中（参见 补充文件 （有关SC培养基的配方，请参见相关说明）。在30 ˚C、200 rpm条件下振荡培养过夜。
注意：生长条件、样品体积和处理方式将根据目标脂质的不同而有所差异。在开展完整实验之前，应通过实验确定最佳生长条件和培养体积。本方案讨论了对处于静止期的酵母培养物进行放射性标记，静止期是生物膜和细胞生长减缓而中性脂质（NL）合成非常活跃的生长阶段。 - 测量OD600 使用分光光度计测定过夜培养物的OD值，并将酵母细胞培养物稀释至最终OD600 在含有2%葡萄糖的50 mL新鲜SC培养基中，将细胞接种至初始OD600为0.2。培养细胞24小时，或直至其进入稳定期（通常以细胞增殖的OD值不再增加作为判断标准）。600 测量）。
- 在收集细胞前，配制淬灭缓冲液（参见 补充文件 详细信息见正文）。为每个样品制备两份20 mL的淬灭缓冲液（即每个样品共需40 mL），平均分装至两个50 mL锥形管中。将分装好的淬灭缓冲液于-80 °C保存，以备后续使用。
- 当培养物达到预期的OD值或生长阶段后，以4,100 x g离心收集细胞 g....
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结果
在本实验方案中，我们证明了可通过14C-乙酸代谢标记实现中性脂（NL）种类的标记、检测与定量。主要的中性脂种类可在体积比为50:40:10:1（v/v/v/v%）的正己烷：石油醚：乙醚：乙酸溶剂体系中实现分离（图1A，B）。磷屏成像技术可用于可视化标记的游离脂肪酸（FFA）、三酰甘油（TG）、二酰甘油（DG）、胆固醇（Chol）以及角鲨烯（SQ）（图1A）。尽管固醇酯（SE）可在该溶剂系统中与其他中性脂种类分离，但在20分钟脉冲标记后，放射自显影图中未检测到任何SE信号。这可能是由于酵母在静止生长期中固醇酯合成速度较慢所致。此外，本方法还可用于分离纯化的脂质种类，并通过在薄层层析板上喷洒对茴香醛试剂实现可视化（图1B）。尽管该溶剂系统可有效分离中性脂种类，但磷脂酰胆碱（PC）等极性脂质仍停留在点样原点（图1B）。通过在脉冲标记后转入不含放射性标记.......
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讨论
本文介绍了一种通用的放射性标记方案，可用于定量监测酵母中中性脂质（NL）的合成。该方案具有高度模块化特点，可在3至6天内完成。此外，已有大量文献报道了利用薄层色谱法（TLC）分离脂质种类及代谢物的方法，使用者只需简单更换TLC溶剂系统，即可检测多种感兴趣的脂质种类16,19。本方案适用于放射性标记脂质的分离、检测与定量分析，还可结合在非标记培养基中进行追踪（chase）实验，以测定标记NL的周转时间。总体而言，该实验流程为开展NL种类的放射性标记研究提供了实用的技术框架。
其他方法，如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS），可实现更高分辨率的脂质分离与定量；然而，通常不建议将放射性标记样品直接用于质谱分析，尽管使用稳定同位素可在一定程度上克服这一问题。尽管如此，本放射性标记方法对多种脂质种类仍具有高检测灵敏度和广泛适用性。与质谱法相比，本实验方案的另一优势在于成本较低。薄层色谱（TLC）分离脂质操作相对.......
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披露
作者声明在准备本稿件时不存在任何竞争利益。
致谢
作者感谢Henne实验室成员在完成本研究过程中提供的帮助和概念性建议。W.M.H. 的研究得到了威尔奇基金会（I-1873）、美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH NIGMS，GM119768）、阿拉·帕雷吉安医学研究基金以及德克萨斯大学西南医学中心冠名学者计划的资金支持。S.R. 获得了T32培训项目资助（5T32GM008297）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| [1-C14]乙酸钠盐比活度：45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2-二油酰基-sn-甘油 | Avanti | 800811O | |
| 200 proof 绝对乙醇 | Sigma | 459836 | |
| 酸洗玻璃珠 425-600μm | Sigma | G8772 | |
| 用于巴斯德移液管的琥珀色 bulbs | Fisher | 03-448-24 | |
| 硫酸铵 >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 液闪仪 | PerkinElmer | A481000 | |
| 氯仿（HPLC 级） | Fisher | C607SK | |
| 胆固醇 >99% | Sigma | C8667 | |
| 胆固醇-亚油酸酯 >98% | Sigma | C0289 | |
| 浓硫酸 | Sigma | 339741 | |
| Corning 50 mL 圆锥形离心管，聚丙烯材质，带 centristar 盖 | Sigma | CLS430829 | |
| 葡萄糖，无水级 | Sigma | D9434 | |
| 无水乙醚 | Sigma | 296082 | |
| 干燥烘箱 | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume 液闪液 | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R 离心机 | Fisher | 05-401-205 | |
| GE 储磷屏 | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 成像仪 | |||
| 冰乙酸，ACS 级 | Sigma | 695092 | |
| 6 mL 玻璃液闪瓶 | Sigma | M1901 | |
| 玻璃离心管盖 | Fisher | 14-595-36A | |
| 玻璃离心管 | Fisher | 14-595-35A | |
| 玻璃巴斯德移液管 | Fisher | 13-678-20C | |
| 己烷，无水级 | Sigma | 296090 | |
| L-腺嘌呤 >99% | Sigma | A8626 | |
| L-丙氨酸 >98% | Sigma | A7627 | |
| L-精氨酸 >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-天冬酰胺 >98% | Sigma | A0884 | |
| L-天冬氨酸 >98% | Sigma | A9256 | |
| L-半胱氨酸 >97% | Sigma | W326305 | |
| L-谷氨酸单钠盐一水合物 >98% | Sigma | 49621 | |
| L-谷氨酰胺 >99% | Sigma | G3126 | |
| L-甘氨酸 >99% | Sigma | G8898 | |
| L-组氨酸 >99% | Sigma | H8000 | |
| L-异亮氨酸 >98% | Sigma | I2752 | |
| L-亮氨酸 >98% | Sigma | L8000 | |
| L-赖氨酸 >98% | Sigma | L5501 | |
| L-甲硫氨酸，HPLC 级 | Sigma | M9625 | |
| L-苯丙氨酸，试剂级 | Sigma | P2126 | |
| L-脯氨酸 >99% | Sigma | P0380 | |
| L-丝氨酸 >99% | Sigma | S4500 | |
| L-苏氨酸，试剂级 | Sigma | T8625 | |
| L-色氨酸 >98% | Sigma | T0254 | |
| L-酪氨酸 >98% | Sigma | T3754 | |
| L-尿嘧啶 >99% | Sigma | U0750 | |
| L-缬氨酸 >98% | Sigma | V0500 | |
| 甲醇，ACS 级 | Fisher | A412 | |
| 油酸 >99% | Sigma | O1008 | |
| 对-茴香醛 | Sigma | A88107 | |
| 石油醚，ACS 级 | Sigma | 184519 | |
| 磷脂酰胆碱，二棕榈酰 >99% | Sigma | P1652 | |
| 移液器 | Eppendorf | 2231000713 | |
| 氯化钾，ACS 级 | Sigma | P3911 | |
| 氢氧化钠颗粒，经认证 ACS 级 | Fisher | S318-100 | |
| 角鲨烯 >98% | Sigma | S3626 | |
| 琥珀酸，结晶/认证级 | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC 饱和垫 | Sigma | Z265225 | |
| TLC 硅胶 60G 玻璃带槽板 | Fisher | NC9825743 | 无荧光指示剂 |
| 透明塑料薄膜 | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| 三油酸甘油酯 >99% | Sigma | T7140 | |
| 涡旋混合器 | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman 曝光盒 | Sigma | WHA29175523 | |
| 酵母氮源基础培养基（不含硫酸铵和氨基酸） | Sigma | Y1251 |
参考文献
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L.
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重印与许可
