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方法文章

中性脂质合成分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 通过代谢标记和薄层色谱法

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DOI：

10.3791/62201

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2021年2月2日

 , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用14C-乙酸对酵母进行代谢标记的实验方案，并结合薄层色谱法分离中性脂质。

摘要

中性脂质（NLs）是一类疏水、不带电荷的生物分子，在能量和脂质稳态中发挥关键作用。NLs 从乙酰辅酶A从头合成 ，在真核生物中主要以甘油三酯（TGs）和甾醇酯（SEs）的形式存在。负责 NLs 合成的酶在从Saccharomyces cerevisiae（酵母）到人类的进化过程中高度保守，因此酵母是研究 NL 代谢酶功能与调控机制的有用模式生物。尽管关于乙酰辅酶A如何转化为多种 NL 分子的过程已有较多了解，但调控 NL 代谢酶的机制以及调控异常如何导致细胞病理变化的研究仍在持续进行中。数十年来，研究人员已开发并使用了多种用于分离和表征 NL 分子的方法；然而，尚缺乏对主要 NL 分子进行全面表征的定量且简便的实验方案。本文介绍了一种简单且可灵活调整的方法，用于定量酵母中主要 NL 分子的从头 合成过程。我们采用14C-乙酸代谢标记结合薄层色谱技术，分离并定量一系列具有重要生理功能的中性脂质。此外，该方法还可简便地用于研究 NL 酶在体内的反应速率或 NL 分子随时间的降解情况。

引言

乙酰辅酶A是多种生物分子的基本组成单元，包括中性脂质（NLs），后者作为多功能的生物分子“货币”，可用于构建细胞膜、生成ATP以及调控细胞信号传导1,2。NLs能否被分配至上述特定代谢通路，在一定程度上受其储存状态的调控。脂滴（LDs）是存在于细胞质中的细胞器，其核心由甘油三酯（TGs）和甾醇酯（SEs）等疏水性脂质构成，是大多数细胞内中性脂质的主要储存场所。因此，脂滴能够隔离并调控中性脂质，这些脂质可在需要时被降解并用于各种生化与代谢过程3,4。已知中性脂质及相关蛋白的异常调控与多种病理状态的发生相关，包括脂肪营养不良和代谢综合征5,6。正因如此，当前脂滴研究的重点集中在多细胞生物不同组织中，中性脂质合成在空间、时间和组织特异性上的调控机制。由于中性脂质在各类细胞中具有普遍而重要的功能，参与其合成与调控的许多酶在真核生物中高度保守7。事实上，某些原核生物也能在脂滴中储存中性脂质8。因此，遗传操作便捷的模式生物，如Saccharomyces cerevisiae（芽殖酵母），已被广泛用于中性脂质合成与调控的研究。

从细胞提取物中分离和定量中性脂质（NLs）的方法多种多样，包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱（HPLC）以及超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）9,10,11。其中最简单的方法之一是薄层色谱（TLC），该方法可通过标准曲线实现后续的光密度定量12,13。尽管TLC对NLs的分离分辨率有限，但它仍是一种强大的技术，因其成本低廉，并可同时快速分离多个样品中的NLs。通过TLC研究NLs面临的两个主要挑战是：1）不同NL种类及其代谢中间体在细胞内的丰度差异极大；2）NL合成通路中脂质中间体的亲水性/疏水性范围广泛。因此，TLC通常仅用于定量最丰富的NL种类；然而，引入14C-乙酸放射性标记可显著增强对NL通路中低丰度中间体的检测。乙酸在乙酰辅酶A合成酶ACS2的作用下可迅速转化为乙酰辅酶A14，这使得14C-乙酸成为酵母中一种合适的放射性标记底物15。此外，通过使用多种溶剂系统，TLC还可实现疏水性NLs与亲水性中间体的同时分离16。本文介绍了一种在酵母中利用14C-乙酸进行代谢标记以分离NLs的方法。脉冲标记期间被标记的脂质随后通过成熟的总脂质提取方案进行分离17，再经TLC实现NL种类的分离。通过放射自显影技术显影标记的脂质，同时结合化学喷雾法显影总脂质，可实现多种定量方式。此外，还可使用刀片从TLC板上轻松刮取各脂质条带，并通过液体闪烁计数法测定条带内放射性标记物质的含量。

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方案

1. 用14C-乙酸标记酵母细胞的培养与标记

  1. 接种酵母培养物时，从平板上挑取单菌落，并将其接种至含有2%葡萄糖的20 mL合成完全（SC）培养基中（参见 补充文件 （有关SC培养基的配方，请参见相关说明）。在30 ˚C、200 rpm条件下振荡培养过夜。
    注意：生长条件、样品体积和处理方式将根据目标脂质的不同而有所差异。在开展完整实验之前，应通过实验确定最佳生长条件和培养体积。本方案讨论了对处于静止期的酵母培养物进行放射性标记，静止期是生物膜和细胞生长减缓而中性脂质（NL）合成非常活跃的生长阶段。
  2. 测量OD600 使用分光光度计测定过夜培养物的OD值，并将酵母细胞培养物稀释至最终OD600 在含有2%葡萄糖的50 mL新鲜SC培养基中，将细胞接种至初始OD600为0.2。培养细胞24小时，或直至其进入稳定期（通常以细胞增殖的OD值不再增加作为判断标准）。600 测量）。
  3. 在收集细胞前，配制淬灭缓冲液（参见 补充文件 详细信息见正文）。为每个样品制备两份20 mL的淬灭缓冲液（即每个样品共需40 mL），平均分装至两个50 mL锥形管中。将分装好的淬灭缓冲液于-80 °C保存，以备后续使用。
  4. 当培养物达到预期的OD值或生长阶段后，以4,100 x g离心收集细胞 g 10 分钟。在样品离心期间，通过向培养基中加入 [1-14将C]乙酸钠以10 μCi/mL的终浓度加入无葡萄糖SC培养基中。
    注意：操作放射性物质时，必须始终穿戴适当的个人防护装备（PPE）。务必遵守当地关于放射性物质的储存、使用和处置的指导规范。
    注意：两种浓度均 14标记培养基中的C-乙酸以及放射性标记孵育时间应根据目标代谢物进行调整。此处采用20分钟的放射性标记脉冲孵育，足以对丰度不同的NL分子种类进行标记。
  5. 去除上清液，用 20 mL 无葡萄糖 SC 培养基重悬细胞沉淀，通过移液器吹打混匀，洗涤一次。再次在 4,100 x g 5 分钟。
  6. 将细胞重悬于 1 mL 无葡萄糖 SC 培养基中，并转移至已标记的 2 mL 微离心管中。在 4,100 x g 2 分钟。
  7. 再次将细胞重悬于 500 μL 无葡萄糖 SC 培养基中。预先将可容纳 50 mL 锥形管的离心机冷却至 -10 °C 或最低温度设置。
  8. 通过快速向每500 μL细胞悬液中加入500 μL放射性标记培养基（终体积）开始放射性标记阶段 14C-乙酸浓度 = 5 μCi/mL）。将试管置于30 °C旋转孵育器中孵育20 min。在标记期结束前2 min，从-80 °C冰箱中取出每份样品的20 mL淬灭缓冲液，转移至冰桶中
  9. 放射标记阶段结束后，用移液器将全部1 mL样品迅速注入20 mL预冷的淬灭缓冲液中。涡旋混匀锥形管5–10秒，确保样品与淬灭缓冲液充分混合。将样品置于冰上，在淬灭缓冲液中孵育2分钟。
  10. 通过在离心机中以 5,000 x g 离心收集细胞沉淀 g 3 分钟，设置温度为 -10 °C 或最低温设置。在样品管离心的同时，将另一份淬灭缓冲液分装液从 -80 °C 冰箱转移至装有冰的容器中（即每个样品对应一支 20 mL 淬灭缓冲液管）。
  11. 从细胞沉淀中移除淬灭缓冲液上清，加入 20 mL 新鲜的冷淬灭缓冲液。涡旋并振荡样品，直至沉淀物从锥形管底部完全脱离并充分重悬于淬灭缓冲液中。再次以 5,000 x g 在 -10 °C 下离心 3 分钟以收集细胞。
  12. 细胞沉淀后，倾倒上清液，并用移液器彻底去除残留的淬灭缓冲液。将样品管置于 -80 °C 保存，以备后续处理。

2. 从酵母中分离总脂质

注意：以下脂质分离方案基于一种成熟且常用的方法，可高效提取大多数中性脂质种类17,18。
警告：使用有机溶剂时，务必穿戴适当的个人防护装备，并尽可能在通风橱内操作。在脂质提取过程中，避免使用与有机溶剂不兼容的塑料制品。聚丙烯管适用于本方案。

  1. 每个样品称取 0.3 g 酸洗玻璃珠，置于冰上保存于 2 mL 微量离心管中。从 -80 °C 冰箱中取出细胞沉淀，并保持在冰上。向每个样品中加入 350 μL 甲醇和 700 μL 氯仿，重悬后转移至含有预称重玻璃珠的微量离心管中。
  2. 通过涡旋振荡器剧烈震荡裂解细胞，每次 1 分钟，共 3 次，每次之间在冰上孵育 30 秒。或者，也可使用微型珠磨仪进行细胞裂解，运行三个 1 分钟的循环。另取 25–30 μL 全细胞裂解液保存于单独的离心管中，用于闪烁计数。
    注意：所保存的裂解液将用于确定每个样品在脉冲标记期间摄取的放射性同位素相对量，该数值将影响后续点样至薄层色谱板的样品量。此步骤将在 3.2 步骤中进一步说明。
  3. 将 2 mL 微量离心管中的全部内容物转移至 15 mL 玻璃离心管 [管 A] 中。用 1 mL 甲醇冲洗 2 mL 微量离心管，涡旋 10–15 秒，将冲洗液转移至管 A，然后向管 A 中加入 2 mL 氯仿，再加入 400 μL 水，最终样品体积为 4.45 mL。
  4. 涡旋样品 1 分钟，随后在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。离心后，水相（上层）和有机相（下层）应明显分层，细胞碎片位于两相界面处。
  5. 使用玻璃巴斯德吸管收集管 A 中的有机相，转移至新的 15 mL 玻璃离心管（管 B）。向管 B 中加入 1 mL 1 M KCl。向管 A 中加入 1 mL 甲醇、2 mL 氯仿和 200 μL MiliQ 水。重复对管 A 进行涡旋和离心操作。
  6. 再次收集管 A 中的有机相，并加入至管 B 中。将管 A 置于适当的废液容器中丢弃。涡旋管 B 1 分钟，随后在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。
  7. 移除管 B 中的上层水相并弃去。向管 B 中重新加入 1 mL 新鲜的 1 M KCl，重复涡旋/离心步骤。待两相分层后，小心收集全部下层有机相至已标记的 4 mL 玻璃小瓶中。
    注意：此步骤中，脂质提取物可于 -80 °C 保存，或继续进行薄层色谱法分离脂质。

3. 通过薄层色谱法分离和定量放射性同位素标记的中性脂质

  1. 如果脂质提取物曾置于 -80 °C 条件下，需先将其在冰上缓慢恢复至室温，随后转移至实验台。通过真空干燥或使用惰性气体（如氩气或氮气）的温和气流彻底蒸发脂质提取物中的溶剂。同时，将烘箱预热至 145 °C，用于加热薄层色谱（TLC）板。
  2. 在将样品上样至 TLC 板之前，需确定细胞摄取的放射性标记物的相对量。从步骤 2.2 中取 10 μL 全细胞裂解液，加入 6 mL 玻璃闪烁瓶中，再加入 6 mL 闪烁液，并将闪烁瓶放入样品架中。使用闪烁计数器，选择单架计数模式并设置计数时间为 1 分钟，测定每个样品的每分钟计数（cpm）或每分钟衰变数（dpm）。每个全细胞裂解液样品需进行双份测定，以获得每个样本的平均值。根据野生型或参照样本调整上样量。
    注意：可通过以下公式确定上样至 TLC 板的各样品体积：（样品平均计数）/（参照样本平均计数）× 目标上样体积。例如，若参照样本目标上样体积为 20 μL，其平均计数为 1,000，则实验样本若平均计数为 2,000，则应上样 10 μL。
  3. 通过涡旋振荡 5 分钟，将样品脂质重新溶解于 40–50 μL 的氯仿:甲醇（1:1, v/v%）溶液中。在玻璃量筒中配制 101 mL 流动相溶剂（参见代表性结果部分，了解使用 50:40:10:1 (v/v/v/v%) 正己烷:石油醚:乙醚:乙酸溶剂分离主要中性脂质（NL）种类的示例）。
  4. 将溶剂倒入含有 20 × 20 TLC 饱和垫和密封盖的玻璃 TLC 展开槽中。用铅笔在 20 × 20 硅胶 60 G 板底部上方 1.5 cm 处轻轻划一条线，以制备带通道的 TLC 板。该线标记为原点，即脂质上样位置。在该线下方，用铅笔标注每条泳道将要上样的样品名称。TLC 板准备完毕后，将其置于 145 °C 烘箱中至少孵育 30 分钟，以预热板并去除多余水分。
  5. 当 TLC 板充分加热且 TLC 饱和垫已被溶剂饱和后，立即从烘箱中取出 TLC 板并开始上样。在板仍温热时上样可确保溶剂迅速蒸发。针对每种目标脂质，将 5–20 μg 纯化的脂质标准品上样至 TLC 板的一条泳道，以追踪分离效果和预期迁移距离。使用移液器将 5 μL 样品点样至 TLC 板底部上方 1.5 cm 处的原点位置。重复点样 5 μL 样品，直至每条泳道累计上样量达到 20–40 μL。
    注意：可在每个样品泳道中加入 5–20 μg 未标记的纯化脂质作为示踪剂，以便在脂质 TLC 分离后通过染色显影进行观察。染色标准品的存在有助于快速识别和切取放射性标记的脂质条带，用于后续闪烁计数。所选用的纯化标准品应根据目标中性脂质（NL）种类确定。参见代表性结果 部分，了解在样品泳道旁分离油酸（FFA）、1,2-二油酰甘油（DG）、三油酸甘油酯（TG）、胆固醇（Chol）、胆固醇亚油酸酯（SE）和角鲨烯的示例。
  6. 在标准品和实验样品上样完成后，将 TLC 板放入展开槽中，等待溶剂迁移至板的顶端（40–60 分钟）。当板完全展开后，将其从展开槽中取出，并在通风橱中干燥 20 分钟。
  7. 板干燥后，用塑料薄膜覆盖，并放入含有放射自显影屏的显影盒中。使 TLC 板与屏幕共同曝光 24–48 小时。

4. TLC 分离脂质的可视化与定量

  1. 从显影暗盒中取出成像板，放入磷屏成像仪中。选择“磷屏成像”（Phosphor Imaging）选项，并在800–1000 V条件下进行成像。
    注意：磷屏成像可对薄层色谱板上的放射性标记脂质提供定性观察。然而，对放射性标记脂质的定量分析最好采用液闪计数法，具体方法如下所述。
  2. 取100 mL对茴香醛试剂（见补充文件），置于玻璃喷雾瓶中。将对茴香醛试剂均匀喷洒在薄层色谱板上，直至硅胶层完全润湿。将板放入145 °C烘箱中加热5分钟，或直至条带显现。
  3. 若需通过放射性标记液闪计数定量分析各脂质组分，可用刀片将玻璃薄层板上的硅胶小心刮下。将每条对应单一放射性标记脂质组分的硅胶条带分别转移至玻璃液闪瓶中，加入6 mL液闪液。剧烈涡旋震荡，直至硅胶条带破碎成细小颗粒。
    1. alternatively，可按照第3节中的脂质提取方案从硅胶条带上提取脂质。若采用此方法，则在3.1步骤中将溶剂完全蒸发后，向干燥的脂质样品中加入6 mL液闪液。将装有液闪瓶的样品架放入液闪计数器中，选择“单架计数”（Count single rack）选项，并将每瓶的计数时间设定为2分钟。液闪计数器将打印结果，数据可用柱状图形式展示。

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结果

在本实验方案中，我们证明了可通过14C-乙酸代谢标记实现中性脂（NL）种类的标记、检测与定量。主要的中性脂种类可在体积比为50:40:10:1（v/v/v/v%）的正己烷：石油醚：乙醚：乙酸溶剂体系中实现分离（图1A，B）。磷屏成像技术可用于可视化标记的游离脂肪酸（FFA）、三酰甘油（TG）、二酰甘油（DG）、胆固醇（Chol）以及角鲨烯（SQ）（图1A）。尽管固醇酯（SE）可在该溶剂系统中与其他中性脂种类分离，但在20分钟脉冲标记后，放射自显影图中未检测到任何SE信号。这可能是由于酵母在静止生长期中固醇酯合成速度较慢所致。此外，本方法还可用于分离纯化的脂质种类，并通过在薄层层析板上喷洒对茴香醛试剂实现可视化（图1B）。尽管该溶剂系统可有效分离中性脂种类，但磷脂酰胆碱（PC）等极性脂质仍停留在点样原点（图1B）。通过在脉冲标记后转入不含放射性标记...

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讨论

本文介绍了一种通用的放射性标记方案，可用于定量监测酵母中中性脂质（NL）的合成。该方案具有高度模块化特点，可在3至6天内完成。此外，已有大量文献报道了利用薄层色谱法（TLC）分离脂质种类及代谢物的方法，使用者只需简单更换TLC溶剂系统，即可检测多种感兴趣的脂质种类16,19。本方案适用于放射性标记脂质的分离、检测与定量分析，还可结合在非标记培养基中进行追踪（chase）实验，以测定标记NL的周转时间。总体而言，该实验流程为开展NL种类的放射性标记研究提供了实用的技术框架。

其他方法，如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS），可实现更高分辨率的脂质分离与定量；然而，通常不建议将放射性标记样品直接用于质谱分析，尽管使用稳定同位素可在一定程度上克服这一问题。尽管如此，本放射性标记方法对多种脂质种类仍具有高检测灵敏度和广泛适用性。与质谱法相比，本实验方案的另一优势在于成本较低。薄层色谱（TLC）分离脂质操作相对...

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披露

作者声明在准备本稿件时不存在任何竞争利益。

致谢

作者感谢Henne实验室成员在完成本研究过程中提供的帮助和概念性建议。W.M.H. 的研究得到了威尔奇基金会（I-1873）、美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH NIGMS，GM119768）、阿拉·帕雷吉安医学研究基金以及德克萨斯大学西南医学中心冠名学者计划的资金支持。S.R. 获得了T32培训项目资助（5T32GM008297）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[1-C14]乙酸钠盐比活度：45-60mCiPerkinElmerNEC084H001MC
18:1 1,2-二油酰基-sn-甘油Avanti800811O
200 proof 绝对乙醇Sigma459836
酸洗玻璃珠 425-600μmSigmaG8772
用于巴斯德移液管的琥珀色 bulbsFisher03-448-24
硫酸铵 >99%SigmaA4418
Beckman LS6500 液闪仪PerkinElmerA481000
氯仿（HPLC 级）FisherC607SK
胆固醇 >99%SigmaC8667
胆固醇-亚油酸酯 >98%SigmaC0289
浓硫酸Sigma339741
Corning 50 mL 圆锥形离心管，聚丙烯材质，带 centristar 盖SigmaCLS430829
葡萄糖，无水级SigmaD9434
无水乙醚Sigma296082
干燥烘箱Fisher11-475-155
EcoLume 液闪液VWRIC88247001
Eppendorf 5424R 离心机Fisher05-401-205
GE 储磷屏SigmaGE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 成像仪
冰乙酸，ACS 级Sigma695092
6 mL 玻璃液闪瓶SigmaM1901
玻璃离心管盖Fisher14-595-36A
玻璃离心管Fisher14-595-35A
玻璃巴斯德移液管Fisher13-678-20C
己烷，无水级Sigma296090
L-腺嘌呤 >99%SigmaA8626
L-丙氨酸 >98%SigmaA7627
L-精氨酸 >99%SigmaA1270000
L-天冬酰胺 >98%SigmaA0884
L-天冬氨酸 >98%SigmaA9256
L-半胱氨酸 >97%SigmaW326305
L-谷氨酸单钠盐一水合物 >98%Sigma49621
L-谷氨酰胺 >99%SigmaG3126
L-甘氨酸 >99%SigmaG8898
L-组氨酸 >99%SigmaH8000
L-异亮氨酸 >98%SigmaI2752
L-亮氨酸 >98%SigmaL8000
L-赖氨酸 >98%SigmaL5501
L-甲硫氨酸，HPLC 级SigmaM9625
L-苯丙氨酸，试剂级SigmaP2126
L-脯氨酸 >99%SigmaP0380
L-丝氨酸 >99%SigmaS4500
L-苏氨酸，试剂级SigmaT8625
L-色氨酸 >98%SigmaT0254
L-酪氨酸 >98%SigmaT3754
L-尿嘧啶 >99%SigmaU0750
L-缬氨酸 >98%SigmaV0500
甲醇，ACS 级FisherA412
油酸 >99%SigmaO1008
对-茴香醛SigmaA88107
石油醚，ACS 级Sigma184519
磷脂酰胆碱，二棕榈酰 >99%SigmaP1652
移液器Eppendorf2231000713
氯化钾，ACS 级SigmaP3911
氢氧化钠颗粒，经认证 ACS 级FisherS318-100
角鲨烯 >98%SigmaS3626
琥珀酸，结晶/认证级Fisher110-15-6
TLC 饱和垫SigmaZ265225
TLC 硅胶 60G 玻璃带槽板FisherNC9825743无荧光指示剂
透明塑料薄膜Apollo829903
TricineSigmaT0377
三油酸甘油酯 >99%SigmaT7140
涡旋混合器Fisher02-215-414
Whatman 曝光盒SigmaWHA29175523
酵母氮源基础培养基（不含硫酸铵和氨基酸）SigmaY1251

参考文献

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脂质提取放射性标记技术甘油三酯定量甾醇酯分析磷屏成像闪烁计数
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