由预成型微泡制备膜过滤相变十氟丁烷纳米液滴

摘要

本方案描述了一种利用探头式超声法生成大量脂质包裹的全氟丁烷微泡，并通过高压挤出和机械过滤将其进一步冷凝为相变纳米液滴的方法。

摘要

有多种方法可用于制备适用于成像和治疗的可汽化相变液滴。每种方法采用的技术不同，在价格、材料和用途方面也各不相同。许多这些制备方法会产生粒径分布不均的液滴群体，其激活阈值不一致。此外，控制液滴尺寸通常需要使用高激活阈值的稳定全氟碳液体，而这类液体在体内应用中并不实用。使用低沸点气体生成尺寸均一的液滴，将有利于体内的成像和治疗实验。本文介绍一种简单且经济的方法，用于制备经尺寸筛选、脂质稳定的低沸点十氟丁烷（DFB）相变纳米液滴。文中描述了一种常见的脂质微泡制备方法，以及一种通过高压挤出在单一步骤内将其冷凝的新颖方法。该方法旨在节省时间、提高效率，并利用许多生物实验室常见的常规实验设备，制备出适用于多种应用的大体积微泡和纳米液滴溶液。

引言

超声造影剂（UCAs）在成像和治疗应用中正迅速普及。微泡作为最初的超声造影剂，目前是临床诊断应用中的主流试剂。微泡是充满气体的球形结构，直径通常为1-10 µm，外层由脂质、蛋白质或聚合物壳包裹¹。然而，其尺寸和体内稳定性可能在许多应用中限制其功能。相变纳米液滴含有过热液体核心，因其更小的尺寸和更长的循环寿命，可在一定程度上克服这些限制²。当受到热或声能刺激时，过热液体核心会汽化形成气体微泡^2,3,4,5。由于汽化阈值与液滴尺寸直接相关^5,6，制备尺寸均一的液滴悬浮液将有利于实现一致的激活阈值，因此具有重要意义。能够产生均一液滴尺寸的制备方法通常复杂且成本较高，而更具成本效益的方法往往产生多分散性的溶液⁷。另一个限制在于能否稳定生成含有低沸点全氟碳（PFC）气体的相变液滴，这对于体内高效激活至关重要⁸。本文描述了一种用于生成稳定的、经过滤的低沸点可汽化相变液滴的实验方案，适用于体内成像和治疗应用。

制备单分散亚微米相变液滴的方法有多种⁷。其中一种最可靠的尺寸控制方法是使用微流控装置。然而，这类装置成本较高，液滴生成速率较慢（约~10⁴-10⁶ 个/秒）⁷，且需要经过大量培训才能操作。微流控装置通常还需使用高沸点气体，以避免发生自发汽化并导致系统堵塞⁷。然而，de Gracia Lux 等人最近的一项研究⁹表明，通过冷却微流化器，可利用低沸点的十氟丁烷（DFB）或八氟丙烷（OFP）生成高浓度的亚微米相变液滴（10¹⁰-10¹²/mL）。

通常，对于低沸点气体（如 DFB 或 OFP），使用预先形成的气泡进行操作更为简便。可通过低温和加压使气体冷凝，从而从脂质稳定的前体气泡制备出可汽化的液滴^5,10。采用该方法制备的液滴浓度取决于前体微泡的浓度以及气泡向液滴转化的效率。已有研究报道，通过探头超声法可获得浓度接近 > 10¹⁰ MB/mL 的高浓度微泡¹¹，而另一项研究则报道了由冷凝的 OFP 和 DFP 气泡所得到的液滴浓度范围约为 ~1–3 × 10¹¹ 个液滴/mL¹²。当无需关注单分散液滴时，冷凝法是利用低沸点全氟碳化合物（PFC）制备脂质稳定的相变液滴最直接且成本最低的方法。在冷凝前先制备均一尺寸的气泡，有助于获得单分散性更高的液滴群体。然而，制备单分散的前体气泡本身也存在困难，需要采用微流控或多次差速离心等成本较高的技术¹¹。最近，已有研究报道了一种通过脂质体中液滴的自发成核来制备 DFB 和 OFB 纳米液滴的新方法¹³。该方法利用“Ouzo 效应”，无需气泡冷凝即可简便地生成低沸点 PFC 液滴。通过精确滴定并混合用于引发液滴成核的 PFC、脂质和乙醇组分，可调控 PFC 液滴的粒径分布。还需注意的是，可通过混合不同全氟碳化合物来调节纳米液滴的稳定性和激活阈值^14,15。Shakya 等人近期的研究进一步表明，可通过在烃类内骨架中乳化高沸点 PFC，促进液滴核心内的异相成核，从而调节纳米液滴的激活特性¹⁶，这一策略可与其他形式的液滴尺寸筛选方法结合使用。

一旦形成，相变液滴可在生成后通过挤出处理以获得单分散性更高的液滴群体。事实上，Kopechek 等人此前已发表过与此类似的方法¹⁷，该方法采用高沸点的十二氟戊烷（DDFP）作为液滴核心。若读者希望使用高沸点全氟碳化合物（在室温下稳定）制备相变液滴，应参考上述文献。而使用低沸点气体（如 DFB 和 OFP）生成并挤出液滴的过程更为复杂，最佳策略是通过冷凝预先形成的气泡来实现。

本方案描述了一种使用探头式超声法生成具有DFB气体核心的预制脂质微泡的常用方法。随后，利用商用挤出器将预制微泡压缩为亚微米级相变纳米液滴（图1）。所获得的液滴可被热和超声激活。该方法相比传统压缩方法，可在无需昂贵微流控设备的情况下，制备出体积更大、粒径分布更窄的纳米液滴溶液。制备粒径分布较窄的纳米液滴溶液，可能产生更均一的汽化阈值，从而最大限度地提升其在成像、消融、药物递送和栓塞等多种应用中的潜力^1,3,4,6。

图 1：通过高压挤出装置将预制微泡压缩为相变纳米液滴的示意图。 将微泡溶液加入并置于挤出室中，来自氮气罐的 250 psi 压力通过室入口阀施加。氮气将推动微泡溶液穿过室底部的滤膜，使样品压缩为纳米液滴。最终，溶液通过样品出口管被推出挤出器并收集。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 制备脂质膜

1. 使用90% DSPC和10% DSPE-PEG2K制备用于微泡生成的脂膜，按以下步骤以正确比例混合脂质：
   1. 将DSPC和DSPE-PEG2K溶于氯仿中配制储备液。分别称取50 mg脂质粉末置于不同的样品瓶中，使用1 mL玻璃注射器向每个样品瓶中加入1 mL氯仿。
   2. 使用玻璃注射器将287 µL DSPC储备液和113 µL DSPE-PEG2K储备液（均为50 mg/mL）加入20 mL闪烁瓶中。
   3. 通入氮气干燥混合脂质以去除氯仿。将连接至实验室氮气源的适当长度的管路插入瓶口上方，轻轻向瓶内顶空通入氮气，同时进行混合。持续操作直至观察不到氯仿残留，剩余脂膜开始变为白色。使用聚丙烯螺旋盖，在通入氮气的同时覆盖样品。
   4. 将样品瓶置于真空干燥器中过夜，以除去任何残留的氯仿。最终将留下一层覆盖瓶底的薄而半透明的脂膜。
   5. 将样品瓶于-20 °C保存，待用。

2. 从脂质膜生成微泡

1. 制备微泡时，向干燥的脂质膜中加入 10 mL 含 20% v/v 丙二醇和 20% v/v 甘油的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）（最终 pH 值为 7.2–7.4）。
2. 盖紧样品管，将样品置于加热块（或恒温水浴）中，在 65 °C 下加热 30 分钟。
3. 在样品加热的同时，将水浴超声仪的温度升至 65 °C 进行预热。
   注意：若在将水加入水浴超声仪前，先使用微波炉或电热板对水进行预加热，可加快该过程。
4. 将装有已加热样品的闪烁瓶放入水浴超声仪中，确保仅含有脂质溶液的部分浸入水浴中。
5. 对温热的脂质溶液进行超声处理，至少持续 15 分钟。确保水温保持在 65 °C。以 10–15 分钟为间隔持续超声，直至溶液完全澄清（图 2）。
   注意：若无水浴超声仪，也可使用探头式超声仪在 10% 功率下超声至溶液澄清。但微探头损耗较快，更换成本较高。

图2：水合脂质膜的示例。 水合脂质膜在水浴超声处理前（A）和处理后（B）的图像，以形成单层囊泡。经过水浴超声处理后，脂质溶液应由较浑浊的状态转变为半透明溶液。 请点击此处查看该图的高清版本。

6. 仍处于温热状态时，取下瓶盖，并将小瓶夹紧固定于超声破碎仪的隔音腔内，使超声破碎仪的微探头末端刚好浸没在气液界面下方（图3）。
7. 将十氟丁烷气罐放置在超声破碎仪的隔音腔旁。
8. 准备一个冰浴，并将其置于隔音腔旁边，供后续步骤2.14中使用。
9. 打开超声破碎仪的电源开关。
10. 系统启动后，将功率设为70%。使用微探头附件时，振幅不得超过70%。此时暂不启动超声。
11. 连接一段适当长度的导管，将DFB气罐出口的气体导入隔音腔内盛放的温热脂质溶液中。导管末端应刚好插入小瓶口部，以便在超声过程中使气体进入顶空区域（图3）。
12. 缓慢打开气罐阀门，直至可见气体流入脂质溶液上方。此时液体表面会出现轻微波纹。若气体流速过高，微泡制备过程中溶液可能溢出。
13. 启动超声破碎仪，持续运行10秒以生成微泡。若超声过程中泡液开始溢出，应立即停止超声。
14. 关闭超声破碎仪，并立即关闭DFB气罐阀门。
15. 迅速盖紧微泡溶液瓶盖，将小瓶浸入冰浴中，使样品温度迅速降至55 °C以下（DSPC的玻璃化转变温度）。
16. 将微泡样品置于冰浴中，直至后续使用。

图3：将探针尖端插入脂质溶液以优化微泡形成。 注意避免探针尖端接触玻璃。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 准备用于微泡冷凝的挤出机

1. 按照用户手册中的说明，使用制造商提供的200 nm陶瓷滤膜组装高压挤出器。
2. 将挤出器置于一个防水容器的中央，确保样品出口管未被压在侧壁上或发生弯折。
3. 使用制造商提供的接头将挤出器连接至氮气罐。
4. 在挤出器周围的防水容器中，用400 mL水和10 g氯化钠制备-2 °C的盐冰浴。
5. 将出口管末端放入闪烁计数小瓶中，以收集挤出的样品。
   ​注：若管子无法平放或固定在小瓶内，可用胶带将其固定在容器上。

4. 为微泡冷凝预处理挤出机

1. 打开并关闭释放阀，确保挤出器内部无压力。
2. 取下腔室盖，向挤出器腔室内加入 5 mL 1× PBS。
3. 重新盖上盖子，确保其牢固卡紧到位。
4. 打开氮气罐，使压力表读数为 250 psi。确保压力控制阀处于关闭位置。
5. 关闭气罐，打开挤出器腔室进气阀。PBS 溶液将被推动通过系统，从样品出口管流入闪烁瓶中。
6. 当仅有气体从管路中排出时，打开释放阀，使压力降至 0 psi。
7. 取下闪烁瓶。

5. 挤压前微泡的预冷却

1. 打开并关闭释放阀，确保挤出机内部无压力。在出口管末端放置一个新的闪烁瓶。
2. 用2-甲基丁烷填充一个钢制容器，并加入干冰，使温度降至-18 °C。
3. 将微泡溶液插入冷却的2-甲基丁烷中，使样品浸没2分钟。在2分钟内轻轻移动闪烁瓶，以轻柔混合微泡。根据需要添加干冰，维持温度在-15至-18 °C之间。注意温度不要低于-20 °C，否则辅料溶液会冻结，破坏微泡样品。
   注意：步骤5.2和5.3也可通过将微泡样品置于实验室冰箱中较长时间冷却来完成。但应谨慎操作，密切监控冰箱温度，避免样品冻结。
4. 2分钟后，将微泡从冷却的2-甲基丁烷中取出，轻轻摇动闪烁瓶以混匀微泡，并使用预冷的10 mL注射器将溶液转移至挤出机中。
5. 取下挤出机腔室盖，通过缓慢推动注射器活塞，将微泡溶液加入腔室。重新盖上挤出机盖，确保其牢固卡紧到位。
6. 确认挤出机的压力控制阀和释放阀处于关闭状态。
7. 打开氮气罐，直至压力表读数为250 psi，然后关闭气罐，并将压力控制阀转至开启位置。
8. 当溶液充满出口管末端的闪烁瓶，且仅有气体从管中排出时，缓慢打开压力释放阀，使压力逐渐降至0 psi。
9. 将闪烁瓶置于冰浴或冰箱中保存。
10. 为长期保存并减少自发汽化，可将样品存放在标准冷冻柜中。确保温度不低于-20 °C，以避免样品冻结（含20% PPG和20%甘油的辅料溶液通常可防止样品在大多数实验室冷冻柜中冻结）。

6. 通过离心分离脂质体中的液滴

1. 将10 mL乳化液滴溶液转移至15 mL离心管中。
2. 在4 °C条件下，以1,500 × g离心10分钟。离心后，管底可见由DFB纳米液滴组成的沉淀（图4）。自发汽化的液滴将浮于溶液上层，应予以弃去。

图4：离心后相变DFB液滴形成沉淀的示例。 DFB纳米液滴的密度高于脂质体，因此在离心过程中会聚集在离心管底部形成沉淀（红色框内）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 2 mL 含 20% 甘油和 20% 丙二醇的 1x PBS 中。
4. 轻轻混匀试管以获得均一溶液，并将液滴转移至较小的 2 mL 离心管中。
5. 在 2 mL 离心管中再用上述溶液洗涤样品两次。
6. 最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 100 µL 含 20% 甘油和 20% 丙二醇的 1x PBS 中，置于冰上或冷冻保存，待需要时使用。

7. 液滴汽化的显微镜验证

1. 通过将 2.5 µl 浓缩液滴加入 7.5 µl 的 1x PBS 中，制备稀释的液滴溶液。
2. 取 10 µl 稀释后的样品置于显微镜载玻片上，使用 40x 物镜观察样品并保存图像。
3. 将载玻片从显微镜上取下，放置在 65 ˚C 的加热板上 1 分钟，使纳米液滴汽化为微气泡。
4. 使用相同的 40x 物镜观察加热后的样品，以验证液滴的汽化情况。

结果

通过动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS）分析，展示了粒径分布的代表性结果。图5显示了经或未经挤出处理的浓缩气泡溶液的粒径分布。未进行挤出处理时，实验流程在步骤5.3结束。在低温条件下将样品释放至大气压，使冷却后的气泡发生浓缩。仅浓缩的样品显示出较宽的粒径分布，峰值集中在约400 nm附近；而经过挤出处理的样品则表现出更窄的分布，峰值位于200 nm。两种样品均包含脂质体和液滴，但DLS无法区分二者。图6展示了在通过离心洗涤去除多余脂质体后（步骤6.7）的相变液滴的代表性样品。本分析采用TRPS技术，以单独评估液滴的粒径分布和浓度。与DLS结果类似，TRPS显示液滴粒径集中在200 nm左右。将最终液滴溶液100 µL全部重悬于1 mL溶液中后，液滴浓度范围为每毫升10¹¹–10¹²个。TRPS数据为每个样品三次测量的平均值。

图7 展示了纳米液滴受...

讨论

已有大量文献讨论了用于体内成像和治疗的微泡及相变液滴的配方、物理特性及其潜在应用。本文重点讨论如何利用低沸点的全氟丁烷（DFB）气体和高压挤出技术，制备脂质微泡并将其转化为亚微米级的相变液滴。本方案旨在结合先前的微泡冷凝方法与液滴挤出技术，通过一步法相对简便地大量制备脂质微泡和DFB相变液滴。该方法的优势在于，可通过滤膜选择获得高浓度、粒径分布窄的微泡，进而形成DFB液滴。粒径分布窄的意义在于可实现样品汽化阈值的一致性。相比其他常用于获得窄粒径分布的方法，本方法更简便且成本更低，同时可处理的溶液体积也更大。该实验流程可分为三个主要步骤：（1）制备脂质微泡，（2）冷凝并挤出微泡，（3）通过离心分离相变液滴与脂质体。

使用探针尖端超声法生成微泡是制备脂质微泡的常用方法之一。已有大量文献描述了该操作流程。本实验方案改编自Feshitan等人的研究¹¹，并优化为制备10 mL微泡溶液，此体积为台式挤出器的最大容量。通过移除微尖附件并将脂质溶液体积增加至100 mL或更大，该方法也可放大以制备更大体积的脂质微泡溶液，如Feshitan等人

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Falcon	352095	收集和离心液滴
200 nm 聚碳酸酯滤膜	Whatman	110606	挤出器滤膜
2-甲基丁烷	Fisher Chemical	03551-4	挤出前快速预冷微泡溶液
三爪夹 X2	Fisher	02-217-002	固定闪烁瓶以进行探头超声处理
400W 模拟探头式超声仪（带喇叭头）	Branson	101-063-198R	用于从脂质溶液中生成脂质微泡
水浴超声仪	Fisher Scientific	15337402	帮助将脂质体分解为单层囊泡
氯仿	Fisher Bioreagents	C298-4	用于制备微泡前的脂质薄膜
十氟丁烷（全氟丁烷）气体	FluoroMed L.P.	1 kg	通过探头超声法生成微泡
干冰	-	-	挤出前快速预冷微泡溶液
DSPC 脂质粉末	NOF America	COATSOME MC-8080	脂质薄膜组分
DSPE-PEG-2K 脂质粉末	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	脂质薄膜组分
普通温度计	-	-	用于测量冰浴和2-甲基丁烷的温度（需可测量-20°C温度）
玻璃注射器	Hamilton	81139	用于在氯仿中混合脂质
甘油	Fisher Bioreagents	BP229-1	降低PBS溶液的冰点
加热金属块	VWR Scientific Products		加热脂质薄膜及汽化液滴
Lipex 10 mL 挤出器	Evonik		商用高压挤出系统
小型涡旋混合器	Fisher brand	14-955-151	用于去除脂质薄膜中残留的氯仿
氮气罐	-	-	用于驱动挤出器运行
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific		用于水合脂质薄膜及洗涤液滴
聚酯排水盘	Whatman	230600	为聚碳酸酯滤膜提供支撑
聚丙烯盖帽	Fisher Scientific	298417	用于溶液储存
丙二醇	Fisher Chemical	P355-1	降低PBS溶液的冰点
闪烁瓶	DWK Life Sciences Wheaton	986532	用于制备脂质薄膜及生成微泡
小锤	-	-	用于击碎干冰以冷却甲基丁烷
超声仪微探头附件	Branson	101148070	用于从脂质溶液中生成微泡
钢制容器	Medegen	79310	挤出前快速预冷微泡溶液（任何可耐-20°C的容器均可使用）
真空干燥器	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	去除脂质薄膜中残留的氯仿
2 mL 离心管	Fisher	02682004	用于浓缩纳米液滴