由预成型微泡制备膜过滤相变十氟丁烷纳米液滴

摘要

本方案描述了一种利用探头式超声法生成大量脂质包裹的全氟丁烷微泡，并通过高压挤出和机械过滤将其进一步冷凝为相变纳米液滴的方法。

摘要

有多种方法可用于制备适用于成像和治疗的可汽化相变液滴。每种方法采用的技术不同，在价格、材料和用途方面也各不相同。许多这些制备方法会产生粒径分布不均的液滴群体，其激活阈值不一致。此外，控制液滴尺寸通常需要使用高激活阈值的稳定全氟碳液体，而这类液体在体内应用中并不实用。使用低沸点气体生成尺寸均一的液滴，将有利于体内的成像和治疗实验。本文介绍一种简单且经济的方法，用于制备经尺寸筛选、脂质稳定的低沸点十氟丁烷（DFB）相变纳米液滴。文中描述了一种常见的脂质微泡制备方法，以及一种通过高压挤出在单一步骤内将其冷凝的新颖方法。该方法旨在节省时间、提高效率，并利用许多生物实验室常见的常规实验设备，制备出适用于多种应用的大体积微泡和纳米液滴溶液。

引言

超声造影剂（UCAs）在成像和治疗应用中的使用正迅速增长。微泡作为最初的超声造影剂，目前仍是临床诊断应用中的主流试剂。微泡是充满气体的球形颗粒，直径通常为1-10 µm，外层由脂质、蛋白质或聚合物壳包裹¹。然而，其尺寸和体内稳定性在许多应用中可能限制其功能。相变纳米液滴含有过热液体核心，因其更小的尺寸和更长的循环寿命，可克服其中一些局限²。当受到热或声能刺激时，其内部的过热液体核心会汽化，形成气体微泡^2,3,4,5。由于汽化阈值与液滴尺寸直接相关^5,6，制备尺寸均一的液滴悬浮液将有助于实现一致的激活阈值。能够产生均一液滴尺寸的制备方法通常复杂且成本较高，而成本较低的方法则往往产生多分散体系的溶液⁷。另一个局限在于能否稳定制备含有低沸点全氟碳（PFC）气体的相变液滴，这对于体内高效激活至关重要⁸。本文描述了一种用于生成稳定的、经过滤的、低沸点可汽化相变液滴的实验方案，适用于体....

方案

1. 制备脂质膜

1. 使用90% DSPC和10% DSPE-PEG2K制备用于微泡生成的脂膜，按以下步骤以正确比例混合脂质：
   1. 将DSPC和DSPE-PEG2K溶于氯仿中配制储备液。分别称取50 mg脂质粉末置于不同的样品瓶中，使用1 mL玻璃注射器向每个样品瓶中加入1 mL氯仿。
   2. 使用玻璃注射器将287 µL DSPC储备液（50 mg/mL）和113 µL DSPE-PEG2K储备液（50 mg/mL）加入20 mL闪烁瓶中。
   3. 通入氮气干燥混合脂质以去除氯仿。将适当长度的管路连接至实验室氮气源，轻轻将氮气通入样品瓶顶空区域，同时进行混合。持续操作直至观察不到氯仿残留，剩余脂膜开始变为白色。使用聚丙烯螺旋盖，在通入氮气时覆盖样品。
   4. 将样品瓶置于真空干燥器中过夜，以去除任何残留的氯仿。最终将留下一层覆盖瓶底的薄而半透明的脂膜。
   5. 将样品瓶于-20 °C保存，待用。

2. 从脂质膜制备微泡

1. 制备微泡时，向干燥的脂质膜中加入 10 mL 含 20% v/v 丙二醇和 20% v/v 甘油的 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（最终 pH 为 7.2–7.4）。
2. 盖紧样品管，将样品置于加热块（或恒温水浴）中，在 65 °C 下加热 30 分钟。
3. 在样品加热的....

结果

通过动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS）分析，展示了粒径分布的代表性结果。图5显示了经或未经挤出处理的浓缩气泡溶液的粒径分布。未进行挤出处理时，实验流程在步骤5.3结束。在低温条件下将样品释放至大气压，使冷却后的气泡发生浓缩。仅浓缩的样品显示出较宽的粒径分布，峰值集中在约400 nm附近；而经过挤出处理的样品则具有更窄的分布，峰值位于200 nm。两种样品均包含脂质体和液滴，但DLS无法区分二者。图6展示了在通过离心洗涤去除多余脂质体后（步骤6.7）的相变液滴的代表性样品。本分析采用TRPS技术，以单独评估液滴的粒径分布和浓度。与DLS结果类似，TRPS显示液滴粒径集中在200 nm左右。将最终液滴溶液100 µL全部重悬于1 mL溶液中后，液滴浓度范围为每毫升10¹¹–10¹²个。TRPS数据为每个样品三次测量的平均值。

图7 展示了纳米液滴受热.......

讨论

已有大量文献讨论了用于体内成像和治疗的微泡及相变液滴的配方、物理特性及其潜在应用。本文重点讨论如何利用低沸点的全氟丁烷（DFB）气体和高压挤出技术，制备脂质微泡并将其转化为亚微米级的相变液滴。本方案旨在结合先前的微泡冷凝方法与液滴挤出技术，通过一步法相对简便地大量制备脂质微泡和DFB相变液滴。该方法的优势在于，可通过滤膜选择获得高浓度、粒径分布窄的微泡，进而形成DFB液滴。粒径分布窄的意义在于可实现样品汽化阈值的一致性。相比其他常用于获得窄粒径分布的方法，本方法更简便且成本更低，同时可处理的溶液体积也更大。该实验流程可分为三个主要步骤：（1）制备脂质微泡，（2）冷凝并挤出微泡，（3）通过离心分离相变液滴与脂质体。

使用探针尖端超声法生成微泡是制备脂质微泡的常用方法之一。已有大量文献描述了该操作流程。本实验方案改编自Feshitan等人的研究¹¹，并优化为制备10 mL微泡溶液，此体积为台式挤出器的最大容量。通过移除微尖附件并将脂质溶液体积增加至100 mL或更大，该方法也可放大以制备更大体积的脂质微泡溶液，如Feshitan等人

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Falcon	352095	收集和离心液滴
200 nm 聚碳酸酯滤膜	Whatman	110606	挤出器滤膜
2-甲基丁烷	Fisher Chemical	03551-4	挤出前快速预冷微泡溶液
三爪夹 X2	Fisher	02-217-002	固定闪烁瓶以进行探头超声处理
400W 模拟探头式超声仪（带喇叭头）	Branson	101-063-198R	用于从脂质溶液中生成脂质微泡
水浴超声仪	Fisher Scientific	15337402	帮助将脂质体分解为单层囊泡
氯仿	Fisher Bioreagents	C298-4	用于制备微泡前的脂质薄膜
十氟丁烷（全氟丁烷）气体	FluoroMed L.P.	1 kg	通过探头超声法生成微泡
干冰	-	-	挤出前快速预冷微泡溶液
DSPC 脂质粉末	NOF America	COATSOME MC-8080	脂质薄膜组分
DSPE-PEG-2K 脂质粉末	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	脂质薄膜组分
普通温度计	-	-	用于测量冰浴和2-甲基丁烷的温度（需可测量-20°C温度）
玻璃注射器	Hamilton	81139	用于在氯仿中混合脂质
甘油	Fisher Bioreagents	BP229-1	降低PBS溶液的冰点
加热金属块	VWR Scientific Products		加热脂质薄膜及汽化液滴
Lipex 10 mL 挤出器	Evonik		商用高压挤出系统
小型涡旋混合器	Fisher brand	14-955-151	用于去除脂质薄膜中残留的氯仿
氮气罐	-	-	用于驱动挤出器运行
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific		用于水合脂质薄膜及洗涤液滴
聚酯排水盘	Whatman	230600	为聚碳酸酯滤膜提供支撑
聚丙烯盖帽	Fisher Scientific	298417	用于溶液储存
丙二醇	Fisher Chemical	P355-1	降低PBS溶液的冰点
闪烁瓶	DWK Life Sciences Wheaton	986532	用于制备脂质薄膜及生成微泡
小锤	-	-	用于击碎干冰以冷却甲基丁烷
超声仪微探头附件	Branson	101148070	用于从脂质溶液中生成微泡
钢制容器	Medegen	79310	挤出前快速预冷微泡溶液（任何可耐-20°C的容器均可使用）
真空干燥器	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	去除脂质薄膜中残留的氯仿
2 mL 离心管	Fisher	02682004	用于浓缩纳米液滴