观察活体胰腺组织切片中的胰岛功能及胰岛-免疫细胞相互作用

摘要

本研究介绍了活体胰腺组织切片在胰岛生理学及胰岛-免疫细胞相互作用研究中的应用。

摘要

活体胰腺组织切片可用于在完整胰岛微环境背景下研究胰岛的生理学特性与功能。该切片通过将活体人源和小鼠胰腺组织包埋于琼脂糖中，再使用振动切片机进行切割制备而成。此方法不仅能够维持组织的活性与功能，还能保留潜在的病理特征，例如1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）。该切片技术通过保持胰腺内分泌和外分泌组织所依赖的复杂结构及多种细胞间相互作用，为胰腺研究开辟了新的方向。本实验方案展示了如何对胰腺切片内源性活体免疫细胞进行染色和延时显微成像，同时评估胰岛的生理功能。此外，该方法还可结合主要组织相容性复合物多聚体试剂，进一步优化以识别针对胰岛细胞抗原的特异性免疫细胞亚群。

引言

胰腺受累是胰腺炎、1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）等疾病的特征性表现^1,2,3。对分离胰岛功能的研究通常需要将胰岛从其周围环境中移除⁴。活体胰腺组织切片技术的开发旨在研究胰腺组织的同时，保持胰岛微环境的完整性，并避免使用对胰岛造成应激的分离操作^5,6,7。来自人类供体组织的胰腺组织切片已成功用于T1D研究，揭示了β细胞丢失与功能障碍过程以及免疫细胞浸润现象^{8,9,10,11,12,13}。活体胰腺组织切片技术可应用于小鼠和人类的胰腺组织^5,

方案

注意事项：所有使用小鼠的实验方案均经佛罗里达大学动物护理与使用委员会（201808642）批准。来自两性组织捐献者的人胰腺组织切片通过佛罗里达大学的糖尿病胰腺器官捐献者网络（nPOD）组织库获得。人胰腺由经认证的器官获取组织根据nPOD合作框架及器官捐献相关法律和法规从尸体器官捐献者中获取，并经佛罗里达大学机构审查委员会（IRB）（IRB编号392-2008）归类为"非人类受试者"，因此免除知情同意要求。本项目所使用的nPOD组织已由佛罗里达大学IRB批准为非人类来源（IRB20140093）。本方案第1-3节的目标是说明如何成功解剖小鼠、制备和处理胰腺，并生成活体胰腺组织切片。所有溶液应提前配制，配方见补充表1。在本方案的这些步骤中，时间是最关键的因素。一旦小鼠被处死，组织的活性即开始下降。因此，必须尽快完成本方案的全部三个部分，直至获得所有必需的组织切片。

1. 小鼠胰腺切片制备

1. 将刀片夹紧在振动切片机的刀片夹持器上，但暂时不要将其连接到振动切片机上。
2. 在微波炉中加热融化100 mL的1.25% w/v低熔点琼脂糖溶液。以1分钟为间隔操作微波炉，若琼脂糖溶液开始沸腾，则暂停微波炉10秒。重复此过程，直至琼脂糖完全融化并形成均一溶液。将瓶子置于37 °C水浴中。
   注意：较低的琼脂糖浓度是为了适应小鼠胰腺较低的组织密度。
3. 用10 mL鲁尔锁式注射器吸....

结果

该方案将获得适用于功能研究和免疫细胞记录的活体胰腺组织切片。明场和反射光下的切片外观如图所示。 图1A，B如前所述，由于胰岛含有胰岛素而具有更高的颗粒密度，因此可在切片中通过反射光发现胰岛图1C）在使用反射光时，与背景组织相比可被清晰观察到。应在切片制备完成后评估细胞活性，若胰岛中超过20%的区域失去活性，则不应进行记录。图中显示了一个高活性的胰岛。 图1D，而处理不佳的切片示例如下所示 补充图1活力较低的胰岛会呈现强烈的SYTOX Blue染色，组织表面将布满死细胞的染色细胞核。此外，钙黄绿素-AM和Ca²⁺ 指示剂（如本实验所用的 Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 和 Fluo-4-AM）在死细胞中难以有效加载。应选择胰岛进行 Ca²⁺ 如果胰岛具有活性且指示剂已充分加载至整个胰岛，则进行记录。Ca²⁺

讨论

本实验方案的目的是阐明胰腺切片的制备方法，以及在功能和免疫学研究中使用这些切片所需的步骤。使用活体胰腺切片具有多种优势。然而，在所述实验流程中，有几个关键步骤对于保持组织的活性和可用性至关重要。操作必须迅速进行，从胰腺注射到在振动切片机上完成切片的时间应尽可能缩短，以维持组织的活性。将胰腺在切片前置于低温ECS溶液中而非室温ECS中，也有助于提高其活性。重要的是，切片绝不能置于不含蛋白酶抑制剂的培养基中。若在孵育过程中缺乏蛋白酶抑制剂，切片的活性将显著下降。

当切片在染料加载过程中短暂地未添加抑制剂时，尽管切片中仍可见基础活性，但已无法记录到高葡萄糖和KCl诱导的Ca²⁺流。所有用于活体切片的溶液，包括含3 mM D-葡萄糖的KRBH静息溶液、抗体孵育溶液以及任何培养基，都必须含有浓度为每毫升0.1毫克的蛋白酶抑制剂。用于切片成像的指示面板可根据实验目的和显微镜激光器的可用性进行调整。有多种不同颜色的细胞活力染料可替代本实验中使用的SYTOX Blue （参见材料表）。在Ca²⁺实验中，Fluo.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#3 型手术刀柄	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES 缓冲液，1M 溶液
10 cm 未处理培养皿	Corning	430591
10 mL 鲁尔锁注射器	BD	301029	BD 鲁尔锁头注射器
27 G 针头	BD	BD 305109	BD 通用型和 PrecisionGlide 皮下注射针头
35 mm 玻片底培养皿	Ibidi	81156	µ-Dish 35 mm，高型
50 mL 注射器	BD	309653
8 孔玻片腔室	Ibidi	80826	µ-Slide 8 孔
APC 抗小鼠 CD8a 抗体	Biolegend	100712
BSA	Fisher Scientific	199898
氯化钙	Sigma	C5670	CaCl2
二水合氯化钙	Sigma	C7902	CaCl2（二水合物）
紧凑型数字摇床	Thermo Fisher Scientific	88880020
共聚焦激光扫描显微镜	Leica	SP8	针孔 = 1.5–2 艾里单位；使用 10x/0.40 数值孔径 HC PL APO CS2 干镜和 20x/0.75 数值孔径 HC PL APO CS2 干镜在 512 × 512 像素分辨率下采集图像
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
双硫腙	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	二甲基亚砜
乙醇	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm 组织培养皿	Corning	353001	Falcon 易握型组织培养皿
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 外科刀片	Electron Microscopy Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	可穿透细胞膜的 Ca2+ 指示剂
Gel Control 超强胶	Loctite	45198
Graefe 镊子	Fine Science Tools	11049-10
硬化精细剪刀	Fine Science Tools	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks 平衡盐溶液
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
冰桶	Fisherbrand	03-395-150
异氟烷	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-05
约翰·霍普金斯 Bulldog 夹	Roboz Surgical Store	RS-7440	直型；压力 500–900 克；长度 1.5"
Kimwipes 纸巾	Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science™ Kimwipes™ 精细作业擦拭纸，双层
LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒	Invitrogen	L3224	该试剂盒包含钙黄绿素-AM 活细胞染料
低葡萄糖 DMEM	Corning	10-014-CV
六水合氯化镁	Sigma	M9272	MgCl2（六水合物）
七水合硫酸镁	Sigma	M2773	MgSO4（七水合物）
磁力加热平台	Warner Instruments	PM-1	用于动态刺激记录的成像腔室平台
微波炉	GE	JES1460DSWW
Nalgene 注射器滤器	Thermo Fisher Scientific	726-2520
4 号画笔	Michaels	10269140
开放式钻石浴成像腔室	Warner Instruments	RC-26	用于动态刺激记录的成像腔室
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	可穿透细胞膜的 Ca2+ 指示剂
过夜成像腔室	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	20012050	用于制备切片用琼脂糖
PE 标记胰岛素四聚体	Emory Tetramer Research Core	序列 YAIENYLEL
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
氯化钾	Sigma	P5405	KCl
磷酸二氢钾	Sigma	P5655	KH2PO4
剃须刀片	Electron Microscopy Sciences	71998	用于振动切片机；双刃不锈钢，未涂层
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque 低熔点琼脂糖	Lonza	50101	用于制备切片用琼脂糖
切片固定锚	Warner Instruments	64-1421
切片固定锚（动态成像）	Warner Instruments	640253	用于动态成像腔室的切片固定锚
碳酸氢钠	Sigma	S5761	NaHCO3
氯化钠	Sigma	S5886	NaCl
一水合磷酸二氢钠	Sigma	S9638	NaH2PO4 （一水合物）
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522-1G	来源于大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂
载物台适配器	Warner Instruments	SA-20MW-AL	用于将动态刺激记录成像腔室固定在显微镜载物台上
载物台培养箱	Okolab	H201
体视显微镜	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX Blue 死细胞染色剂	Invitrogen	S34857	蓝色荧光核酸染色剂
移液管	Falcon	357575	Falcon™ 塑料一次性移液管
阀门控制系统	Warner Instruments	VCS-8	用于动态刺激记录的系统
振动切片机 VT1000 S	Leica	VT1000 S
水浴锅	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp 通用豪华型水浴锅 GPD 02