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观察活体胰腺组织切片中的胰岛功能及胰岛-免疫细胞相互作用

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DOI：

10.3791/62207

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2021年4月12日

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1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

本文内容

摘要

本研究介绍了活体胰腺组织切片在胰岛生理学及胰岛-免疫细胞相互作用研究中的应用。

摘要

活体胰腺组织切片可用于在完整胰岛微环境背景下研究胰岛的生理学特性与功能。该切片通过将活体人源和小鼠胰腺组织包埋于琼脂糖中，再使用振动切片机进行切割制备而成。此方法不仅能够维持组织的活性与功能，还能保留潜在的病理特征，例如1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）。该切片技术通过保持胰腺内分泌和外分泌组织所依赖的复杂结构及多种细胞间相互作用，为胰腺研究开辟了新的方向。本实验方案展示了如何对胰腺切片内源性活体免疫细胞进行染色和延时显微成像，同时评估胰岛的生理功能。此外，该方法还可结合主要组织相容性复合物多聚体试剂，进一步优化以识别针对胰岛细胞抗原的特异性免疫细胞亚群。

引言

胰腺受累是胰腺炎、1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）等疾病的特征性表现1,2,3。对分离胰岛功能的研究通常需要将胰岛从其周围环境中移除4。活体胰腺组织切片技术的开发旨在研究胰腺组织的同时，保持胰岛微环境的完整性，并避免使用对胰岛造成应激的分离操作5,6,7。来自人类供体组织的胰腺组织切片已成功用于T1D研究，揭示了β细胞丢失与功能障碍过程以及免疫细胞浸润现象8,9,10,11,12,13。活体胰腺组织切片技术可应用于小鼠和人类的胰腺组织5,6,8。来自器官捐献者的人类胰腺组织切片通过与糖尿病胰腺器官捐献者网络（nPOD）合作获得。小鼠组织切片则可由多种不同品系的小鼠制备。

本方案将重点介绍非肥胖型糖尿病-重组激活基因1缺失型（NOD.Rag1-/-）和T细胞受体转基因（AI4）（NOD.Rag1-/-.AI4α/β）小鼠品系。由于重组激活基因1（Rag1）发生功能缺失，NOD.Rag1-/-小鼠无法发育生成T细胞和B细胞14。NOD.Rag1-/-.AI4α/β小鼠被用作加速型1型糖尿病的研究模型，因其仅产生一种特异性识别胰岛素表位的T细胞克隆，从而导致胰岛一致性的免疫细胞浸润和快速的疾病进展15。本文所述方案介绍了利用活体人和小鼠胰腺组织切片，结合共聚焦显微镜技术进行功能学与免疫学研究的实验方法。所涉及的技术包括细胞活力评估、胰岛的识别与定位、胞质Ca2+记录，以及免疫细胞群体的染色与鉴定。

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方案

注意事项：所有使用小鼠的实验方案均经佛罗里达大学动物护理与使用委员会（201808642）批准。来自两性组织捐献者的人胰腺组织切片通过佛罗里达大学的糖尿病胰腺器官捐献者网络（nPOD）组织库获得。人胰腺由经认证的器官获取组织根据nPOD合作框架及器官捐献相关法律和法规从尸体器官捐献者中获取，并经佛罗里达大学机构审查委员会（IRB）（IRB编号392-2008）归类为"非人类受试者"，因此免除知情同意要求。本项目所使用的nPOD组织已由佛罗里达大学IRB批准为非人类来源（IRB20140093）。本方案第1-3节的目标是说明如何成功解剖小鼠、制备和处理胰腺，并生成活体胰腺组织切片。所有溶液应提前配制，配方见补充表1。在本方案的这些步骤中，时间是最关键的因素。一旦小鼠被处死，组织的活性即开始下降。因此，必须尽快完成本方案的全部三个部分，直至获得所有必需的组织切片。

1. 小鼠胰腺切片制备

  1. 将刀片夹紧在振动切片机的刀片夹持器上，但暂时不要将其连接到振动切片机上。
  2. 在微波炉中加热融化100 mL的1.25% w/v低熔点琼脂糖溶液。以1分钟为间隔操作微波炉，若琼脂糖溶液开始沸腾，则暂停微波炉10秒。重复此过程，直至琼脂糖完全融化并形成均一溶液。将瓶子置于37 °C水浴中。
    注意：较低的琼脂糖浓度是为了适应小鼠胰腺较低的组织密度。
  3. 用10 mL鲁尔锁式注射器吸取3 mL温热的琼脂糖溶液。在注射器上安装一根27 G 25 mm的针头。将带有针帽的针头注射器保持在37 °C水浴中，直至准备注射。
    注意：推荐使用27 G针头，因其可牢固插入体重在10–25 g小鼠的胆总管中，并允许高黏度琼脂糖溶液顺利流动。虽然可选用更大内径的针头，但不建议使用更小（更高规格）的针头，因其更容易被琼脂糖溶液堵塞。
  4. 向一个10 cm培养皿中加入20 mL预冷的细胞外液（ECS）。
    注意：在整个操作过程中，ECS无需通气。
  5. 向两个10 cm未经处理的培养皿中各加入15 mL含有3 mM D-葡萄糖和大豆胰蛋白酶抑制剂（浓度为0.1 mg/mL）的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRBH）。
    ​注意：在整个实验方案中，所有用于维持切片的溶液都必须含有大豆胰蛋白酶抑制剂，以防止胰腺消化性蛋白酶对组织造成损伤。

2. 小鼠胰腺切除与组织处理

注意：胰腺切除、组织处理及切片制备的方案修改自 Marciniak 等人5。为确保组织活性，应尽量缩短胰腺摘除至切片制备之间的时间。所有必需设备应提前准备就绪，并合理布局，以便快速完成以下各步骤。胆管插管与注射以及胰腺切除操作最好在体视显微镜下进行。

  1. 使用异氟烷对小鼠进行深度麻醉，并通过颈椎脱位处死小鼠。
    注意：异氟烷是首选的麻醉方法，应使用5%浓度的异氟烷。例如，在1 L的麻醉室中应使用0.26 mL异氟烷16。当使用CO2时，观察到胰腺组织活力下降。
  2. 用70%（v/v）乙醇充分喷洒小鼠体表，以减少解剖和切除过程中毛发对组织的污染。将小鼠置于背侧向下、腹侧向上的位置，前侧朝左。
  3. 使用剪刀切开腹膜并移除肋骨，注意避免刺破心脏或邻近血管。用镊子将肝脏翻入胸腔，并将肠道移出体腔以暴露胆总管。使用约翰·霍普金斯 bulldog 夹闭锁乏特壶腹。
  4. 从37 °C水浴中取出一支预先装有3 mL温热琼脂糖溶液的10 mL鲁尔锁式注射器。
    注意：一旦将含琼脂糖的注射器从水浴中取出，必须迅速完成胰腺注射，以防琼脂糖在注射器内冷却凝固。
  5. 用左手持镊子，以轻柔地支撑和稳定胆总管，便于注射。
  6. 右手持注射器，将针头斜面朝上插入胆总管，缓慢而稳定地向胰腺内注射。一旦开始注射，便不能中断，否则琼脂糖会在注射器和胰腺内硬化。
    注意：注射体积应根据小鼠体重调整。根据经验，建议每10 g小鼠体重使用1 mL琼脂糖溶液，最大注射体积不超过2 mL。注射后胰腺应呈现轻微膨胀、结构更清晰的状态，但不应过度扩张。过度注射会导致胰岛从外分泌组织中分离，并在切片中呈现"爆裂"的外观。
  7. 从小鼠体内切除充满琼脂糖的胰腺。使用镊子和剪刀，从胃部开始，沿肠道方向，至脾脏结束，将胰腺完整剪下。剪下后，用镊子轻轻取出已注射的胰腺，并置于盛有冷ECS的10 cm培养皿中。
  8. 使用剪刀去除脂肪组织、结缔组织、纤维化组织以及未被琼脂糖灌注的胰腺部分。
    注意：应去除的组织部分结构松散，外观呈一定程度的胶状。
  9. 修剪组织后，在ECS液面下用剪刀将其切成直径约5 mm的小块。切割时需小心，避免将琼脂糖从组织中挤出。
  10. 将组织块从ECS中取出，放置于双层擦拭纸上（参见材料表）。用镊子轻轻在擦拭纸上滚动组织块，以去除多余液体。
  11. 用镊子小心地将组织块放入35 mm培养皿中，每皿不超过4块。将组织块最平坦的一面朝下放置，并用镊子轻轻按压。
    注意：确保各组织块之间留有至少几毫米的空隙，且不接触培养皿边缘。
  12. 缓慢将37 °C的琼脂糖倒入培养皿中，注意不要直接倾倒在组织块上。倒入量应足以完全覆盖组织块。确保组织块上方有一层琼脂糖，因为该部分将用于粘附到样品夹持器上。
  13. 小心将含有组织块的培养皿转移至冰箱，使琼脂糖凝固。确保组织块不发生移位或漂浮。若发生移位，应迅速用镊子重新调整。
    注意：琼脂糖凝固仅需几分钟。
  14. 琼脂糖凝固后，使用手术刀沿组织块周围以直线切割，形成琼脂糖包埋块，如同在组织块之间划出网格。确保组织块四周均保留数毫米的琼脂糖。
    注意：不应有任何组织从琼脂糖中突出。每个包埋块应为体积约5 mm × 5 mm × 5 mm的立方体。
  15. 使用手术刀将培养皿边缘被切割出的空余琼脂糖部分剔除。用镊子小心夹起含组织的琼脂糖块，从培养皿中取出。

3. 小鼠胰腺切片制备

  1. 使用镊子将组织块排列在样品托上；将组织块侧向放置，注意它们随后会被翻转粘到超级胶上。排列组织块时，确保其不超出刀片的宽度。由于振动切片机移动缓慢，应合理排布组织块，使刀片前进的距离尽可能短。
    ​注意：每排三至四个组织块，共两排，排间间隔几毫米效果较好。同一排内的组织块可相互接触，但若两排组织块彼此接触，则在切片从组织块脱离时可能难以取出。
  2. 在样品托上涂抹一条超级胶，用胶水瓶的尖端将胶水摊开成一层薄层。将组织块翻转至胶水上，使靠近组织的一侧朝上。轻轻按压组织块，静置干燥三分钟。
  3. 将刀片架和固定板安装到振动切片机上，通常通过螺丝或磁铁固定，具体方式取决于振动切片机型号。调节刀片高度和移动距离，使刀片刚好在组织块上方略高处移动，并覆盖整个组织块长度。
    注意：调节刀片高度时可借助镊子。将镊子置于组织块顶部，有助于将刀片调整至尽可能接近组织块顶部但不接触的位置。
  4. 用镊子轻轻拨动组织块，确认胶水已完全干燥，然后向振动切片机槽内加入预冷的ECS，直至液面浸没刀片。设置振动切片机以120 µm厚度、0.175 mm/s速度、70 Hz频率和1 mm振幅进行切片。
    注意：可根据组织切割难易程度适当调整切片速度。
  5. 启动振动切片机，观察切片从组织块上脱落的情况。当切片漂离组织块后，使用10 cm Graefe镊子或小型4号画笔小心取出切片，并转移至盛有含3 mM D-葡萄糖和胰蛋白酶抑制剂的KRBH溶液的10 cm培养皿中。用画笔或镊子从切片下方轻轻托起并提起切片。每个培养皿中同时孵育的切片不得超过15片。
    注意：振动切片机在初始阶段可能经过数次往复而未产生切片，属正常现象，但应尽量减少此类空切以节省时间。准备剪刀以应对切片未能完全脱离组织块的情况。若发生此类情况，刀片通过后切片的角或边缘仍会附着在组织块上。此时切勿强行拉扯切片或组织块。
  6. 将盛有切片的培养皿置于室温下、25 rpm的摇床上，静置1小时。若需更长时间保存，应将切片转移至含15 mL切片培养基（见补充表1）的培养瓶中，并放入培养箱。当日实验用切片在37 °C培养，过夜培养的切片则在24 °C培养，并在实验前至少1小时转移至37 °C。
    注意：长期培养时，24 °C下切片的存活率更佳，尽管37 °C更接近其生理环境，这可能与较低温度下分泌的蛋白酶活性降低有关。小鼠和人胰腺组织切片均在相同温度下培养，每皿最多放置15片。但人和小鼠切片所用培养基配方不同，两种配方均列于补充表1中。除小鼠胰腺需注射琼脂糖以稳定组织外，小鼠与人切片的制备流程相同。人胰腺切片通过nPOD胰腺切片项目获得。小鼠和人切片厚度均为120 µm。可在切片上开展多种实验；应根据计划进行的实验选择最合适的染色方案。

4. 染色步骤的切片制备

  1. 在计划进行实验前，先将切片在 37 °C 下培养至少 1 小时。将含有 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液置于 37 °C 水浴中预热。取 2 mL 含有 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液加入 35 mm 培养皿中，并使用画笔轻轻将切片放入培养皿中。
  2. 若切片来自保存介质，需用含 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液清洗两次。使用移液管或巴斯德吸管小心吸除含 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液，注意不要扰动切片。在准备染色方案期间，将切片保留在含有 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液的培养皿中。

5. 双硫腙染色

注意：尽管二苯硫腙可用于将胰岛染成红色，但该染色会杀死胰岛组织，因为研究发现二苯硫腙对胰岛具有细胞毒性17。

  1. 称取12.5 mg二苯硫腙，加入1.25 mL二甲基亚砜中，将该混合液吸入一支50 mL注射器中。用Hanks平衡盐溶液将注射器内液体体积补至25 mL，并在注射器末端连接一个滤器。分装2 mL含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液至35 mm培养皿中，然后从50 mL注射器中向培养皿加入2滴经过滤的二苯硫腙溶液。
  2. 使用毛笔小心地将组织切片转移至35 mm培养皿中。在体视显微镜下观察切片，胰岛因被二苯硫腙染成红色而清晰可见。

6. 活性染色

注意：本实验方案部分介绍如何使用钙黄绿素-AM 和蓝色荧光 SYTOX Blue （参见材料表）评估组织切片的活性。钙黄绿素-AM 的使用浓度应为 4 µM， SYTOX Blue 的使用浓度为 1 µM。

  1. 取含有 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液 2 mL，分别加入 2 µL 钙黄绿素-AM 染料和 SYTOX Blue ，涡旋混合 5 秒。
  2. 向 8 孔腔室盖玻片的每孔中加入 200 µL 含有 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液以及钙黄绿素-AM 染料 。
    注：可使用其他类型的培养板或成像腔室，不限于 8 孔腔室盖玻片。
  3. 使用画笔小心地将脑片放入板的每孔中，将带有脑片的板转移至 37 °C 培养箱中孵育 20 分钟。用含有 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液洗涤脑片两次。使用移液管或巴斯德吸管小心吸除 KRBH 溶液，注意不要扰动脑片。
  4. 将脑片置于含有 2 mL KRBH 溶液（含 3 mM D-葡萄糖）和 2 µL SYTOX Blue （终浓度为每 1 mL 溶液加入 1 µL）的 35 mm 盖玻片底培养皿中。用脑片固定器覆盖脑片，确保带“竖琴”结构的一面朝下。对脑片进行成像。
    注：若脑片固定器持续漂浮，可用含 3 mM D-葡萄糖的 KRBH 溶液润湿其两侧，使其浸入溶液中。即使在染料加载过程中，也必须始终将脑片维持在含有蛋白酶抑制剂的溶液中。所使用的细胞活性染色剂可根据具体实验或显微镜设置进行调整。

7. 脑片 Ca2+ 指示剂染色

注意：本实验方案部分介绍如何使用 Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 和 SYTOX Blue 对小鼠脑片进行染色以进行 Ca2+ 记录（参见材料表）。Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 的使用浓度应为 5.6 µM，SYTOX Blue 的使用浓度为 1 µM。在人脑片中，应使用 Fluo-4-AM，浓度为 6.4 µM。

  1. 取2 mL含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液，加入7 µL的 俄勒冈 绿色 488 BAPTA-1, AM 涡旋混合5秒。
    注意：对于人组织切片，应使用 Fluo-4-AM 代替 Oregon 绿色 488 BAPTA-1, AM。Fluo-4-AM 更为理想，因其在细胞内 Ca²⁺ 存在时荧光更强2+ 浓度增加；然而，其在小鼠胰腺组织中的负载效果不佳。该方案与上述Fluo-4-AM的方案相同，唯独Fluo-4-AM仅需孵育30分钟。
  2. 向8孔腔室载玻片的每个孔中加入200 µL含有3 mM D-葡萄糖和染料的KRBH溶液。使用画笔小心地将脑片放置于腔室载玻片的各个孔中。将带有脑片的腔室载玻片转移至37 °C培养箱中孵育45分钟。
  3. 用含3 mM D-葡萄糖的KRBH缓冲液洗涤切片两次。使用移液管或巴斯德吸管小心吸除含3 mM D-葡萄糖的KRBH缓冲液，注意不要扰动切片。
  4. 放置一个 在含有3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液中，将切片置于成像板或成像腔室中 SYTOX Blue 以每1 mL 1 µL的浓度加入，并用切片锚固定，确保网格朝下。对切片进行成像。
    注意：在本实验方案中，使用含有 3 mM D-葡萄糖和 2 µL SYTOX Blue 的 2 mL KRBH 溶液填充 35 mm 培养皿 使用该方法。如果切片锚漂浮，用含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液将两面润湿，使其沉入溶液中。

8. 小鼠脑片 Ca2+ 记录

注意事项：以下部分介绍如何使用 Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 和 SYTOX Blue 对小鼠胰腺组织切片进行 Ca2+ 记录。成像在共聚焦激光扫描显微镜上进行（详见材料表）。使用的激光波长分别为：SYTOX Blue 采用 405 nm，Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 采用 488 nm，反射光成像采用 638 nm。Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 使用 HyD 检测器，而反射光和 SYTOX Blue 使用光电倍增管（PMT）检测器。除使用 Fluo-4-AM 作为指示剂外，人胰腺组织切片的 Ca2+ 成像方案与小鼠相同。激光功率、增益和针孔大小应根据具体样本及所成像的胰岛进行调整。通常，针孔大小设为 1.5 airy 单位，激光功率设为 1% 可作为良好的起始参数。

  1. 在开始记录前至少1小时，打开显微镜，并将载物台式或笼式培养箱预热至37 °C。取下培养皿盖子后，将装有组织切片的35 mm玻璃底培养皿放置在显微镜载物台上。将显微镜切换至10倍物镜和明场模式进行聚焦。在明场下寻找切片中呈橙棕色的椭圆形结构以定位胰岛。
  2. 找到疑似胰岛后，将显微镜切换至共聚焦成像模式。为通过反射光确认胰岛，开启638 nm激光器，将激光功率设置在1%至2%之间，并关闭通常用于消除背向散射光的638 nm陷波滤光片。将PMT探测器的检测范围设定为以638 nm为中心、带宽约为20 nm的区间。
    注意：操作显微镜处于反射模式时需谨慎，以免损坏探测器。由于内分泌组织具有高度颗粒性，现在可利用反射光来定位胰岛。在此反射通道中，胰岛将表现为一群强烈背向散射光的颗粒状细胞。
  3. 为观察SYTOX Blue染色，开启405 nm激光器和PMT探测器，并将激光功率设置在1%至2%之间。使用载物台控制器的X和Y旋钮，将目标胰岛置于视野中央。在通过背向散射确认目标胰岛后，切换至20倍物镜，并放大图像使胰岛占据视野的大部分区域。
  4. 以1.5 µm的Z轴步长对胰岛进行Z轴层扫成像。选择最佳光学切片，其中大多数细胞仍存活（SYTOX Blue染色阴性）且被Oregon Green 488 BAPTA-1, AM或Fluo-4-AM充分负载。
    注意：有时会观察到某些细胞因摄入过多染料而异常明亮，这些可能是正在死亡的胰腺细胞，其内质网中的Ca2+储存已释放，导致染料负载水平极高；这类细胞不适合用于记录。应选择染料负载清晰但未过度饱和探测器的细胞，以便能够观察到细胞质Ca2+水平波动时荧光强度的变化。切片中胰岛的染料负载程度存在差异，但通常染料可良好渗透至胰岛表层约10–15 µm深度。然而，若细胞位于组织深层，则可能难以观察到染料负载情况。
  5. 为防止记录过程中染料荧光衰减，确保488 nm通道的激光功率不超过2%。将针孔直径增加至2艾里单位（airy units），以在较低激发功率下收集更多信号。
  6. 将显微镜设置为XYZT模式进行记录。优化参数设置，使每帧成像时间缩短至2秒或更短。
    注意：可通过启用双向扫描、降低或关闭线平均、提高扫描速度等调整方式来降低帧时间。
  7. 参数优化后，记录数分钟的基础活动状态。
    注意：若在此基础活动记录期间观察到细胞活跃并出现明显的闪光现象，则表明组织活性良好，这是组织存活能力的另一个良好指标。
  8. 在指定时间点，使用200 µL移液器向培养皿中加入100 µL浓度为20倍的葡萄糖和KCl KRBH溶液，使终浓度达到16.7 mM葡萄糖或30 mM KCl。
    注意：添加溶液时应小心操作，避免扰动组织切片。切勿让移液器触碰培养皿。通常可见组织在刺激后发生收缩反应。Ca2+通量记录数据在ImageJ18中进行处理与定量分析。使用ImageJ软件，通过手动选择感兴趣区域（ROIs）测量细胞中Oregon Green 488 BAPTA-1, AM的染色强度。通过将后续时间点的荧光值除以细胞初始荧光值（F/F0）来计算各ROI的荧光强度变化。可结合灌流系统与专用成像室动态施加试剂至切片，而非手动添加。灌流系统与成像室的推荐型号详见材料表。

9. 活体小鼠胰腺切片中T细胞的染色

注意：本实验方案部分描述了如何对小鼠组织切片中的免疫细胞进行染色。所使用的小鼠品系为 NOD.Rag1-/-.AI4α/β ，因为该模型能够稳定地发展出具有显著胰岛炎的疾病表型。该小鼠体内的 CD8+ T 细胞均靶向胰岛素的一个表位，因此可使用藻红蛋白（PE）标记的胰岛素-Db 四聚体15进行检测。CD8 抗体的使用浓度应为 1:20，胰岛素四聚体的使用浓度为 1:50。

  1. 取100 µL含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液，加入2 µL PE胰岛素四聚体和5 µL别藻蓝蛋白（APC）CD8抗体，涡旋混合5秒。
  2. 将100 µL含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液以及四聚体和抗体加入8孔腔室载玻片的一个孔中。使用画笔小心地将脑片放入腔室载玻片的孔内。将带有脑片的腔室载玻片置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
  3. 用2 mL含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液洗涤脑片 两次。使用移液管或巴斯德吸管小心吸除含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液，注意不要扰动脑片。
  4. 将脑片置于一个35 mm玻璃底培养皿中，培养皿内含有含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液以及SYTOX Blue （浓度为每1 mL溶液加入1 µL），然后盖上切片固定锚，使带琴弦的一面朝下。对脑片进行成像。
    ​注意：如果切片固定锚持续漂浮，可用含3 mM D-葡萄糖的KRBH溶液将锚的两面润湿，使其浸入溶液中。稀释后的抗体和四聚体溶液可重复使用一次。在完成两片染色后，应重新配制新鲜的抗体混合液。

10. 小鼠免疫细胞的记录

注意：以下部分描述了如何使用 CD8 抗体、PE 胰岛素四聚体和 SYTOX Blue 对小鼠胰腺组织切片进行免疫细胞成像记录。成像设置如第 8 节所述。图像采集分辨率为 800 × 800 像素。所用激光波长分别为：405 nm 用于 SYTOX Blue，488 nm 用于胰岛素四聚体，638 nm 用于 CD8 抗体和反射光信号。CD8 抗体和 PE 胰岛素四聚体信号采用 HyD 检测器检测，反射光和 SYTOX Blue 信号采用 PMT 检测器检测。人类胰腺组织切片的免疫细胞成像方案与此相同，但需使用适用于人组织的不同抗体和抗原复合的 HLA 多聚体。无论是对小鼠组织中的胰岛素四聚体染色，还是对人类组织中的 HLA 多聚体染色，均应使用免疫细胞共染色以确认特异性抗原反应性 T 细胞的存在。本实验中使用了抗 CD8 抗体，也可根据目标细胞群体选用其他抗体，如抗 CD3 或抗 CD4 抗体。

  1. 在开始记录前至少1小时，打开显微镜，并将载物台顶部培养箱平衡至37 °C。将装有组织切片的35 mm玻璃底培养皿固定在载物台上。使用10x物镜在明场模式下对显微镜进行调焦。在切片中寻找橙棕色的椭圆形结构，以定位胰岛。
  2. 通过按下显微镜触摸屏控制器上的CS按钮，将显微镜切换至共聚焦成像模式。若需通过反射光观察胰岛，请打开638 nm激光器和PMT探测器，将激光功率设置在1%至2%之间，并关闭陷波滤光片。
    注意：由于内分泌组织颗粒度增加，现在可利用反射光来定位胰岛。在此通道中，胰岛将呈现为一群明亮且具颗粒感的细胞。
  3. 为观察SYTOX Blue、CD8抗体和胰岛素四聚体，请确认激光功率保持在1%至2%之间。使用以下设置分别观察三种信号：对于SYTOX Blue，开启405 nm激光器和PMT探测器；对于CD8抗体，开启HyD探测器；对于胰岛素四聚体，开启488 nm激光器和HyD探测器。
  4. 使用载物台控制器的X和Y旋钮，将目标胰岛置于视野中央。找到目标胰岛后，切换至20x物镜并放大图像，使胰岛占据大部分视野。以1.5 µm的Z轴步长采集该胰岛的Z轴层扫图像。选择最佳的光学切片（通常为5至10层），确保其中大多数细胞处于存活状态（SYTOX Blue阴性），且周围任何免疫细胞均处于清晰对焦状态。
    注意：应尽量选择存在多个CD8阳性及胰岛素四聚体阳性细胞围绕或浸润胰岛的图像帧。
  5. 将显微镜设置为XYZT模式进行时间序列记录。优化成像参数，以便每隔20分钟对选定的Z轴层进行一次Z-stack扫描，持续数小时。
    注意：若条件允许，最好在可控制温度和CO2浓度的成像培养舱中进行此类记录，尤其是在记录时间超过四小时的情况下。若进行过夜记录，可在培养基中添加过量抗体，以补偿T细胞受体循环和荧光染料衰减。此外，T细胞抗体也可选用不同的荧光染料。根据经验，远红光波段的荧光染料对T细胞标记效果最佳。

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结果

该方案将获得适用于功能研究和免疫细胞记录的活体胰腺组织切片。明场和反射光下的切片外观如图所示。 图1A，B如前所述，由于胰岛含有胰岛素而具有更高的颗粒密度，因此可在切片中通过反射光发现胰岛图1C）在使用反射光时，与背景组织相比可被清晰观察到。应在切片制备完成后评估细胞活性，若胰岛中超过20%的区域失去活性，则不应进行记录。图中显示了一个高活性的胰岛。 图1D，而处理不佳的切片示例如下所示 补充图1活力较低的胰岛会呈现强烈的SYTOX Blue染色，组织表面将布满死细胞的染色细胞核。此外，钙黄绿素-AM和Ca2+ 指示剂（如本实验所用的 Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 和 Fluo-4-AM）在死细胞中难以有效加载。应选择胰岛进行 Ca2+ 如果胰岛具有活性且指示剂已充分加载至整个胰岛，则可进行记录。Ca2+

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讨论

本实验方案的目的是阐明胰腺切片的制备方法，以及在功能和免疫学研究中使用这些切片所需的步骤。使用活体胰腺切片具有多种优势。然而，在所述实验流程中，有几个关键步骤对于保持组织的活性和可用性至关重要。操作必须迅速进行，从胰腺注射到在振动切片机上完成切片的时间应尽可能缩短，以维持组织的活性。将胰腺在切片前置于低温ECS溶液中而非室温ECS中，也有助于提高其活性。重要的是，切片绝不能置于不含蛋白酶抑制剂的培养基中。若在孵育过程中缺乏蛋白酶抑制剂，切片的活性将显著下降。

当切片在染料加载过程中短暂地未添加抑制剂时，尽管切片中仍可见基础活性，但已无法记录到高葡萄糖和KCl诱导的Ca2+流。所有用于活体切片的溶液，包括含3 mM D-葡萄糖的KRBH静息溶液、抗体孵育溶液以及任何培养基，都必须含有浓度为每毫升0.1毫克的蛋白酶抑制剂。用于切片成像的指示面板可根据实验目的和显微镜激光器的可用性进行调整。有多种不同颜色的细胞活力染料可替代本实验中使用的SYTOX Blue （参见材料表）。在Ca2+实验中，Fluo...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01 DK123292、T32 DK108736、UC4 DK104194、UG3 DK122638 和 P01 AI042288。本研究在胰腺器官捐献者糖尿病网络（nPOD；RRID:SCR_014641）的支持下完成，nPOD 是由 JDRF（nPOD：5-SRA-2018-557-Q-R）和 Leona M. & Harry B. Helmsley 慈善信托基金（资助编号 #2018PG-T1D053）资助的协作型 1 型糖尿病研究项目。文中所述内容与观点由作者负责，不一定代表 nPOD 的官方立场。与 nPOD 合作提供研究资源的器官获取组织（OPO）名单请见 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/。特此感谢佛罗里达大学的 Kevin Otto 博士提供用于制备小鼠脑片的振动切片机。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#3 型手术刀柄Fisherbrand12-000-163
1 M HEPESFisher ScientificBP299-100HEPES 缓冲液，1M 溶液
10 cm 未处理培养皿Corning430591
10 mL 鲁尔锁注射器BD301029BD 鲁尔锁头注射器
27 G 针头BDBD 305109BD 通用型和 PrecisionGlide 皮下注射针头
35 mm 玻片底培养皿Ibidi81156µ-Dish 35 mm，高型
50 mL 注射器BD309653
8 孔玻片腔室Ibidi80826µ-Slide 8 孔
APC 抗小鼠 CD8a 抗体Biolegend100712
BSAFisher Scientific199898
氯化钙SigmaC5670CaCl2
二水合氯化钙SigmaC7902CaCl2（二水合物）
紧凑型数字摇床Thermo Fisher Scientific88880020
共聚焦激光扫描显微镜LeicaSP8针孔 = 1.5–2 艾里单位；使用 10x/0.40 数值孔径 HC PL APO CS2 干镜和 20x/0.75 数值孔径 HC PL APO CS2 干镜在 512 × 512 像素分辨率下采集图像
D-(+)-葡萄糖SigmaG7021C6H12O6
ddiH2O
双硫腙Sigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345二甲基亚砜
乙醇Decon Laboratories2805
Falcon 35 mm 组织培养皿Corning353001Falcon 易握型组织培养皿
FBSGibco10082147
Feather No. 10 外科刀片Electron Microscopy Sciences7204410
fluo-4-AMInvitrogenF14201可穿透细胞膜的 Ca2+ 指示剂
Gel Control 超强胶Loctite45198
Graefe 镊子Fine Science Tools11049-10
硬化精细剪刀Fine Science Tools14090-09
HBSSGibco14025092Hanks 平衡盐溶液
HEPESSigmaH4034C8H18N2O4S
冰桶Fisherbrand03-395-150
异氟烷Patterson VeterinaryNDC 14043-704-05
约翰·霍普金斯 Bulldog 夹Roboz Surgical StoreRS-7440 直型；压力 500–900 克；长度 1.5"
Kimwipes 纸巾Kimberly-Clark Professional34705Kimtech Science™ Kimwipes™ 精细作业擦拭纸，双层
LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒InvitrogenL3224该试剂盒包含钙黄绿素-AM 活细胞染料
低葡萄糖 DMEMCorning10-014-CV
六水合氯化镁SigmaM9272MgCl2（六水合物）
七水合硫酸镁SigmaM2773MgSO4（七水合物）
磁力加热平台Warner InstrumentsPM-1用于动态刺激记录的成像腔室平台
微波炉GEJES1460DSWW
Nalgene 注射器滤器Thermo Fisher Scientific726-2520
4 号画笔Michaels10269140
开放式钻石浴成像腔室Warner InstrumentsRC-26用于动态刺激记录的成像腔室
Oregon Green 488 BAPTA-1-AMInvitrogenO6807可穿透细胞膜的 Ca2+ 指示剂
过夜成像腔室OkolabH201-LG
PBSThermo Fisher Scientific20012050用于制备切片用琼脂糖
PE 标记胰岛素四聚体Emory Tetramer Research Core序列 YAIENYLEL
青霉素-链霉素Gibco15140122
氯化钾SigmaP5405KCl
磷酸二氢钾SigmaP5655KH2PO4
剃须刀片Electron Microscopy Sciences71998用于振动切片机；双刃不锈钢，未涂层
RPMI 1640Gibco11875093
SeaPlaque 低熔点琼脂糖Lonza50101用于制备切片用琼脂糖
切片固定锚Warner Instruments64-1421
切片固定锚（动态成像）Warner Instruments640253用于动态成像腔室的切片固定锚
碳酸氢钠SigmaS5761NaHCO3
氯化钠SigmaS5886NaCl
一水合磷酸二氢钠SigmaS9638NaH2PO4 （一水合物）
大豆胰蛋白酶抑制剂SigmaT6522-1G来源于大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂
载物台适配器Warner InstrumentsSA-20MW-AL用于将动态刺激记录成像腔室固定在显微镜载物台上
载物台培养箱OkolabH201
体视显微镜LeicaIC90 E MSV266
SYTOX Blue 死细胞染色剂InvitrogenS34857蓝色荧光核酸染色剂
移液管Falcon357575Falcon™ 塑料一次性移液管
阀门控制系统Warner InstrumentsVCS-8用于动态刺激记录的系统
振动切片机 VT1000 SLeicaVT1000 S
水浴锅Fisher ScientificFSGPD02Fisherbrand Isotemp 通用豪华型水浴锅 GPD 02

参考文献

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