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注意:所有使用小鼠的实验方案均已获得佛罗里达大学动物护理和使用委员会（201808642）的批准。来自两性组织供体的人类胰腺切片是通过佛罗里达大学糖尿病胰腺器官供体网络（nPOD）组织库获得的。根据器官捐赠法律法规，与nPOD合作的认证器官采购组织从尸体器官捐献者身上摘取了人类胰腺，并被佛罗里达大学机构审查委员会（IRB No. 392-2008）归类为"非人类受试者"，免除了同意的需要。专门用于该项目的nPOD组织被佛罗里达大学IRB（IRB20140093）批准为非人类。该协议第1-3节的目的是解释如何成功解剖小鼠，准备和处理胰腺，并产生活的胰腺组织切片。应提前准备溶液，食谱可以在 补充表1中找到。在这些协议步骤中，时间是最关键的因素。一旦小鼠被处死，组织活力将开始下降。此协议的所有三个部分都需要尽快完成，直到生成所有必要的切片。
1. 小鼠胰腺切片的生成准备
- 将刀片夹在振动器刀片架上，但不要将其连接到振动切片机上。
- 在微波炉中融化 100 mL 1.25% w/v 低熔点琼脂糖。每隔1分钟操作一次微波炉，如果琼脂糖溶液开始沸腾，则停止微波炉10秒。重复此过程，直到琼脂糖熔化，并产生均匀的溶液。将瓶子放入37°C水浴中。
注意:低琼脂糖浓度是小鼠胰腺密度较低的原因。
- 将 10 mL 鲁尔锁式注射器与 3 mL 温热琼脂糖一起填充。将 27 G 25 mm 针头安装到注射器上。将注射器与带盖的针头一起保持在37°C水浴中，直到注入溶液。
注意:27 G针头是首选，因为它牢固地适合体重在10-25g之间的小鼠胆总管中，并允许高粘度琼脂糖溶液的流动。虽然可以选择使用较大的孔针，但不建议使用较小（较大规格）的针头，因为这些针头可能更容易被琼脂糖溶液堵塞。
- 将 20 mL 冷藏细胞外溶液 （ECS） 加入 10 cm 培养皿中。
注意:弹性云服务器在任何时候都不需要冒泡。
- 将两个10厘米未经处理的培养皿与15mL克雷布斯 - 林格碳酸氢盐缓冲液（KRBH）填充，其中含有3mM D-葡萄糖和大豆胰蛋白酶抑制剂，浓度为每培养皿0.1mg / mL。
注意:在整个方案中，用于维持切片的所有溶液都必须含有大豆胰蛋白酶抑制剂，以防止胰腺消化蛋白酶引起的组织损伤。
2. 小鼠胰腺切除和组织处理
注意:切除胰腺，处理组织和产生切片的方案是从Marciniak等人5修改而来的。为确保组织活力，请尽量减少胰腺切除和切片生成之间的时间。所有必要的设备都应提前准备好，并以某种方式定向，以便通过以下步骤快速前进。胆管抽油和注射以及胰腺切除术最好在立体镜下进行。
- 用异氟醚对小鼠进行深度麻醉，并通过颈椎脱位处死。
注意:异氟醚是首选的麻醉方法。应使用浓度为 5% 的异氟醚。例如，0.26 mL 应与 1 L 腔室一起使用16。当使用CO2 时，观察到胰腺组织活力降低。
- 用70%v / v乙醇充分喷洒小鼠，以减少在解剖和切除过程中皮毛的组织污染。将鼠标置于背向下，腹侧向上的方向，前侧向左。
- 使用剪刀，打开腹膜并取出肋骨笼，注意不要刺穿心脏或邻近的血管。使用镊子将肝脏翻转到胸腔中，并将肠道移出体腔以暴露胆总管。使用约翰霍普金斯斗牛犬夹来遮挡Vater的壶腹。
- 从37°C水浴中取出预装有3 mL温琼脂糖溶液的10 mL鲁尔锁定注射器。
注意:一旦将带有琼脂糖的注射器从水浴中取出，在琼脂糖冷却并固定在注射器中之前，需要快速进行胰腺注射。
- 用左手握住镊子，用它们轻轻支撑和稳定注射的胆管。
- 右手握住注射器，将针头斜面向上插入胆管。缓慢而稳定地注射胰腺。一旦注射开始，如果没有琼脂糖在注射器和胰腺中硬化，就无法停止流动。
注:使用的体积取决于鼠标的重量。根据经验，建议每10g小鼠体重使用1mL琼脂糖溶液，最大体积为2mL。胰腺应看起来略微膨胀，结构更明确，但不要过度伸展。过度注射导致胰岛与外分泌组织分离，并且在切片中具有"吹出"的外观。
- 从小鼠身上切除充满琼脂糖的胰腺。使用镊子和剪刀，切除胰腺，从胃开始，移动到肠道，在脾脏结束。切开后，用镊子轻轻取出注射的胰腺，然后放入装满冷ECS的10厘米培养皿中。
- 使用剪刀去除脂肪，结缔组织，纤维化组织和未注射琼脂糖的胰腺部分。
注意:应该去除的组织部分将没有牢固的结构，并且会显得有些凝胶状。
- 修剪组织后，使用剪刀将其切成直径约5毫米的较小部分，同时将其浸入ECS下。小心地切开组织，注意不要将琼脂糖从组织中推出。
- 从 ECS 中取出组织碎片，并将其放在双层刮水器上（请参见 材料表）。使用镊子在雨刮器上轻轻滚动以除去多余的液体。
- 使用镊子，小心地将组织碎片放入35毫米培养皿中，每板不超过4块。将组织块最平坦的一侧朝下放置。用镊子轻轻按压组织。
注意:确保组织之间有空间，至少几毫米，并且它们没有接触板的边缘。
- 慢慢地将37°C琼脂糖倒入培养皿中，注意不要将其直接倒在纸巾上。倒入足够的物质，使纸巾完全覆盖。确保组织片上方有一层琼脂糖，因为该部分将粘附在标本支架上。
- 小心地将盘子和纸巾片转移到冰箱中，让琼脂糖凝固。确保纸巾不会移动或开始漂浮。如果他们这样做，请使用镊子快速重新调整它们。
注意:琼脂糖的设置应该只需要几分钟。
- 一旦琼脂糖凝固，使用手术刀在组织周围以直线切割，使琼脂糖块状物，就好像在组织块之间形成网格一样。确保在组织的所有侧面周围留下几毫米的琼脂糖。
注意:不应有任何组织从琼脂糖中突出。每个块应是一个体积约为 5 mm x 5 mm x 5 mm 的立方体。
- 使用手术刀翻转出在板边缘切割的琼脂糖空块。用镊子小心地将其与组织一起从培养皿中取出。
3. 小鼠胰腺切片生成
- 使用镊子，将块排列在试样夹具座上;将它们侧向放置，请记住它们将被翻转到超级胶水上。排列块，使它们不会延伸超过刀片宽度。当振动器缓慢移动时，排列块，使刀片必须向前移动尽可能短的距离。
注意:两行，每行三到四个块，行之间有几毫米，效果很好。同一行中的块可以相互接触，但是当两行都接触时，当它们从块中脱落时，可能很难检索切片。
- 在试样支架上涂上一排超级胶水，然后使用点胶机的末端将胶水铺成薄薄的一层。将组织块翻转到胶水上，使最靠近组织的一侧朝上。轻轻按压块，让胶水干燥三分钟。
- 将刀片支架和板连接到振动器，通常使用螺钉或磁铁，具体取决于振动切片机型号。调整刀片高度和行进距离，使刀片在方块的长度上移动，并且刚好在方块上方。
注:在调整刀片高度时，镊子可能会有所帮助。它们可以放置在组织块的顶部，以帮助将刀片尽可能靠近块的顶部，而不会接触块。
- 用镊子轻轻轻推块，确保胶水已干燥，并用冷却的ECS填充振动器托盘，直到刀片被覆盖。将振动切片机设置为以 0.175 mm/s 的速度、频率为 70 Hz 和振幅为 1 mm 的速度制作 120 μm 厚度的切片。
注意:振动切片机速度可以根据切割组织的难易程度进行调整。
- 启动振动切片机，并观察切片何时开始从组织块中脱落。使用10厘米Graefe镊子或4号小画笔小心地取出切片，一旦它们从块上漂浮下来，并将它们放入10厘米的板中，KRBH含有3mM D-葡萄糖和胰蛋白酶抑制剂。通过在切片下方放置画笔或镊子并轻轻抬起切片来捡起切片。不要在一块盘子中一起孵育超过15片。
注意:振动切片机在没有切片的块上有几个通道是正常的，但这些应该随着时间的流逝而最小化。准备好剪刀，以防切片没有完全与组织块分离。如果发生这种情况，在振动切片机刀片通过后，切片的角或边缘将粘在块上。移除卡住的切片时，请勿拉出切片或块。
- 将带有切片的板放在室温和25 rpm的摇臂上。让切片在室温下静置一小时。如果要放置更长时间，请将切片放入培养箱中的15mL切片培养基（见 补充表1）。在37°C下孵育用于当日研究的切片，并在24°C下培养过夜的培养切片，在实验前至少1小时将其转移到37°C。
注意:从长远来看，切片在24°C下培养时具有更好的生存能力，尽管37°C更接近其天然生理环境，可能是由于分泌的蛋白酶在较低温度下的活性较低。小鼠和人胰腺组织切片均在相同温度下培养，每皿最多15片。但是，人体切片和小鼠切片的培养基配方不同。这两种制剂都列在 补充表1中。此外，生成小鼠和人类切片的程序相同，但需要注射琼脂糖以稳定小鼠胰腺除外。人体切片是通过nPOD胰腺切片计划获得的。小鼠和人类的切片厚度均为120μm。可以在切片上进行各种实验;选择最适合计划实验的染色板。
4. 染色程序的切片准备
- 在计划的实验之前，在37°C下培养切片至少1小时。在37°C的水浴中含有3 mM D-葡萄糖的温暖KRBH。将2毫升含有3mM D-葡萄糖的KRBH转移到35毫米培养皿中，并使用画笔将切片轻轻地放入培养皿中。
- 如果切片是从培养基中转移的，用含有3mM D-葡萄糖的KRBH洗涤两次。使用转移移液器或巴斯德移液器小心地用3 mM D-葡萄糖吸出KRBH，注意不要干扰切片。在制备染色面板时，将切片与含有3mM D-葡萄糖的KRBH一起保存在板中。
5. 二硫酮染色
注意:虽然地噻嗪酮可用于将胰岛染成红色，但它会杀死切片，因为它已被发现对胰岛具有细胞毒性17。
- 测量12.5mg二噻嗪，将其添加到1.25mL二甲基亚砜中，并将该混合物放入50mL注射器中。使用汉克斯平衡盐溶液将注射器填充至25 mL的体积，并将过滤器连接到注射器的末端。将2 mL KRBH与3mM D-葡萄糖等分，并将2滴过滤的二硫酮溶液从50mL注射器中加入35mm培养皿中。
- 使用画笔，小心地将切片放入35毫米培养皿中。使用立体显微镜对切片进行成像，胰岛由红色二噻嗪染色指示。
6. 活力染色
注意:该协议的这一部分描述了如何使用钙黄绿素-AM和蓝色荧光SYTOX Blue评估切片活力（参见 材料表）。钙黄绿素-AM应在4μM的浓度下使用，SYTOX蓝应在1μM的浓度下使用。
- 等分2 mL含有3mM D-葡萄糖的KRBH，并加入2μL骨钙黄素-AM染料和SYTOX蓝以分离等分试样。涡旋混合物5秒。
- 向8孔盖玻片的每个孔中加入200μL含有3mM D-葡萄糖和钙黄素-AM染料的KRBH。
注:可以使用8孔腔盖玻片以外的替代板和/或成像室。
- 使用画笔，小心地将切片放入板的每个孔中，并将带有切片的板转移到37°C培养箱中20分钟。用含有3mM D-葡萄糖的KRBH洗涤切片两次。使用转移或巴斯德移液器小心地吸出KRBH，注意不要干扰切片。
- 将切片置于35毫米盖玻片底部培养皿中，其中含有2mL KRBH，3mM D-葡萄糖和2μLSYTOX Blue，浓度为每1mL溶液1μL。用切片锚覆盖切片，确保竖琴朝下的一面朝下。拍摄切片的图像。
注意:如果切片锚保持漂浮，请用含有3mM D-葡萄糖的KRBH在两侧湿润，以将其浸入溶液中。即使在染料加载期间，始终将切片保持在含有蛋白酶抑制剂的溶液中至关重要。所使用的活性染色剂可以适应特定的实验或显微镜设置。
7. 切片 Ca2+ 指示剂染色
注意:该协议的这一部分描述了如何使用俄勒冈绿色488 BAPTA-1，AM和SYTOX Blue在小鼠切片中染色Ca2 + 记录的切片（参见 材料表）。俄勒冈绿色488 BAPTA-1，AM应以5.6μM的浓度使用，SYTOX Blue应以1μM的浓度使用。在人体切片中，Fluo-4-AM应以6.4μM的浓度使用。
- 等分2毫升含有3 mM D-葡萄糖的KRBH，加入7μL俄勒冈绿色488 BAPTA-1，AM并涡旋混合物5秒。
注意:对于人体组织切片，请使用Fluo-4-AM而不是Oregon Green 488 BAPTA-1，AM。Fluo-4-AM更可取，因为当细胞内Ca2 + 浓度增加时，它更亮;然而，它在小鼠胰腺组织中不能很好地加载。该协议与上述Fluo-4-AM相同，但Fluo-4-AM只需要孵育30分钟。
- 将200μL含有3mM D-葡萄糖和染料的KRBH加入8孔腔盖玻片的每个孔中。使用画笔，小心地在腔室盖玻片的每个孔中放置一片。将带有切片的腔室盖玻片转移到37°C培养箱中45分钟。
- 用含有3mM D-葡萄糖的KRBH洗涤切片两次。使用转移或巴斯德移液器小心地用3mM D-葡萄糖吸出KRBH，注意不要干扰切片。
- 将切片放入含有3 mM D-葡萄糖和SYTOX Blue的KRBH的成像板或腔室中，浓度为每1 mL 1μL，并用切片锚覆盖，确保竖琴朝下。拍摄切片的图像。
注意:在该协议中，使用35mm培养皿，其中装有2mL含有3mM D-葡萄糖和2μLSYTOX Blue的KRBH。如果切片锚保持漂浮，请用含有3mM D-葡萄糖的KRBH在两侧润湿它，以将其浸没在溶液中。
8. 鼠标切片 Ca2+ 记录
注意:以下部分描述了如何使用俄勒冈绿色488 BAPTA-1，AM和SYTOX Blue在小鼠胰腺组织切片上执行Ca2 + 记录。在共聚焦激光扫描显微镜上进行成像（有关详细信息，请参见 材料表 ）。用于SYTOX Blue的激光器为405 nm，俄勒冈绿488 BAPTA-1，AM为488 nm，反射率为638 nm。HyD探测器用于俄勒冈绿色488 BAPTA-1，AM。光电倍增管（PMT）探测器用于反射率和SYTOX Blue。Ca2 + 成像方案与人胰腺组织切片相同，除了使用Fluo-4-AM作为指示剂。激光功率水平、增益和针孔尺寸应根据样品和特定小岛成像进行调整。通常，1.5个通风单元的针孔和1%的激光功率是很好的起点。
- 记录前至少1小时，打开显微镜并将台顶或笼式培养箱平衡至37°C。 取下盖子后，将装有切片的35毫米盖玻片底部培养皿放在舞台上。通过将显微镜设置为10倍物镜和明场模式进行对焦。通过在切片中查找橙褐色椭圆形来使用明场定位胰岛。
- 找到可能的胰岛后，将显微镜切换到共聚焦成像模式。要通过反射率确认胰岛，请打开638 nm激光器，将激光功率设置为1%至2%，然后关闭通常可去除反向散射光的638 nm陷波滤光片。将PMT检测器上的检测限设置为约20 nm的带宽，以638 nm为中心。
注:请谨慎操作，因为在反射模式下操作显微镜可能会损坏探测器。由于内分泌组织的高颗粒度，反射光现在可以用来定位胰岛。胰岛将在这个反射通道上显示为一组明亮的反向散射颗粒细胞。
- 要查看SYTOX蓝光，请打开405 nm激光和PMT探测器，并将激光功率设置为1%至2%。使用载物台控制器的 X 和 Y 旋钮将感兴趣的小岛居中置于视野中。找到感兴趣的小岛并通过反向散射确认后，切换到20倍物镜并放大，使小岛占据大部分帧。
- 取z-stack的胰岛，z步长为1.5μm。找到胰岛的最佳光学部分，其中大多数细胞是活的（SYTOX Blue阴性），并且用俄勒冈绿色488 BAPTA-1，AM或Fluo-4-AM很好地加载。
注意:看到大量染料超载并且非常明亮的细胞并不罕见。这些可能是垂死的胰腺细胞，其中内质网中的Ca2 + 储存可能被释放，导致高水平的负荷;这些不是理想的记录单元格。寻找已明确加载染料但不会使检测器过度饱和的细胞，以便在细胞质Ca2 + 水平波动时可见亮度增加。切片内胰岛的染料负载是可变的;然而，染料通常通过〜10-15μm的胰岛很好地加载。然而，如果细胞在组织深处，染料上样可能很难可视化。
- 为防止录制过程中染料褪色，请确保488 nm通道上的激光功率不超过2%。将针孔增加到2个通风单元，以较低的激励功率收集更多信号。
- 将显微镜设置为在XYZT模式下记录。优化设置以将帧速率降低到每帧2秒或更低。
注:可帮助降低帧速率的设置调整包括打开双向扫描、减少或关闭线平均以及提高扫描速度。
- 优化设置后，记录几分钟的基础活动。
注意:组织活力的另一个良好指标是细胞是否在记录基础活动期间表现出活性并明显闪烁。
- 在给定的时间点使用200μL微量移液器将100μL20x浓缩葡萄糖和KRBH中的KCl加入到板中，以达到16.7mM葡萄糖或30mM KCl的最终浓度。
注意:请小心添加溶液，注意在录制过程中不要干扰切片。确保不要用微量移液管碰到板。通常看到组织对这些刺激做出反应而收缩。Ca2 +通量记录在ImageJ18中处理和定量。使用ImageJ软件，通过手动选择感兴趣区域（ROI）在细胞中测量俄勒冈绿色488 BAPTA-1，AM的染色强度。通过将后期时间点的荧光值除以细胞的初始荧光值（F / F0）来计算这些ROI的荧光强度。灌注系统可以与专门的成像室一起使用，以动态地管理切片的溶液，而不是手动添加它们。灌注系统和成像室的建议可以在材料表中找到。
9. 活胰腺切片中小鼠T细胞的染色
注意:该方案的这一部分描述了如何在小鼠切片中染色免疫细胞。使用的小鼠菌株是NOD。Rag1-/-.AI4 α / β 因为该模型持续发展为具有严重炎的疾病。该小鼠中的CD8 + T细胞都靶向胰岛素的表位，允许使用藻红素（PE）标记的胰岛素-Db 四聚体15。CD8抗体应以1:20的浓度使用，胰岛素四聚体应以1:50的浓度使用。
- 等分100μL含有3mM D-葡萄糖的KRBH，加入2μLPE胰岛素四聚体和5μL别癣菌蓝蛋白（APC）CD8抗体，并涡旋混合物5 s。
- 将100μL含有3mM D-葡萄糖的KRBH以及四聚体和抗体加入8孔腔盖玻片的孔中。使用画笔，小心地将切片放入腔室盖玻片的孔中。将带有切片的腔室盖玻片转移到37°C培养箱中30分钟。
- 用含有3 mM D-葡萄糖的2 mL KRBH洗涤切片两次。使用转移或巴斯德移液器小心地用3mM D-葡萄糖吸出KRBH，注意不要干扰切片。
- 将切片放入35毫米盖玻片底部培养皿中，其中含有KRBH，其中含有3mM D-葡萄糖和SYTOX Blue，浓度为每1 mL1μL，并用切片锚覆盖，将竖琴朝下的一侧放置。拍摄切片的图像。
注意:如果切片锚保持漂浮，请用含有3mM D-葡萄糖的KRBH在两侧湿润，以将其浸入溶液中。稀释后的抗体和四聚体可重复使用一次。染色两片后，应制作新鲜的抗体混合物。
10. 记录小鼠免疫细胞
注意:以下部分描述了如何使用CD8抗体，PE胰岛素四聚体和SYTOX Blue在小鼠胰腺组织切片上进行免疫细胞记录。成像设置如第 8 节所述。录制以800×800像素分辨率进行。用于SYTOX Blue的激光器为405 nm，用于胰岛素四聚体的激光为488 nm，用于CD8抗体和反射率为638 nm。HyD检测器用于CD8抗体和PE胰岛素四聚体。PMT探测器用于反射率和SYTOX Blue。免疫细胞成像方案对于人胰腺组织切片是相同的，除了对人体组织使用不同的抗体和抗原复合HLA多聚体。对于小鼠组织中的胰岛素四聚体染色和人体组织中的HLA多聚体染色，应使用免疫细胞共染色来验证特定抗原反应性T细胞的存在。这里使用了抗CD8抗体。抗体，如抗CD3或抗CD4，也可以根据靶细胞群使用。
- 记录前至少1小时，打开显微镜，并将台顶培养箱平衡至37°C。 将包含切片的35毫米盖玻片底培养皿固定在舞台上。通过在明场模式下设置10倍物镜来聚焦显微镜。使用明场模式定位小岛，方法是在切片中查找橙褐色的椭圆形。
- 通过按下显微镜触摸屏控制器上的CS按钮，将显微镜切换到共聚焦成像。要通过反射率查看胰岛，请打开638激光和PMT探测器，将激光功率设置为1%至2%，然后关闭陷波滤波器。
注意:由于内分泌组织的粒度增加，反射光现在可用于定位胰岛。胰岛将在此通道上显示为一组明亮的颗粒细胞。
- 要查看SYTOX Blue，CD8抗体和胰岛素四聚体，请检查激光功率是否在1%至2%之间。使用以下设置查看三个中的每一个:对于SYTOX Blue，打开405 nm激光和PMT探测器;对于CD8抗体，打开HyD检测器;要查看胰岛素四聚体，请打开488nm激光和HyD检测器。
- 使用载物台控制器的 X 和 Y 旋钮将感兴趣的小岛居中置于视野中。找到感兴趣的小岛后，切换到20倍物镜，然后放大，使小岛占据大部分帧。取z-stack的胰岛，z步长为1.5μm。找到胰岛的最佳光学部分（一系列5至10个部分），其中大多数细胞是活的（SYTOX Blue阴性），并且任何周围的免疫细胞都处于焦点中。
注意:尝试找到胰岛周围或浸润有多个CD8阳性和胰岛素四聚体阳性细胞的框架。
- 将显微镜设置为在XYZT模式下记录。优化设置，以在几个小时内每 20 分钟记录一次所选步骤的 Z 轴堆栈。
注意:如果可能，最好在可以控制温度和CO2 水平的成像室中进行这些记录，特别是在记录超过四个小时时。在过夜记录的情况下，可以将过量的抗体添加到培养基中以补偿T细胞受体循环和染料褪色。此外，不同的荧光团可用于T细胞抗体。根据经验，远红范围内的抗体对T细胞最有效。