观察活胰腺组织切片中的胰岛功能和胰岛-免疫细胞相互作用

Summary

本研究介绍了活胰腺组织切片在胰岛生理学和胰岛免疫细胞相互作用研究中的应用。

Abstract

活的胰腺组织切片允许在完整的胰岛微环境中研究胰岛的生理学和功能。切片由嵌入琼脂糖中的活人和小鼠胰腺组织制备，并使用振动切片机切割。这种方法允许组织保持活力和功能，除了保留潜在的病理，如1型（T1D）和2型糖尿病（T2D）。切片方法通过维持构成胰腺内分泌和外分泌组织的复杂结构和各种细胞间相互作用，为胰腺的研究提供了新的方向。该协议展示了如何对胰腺切片内的活内源性免疫细胞进行染色和延时显微镜检查，以及胰岛生理学评估。此外，可以使用主要的组织相容性复合物多聚体试剂来改进这种方法，以识别胰岛细胞抗原特异性的免疫细胞群。

Introduction

胰腺受累是胰腺炎、T1D 和 T2D1^，2，3 等疾病的特征性特征。孤立胰岛功能的研究通常涉及将胰岛从周围环境中移除⁴。开发了活胰腺组织切片方法，以允许研究胰腺组织，同时保持完整的胰岛微环境并避免使用应激的胰岛分离程序^5，6，7。来自人类供体组织的胰腺组织切片已被成功用于研究T1D，并且除了免疫细胞浸润之外，还显示出β细胞丢失和功能障碍的过程^{8，9，10，11，12，13}。活胰腺组织切片法可应用于小鼠和人胰腺组织^5，6<....

Protocol

注意:所有使用小鼠的实验方案均已获得佛罗里达大学动物护理和使用委员会（201808642）的批准。来自两性组织供体的人类胰腺切片是通过佛罗里达大学糖尿病胰腺器官供体网络（nPOD）组织库获得的。根据器官捐赠法律法规，与nPOD合作的认证器官采购组织从尸体器官捐献者身上摘取了人类胰腺，并被佛罗里达大学机构审查委员会（IRB No. 392-2008）归类为"非人类受试者"，免除了同意的需要。专门用于该项目的nPOD组织被佛罗里达大学IRB（IRB20140093）批准为非人类。该协议第1-3节的目的是解释如何成功解剖小鼠，准备和处理胰腺，并产生活的胰腺组织切片。应提前准备溶液，食谱可以在 补充表1中找到。在这些协议步骤中，时间是最关键的因素。一旦小鼠被处死，组织活力将开始下降。此协议的所有三个部分都需要尽快完成，直到生成所有必要的切片。

1. 小鼠胰腺切片的生成准备

1. 将刀片夹在振动器刀片架上，但不要将其连接到振动切片机上。
2. 在微波炉中融化 100 mL 1.25% w/v 低熔点琼脂糖。每隔1分钟操作一次微波炉，如果琼脂糖溶液开始沸腾，则停止微波炉10秒。重复此过程，直到琼脂糖熔化，并产生均匀的溶液。将瓶子放入37°C水浴中。
   注意:低琼脂糖浓度是小鼠胰腺密度较低的原因。
3. 将 10 mL 鲁尔锁式注射器与 3 mL 温热琼脂糖一起填充。将 27 G 25 mm 针头安装到注射器上....

Results

该协议将产生适合功能研究和免疫细胞记录的活胰腺组织切片。明场和反射光下的切片外观如图 1A，B所示。如前所述，胰岛可以使用反射光在切片中找到，因为它们的颗粒度增加，由于其胰岛素含量而发生（图1C），并且在使用反射光时与背景组织相比被清楚地观察到。应在切片生成后评估生存能力，如果超过20%的胰岛不可行，则不应记录胰岛。具有高生存能力的胰岛如图 1D所示，而处理不良的切片示例如 补充图1所示。具有低活力的胰岛将具有严重的SYTOX蓝色染色，并且组织将被死细胞的染色核覆盖。此外，钙黄素-AM和^{Ca2 +} 指示剂，如俄勒冈绿色488 BAPTA-1，这里使用的AM和Fluo-4-AM在死细胞中不能很好地加载。如果小岛是可行的，并且如果指示器在整个小岛中加载，则应选择小岛进行^{Ca2 +} 记录。^{Ca2 +} 指示剂上样指示细胞活力，因为该方案.......

Discussion

该协议的目的是解释胰腺切片的产生以及在功能和免疫学研究中使用切片所需的程序。使用活胰腺切片有很多好处。然而，有几个关键步骤对于组织在所描述的实验方案期间保持活力和有用至关重要。必须快速工作。应尽量减少注射胰腺和在振动切片机上产生切片之间的时间长度，以保持组织的活力。通过在切片之前将胰腺保持在冷ECS中，而不是室温ECS，还可以提高生存能力。重要的是，切片不应在没有蛋白酶抑制剂的培养基中。当切片在没有蛋白酶抑制剂的情况下孵育时，存活率会大大降低。

当切片在染料加载期间短暂地没有抑制剂时，尽管在切片中仍然可见基础活性，但无法再记录响应高葡萄糖和KCl的^{Ca2 +}通量。所有与活切片一起使用的溶液，包括带有3mM D-葡萄糖静息溶液的KRBH，抗体孵育溶液以及任何培养基，都必须含有浓度为每mL0.1mg的蛋白酶抑制剂。用于切片成像的指示板可以根据实验目标和显微镜激光的可用性进行修改。有许多不同颜色的细胞活力染料可用于代替此处使用的SYTOX蓝（见材料表）。对于^{Ca2 +}实验，Fluo-4-AM在人体组织中效果很好.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 型手术刀手柄	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES 缓冲液，1M 溶液
10 cm 未处理的培养皿	Corning	430591
10 mL Luer-Lok 注射器	BD	301029	BD 注射器，带 Luer-Lok 尖端
27 G 针	BD	BD 305109	BD 通用和 PrecisionGlide 皮下注射针头
35 mm 盖玻片底部培养皿	Ibidi	81156	µ-培养皿 35 mm，高
50 mL 注射器	BD	309653
8 孔腔室盖玻片	Ibidi	80826	µ-Slide 8 孔
APC 抗小鼠 CD8a 抗体	Biolegend	100712
BSA	Fisher科学199898
氯化钙	Sigma	C5670	CaCl2
氯化钙二水合	Sigma	C7902	CaCl2（二水合物）
紧凑型数字摇臂	Thermo Fisher Scientific	88880020
共聚焦激光扫描显微镜	Leica	SP8	针孔 = 1.5-2 通风单位;使用 10x/0.40 数值孔径 HC PL APO CS2 DRY 和 20x/0.75 数值孔径 HC PL APO CS2 DRY 物镜在 512&thinsp 处采集;& 次;稀薄512 像素分辨率
D-（+）-葡萄糖	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
二硫酮	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	二甲基亚砜
乙醇	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm 组织培养皿	康宁	353001	Falcon Easy-Grip 组织培养皿
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 手术刀片	电子显微镜科学	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	细胞渗透性 Ca2+ 指示剂
凝胶控制超级胶	乐泰	45198
Graefe 镊子	精细科学工具	11049-10
硬化精细剪刀	精细科学工具	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks 平衡盐溶液
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
冰桶	Fisherbrand	03-395-150
异氟醚	Patterson兽医	NDC 14043-704-05
约翰霍普金斯大学斗牛犬夹	Roboz外科商店	RS-7440	直;500-900 克压力;1.5英寸长度
	Kimwipes Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science™Kimwipes&贸易;Delicate Task Wipers，2 层
LIVE/DEAD 活力/细胞毒性试剂盒	Invitrogen	L3224	该试剂盒包含钙黄绿素-AM 活细胞染料。
低葡萄糖 DMEM	康宁	10-014-CV
氯化镁六水合	Sigma	M9272	MgCl2（六水合物）
硫酸镁七水	Sigma	M2773	MgSO4（七水合物）
磁性加热平台	Warner Instruments	PM-1	动态刺激成像室平台记录
微波	GE	JES1460DSWW
Nalgene 针头过滤器	Thermo Fisher Scientific	726-2520
No.4 画笔	Michaels	10269140
开放式金刚石浴成像室	Warner Instruments	RC-26	用于动态刺激记录的成像室
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	细胞渗透性 Ca2+ 指示剂
过夜成像室	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	20012050	制备用于切片生成的琼脂糖
PE 标记的胰岛素四聚体	Emory Tetramer Research 核心	序列 YAIENYLEL
青霉素 链霉素	Gibco	15140122
氯化钾	Sigma	P5405	KCl
磷酸二氢钾	Sigma	P5655	KH2PO4
剃须刀片	显微镜科学	71998	用于振动切片机;双刃不锈钢，无涂层
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque 低熔点琼脂糖	Lonza	50101	制备用于切片生成的琼脂糖
锚	Warner Instruments	64-1421
切片锚定（动态成像）	Warner Instruments	640253	用于动态成像室
的切片锚定碳酸氢钠	Sigma	S5761	NaHCO3
氯化钠	Sigma	S5886	NaCl
磷酸钠一水合物	Sigma	S9638	NaH2PO4 （一水合物）
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522-1G	甘氨酸max（大豆）阶段的胰蛋白酶抑制剂
适配器	Warner Instruments	SA-20MW-AL	适合成像室，用于显微镜载物台上的动态刺激记录
载物台顶部培养箱	Okolab	H201
立体镜	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX 蓝色死细胞染色剂	Invitrogen	S34857	蓝色荧光核酸染色剂
转移移液管	Falcon	357575	Falcon™塑料一次性移液管
阀门控制系统	华纳仪器	VCS-8	动态刺激记录系统
振动切片机 VT1000 S	徕卡	VT1000 S
水浴	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp 通用豪华水浴 GPD 02