使用同种来源抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用

摘要

本方案描述了如何使用同一物种来源的初级抗体进行双重标记免疫荧光，以研究宿主-病原体相互作用。此外，该方案还可包含来自不同宿主的第三种抗体。此方法适用于任何类型的细胞和病原体。

摘要

如今，已有多种分子工具可用于研究寄生虫与宿主细胞之间的相互作用。然而，在获取可识别寄生虫中特定细胞结构和蛋白质的商用单克隆或多克隆抗体方面仍存在一些限制。此外，可用于标记锥虫科原虫的商业抗体种类较少。通常，针对寄生虫的多克隆抗体需自行制备，且可能在与其他同种动物来源的抗体联合使用时带来更大挑战。本实验方案展示了如何利用同一种动物来源的多克隆和单克隆抗体进行双重标记免疫荧光染色，以研究宿主细胞与病原体之间的相互作用。实现双重标记免疫荧光的关键在于：首先孵育小鼠多克隆抗体，随后加入与任意荧光染料偶联的小鼠IgG二抗进行孵育。之后，必须增加一个额外的封闭步骤，以防止残留的初级抗体被下一个二抗识别。接着，在适当的时间点向样本中加入小鼠单克隆抗体及其特异性的IgG亚类二抗（与另一种荧光染料偶联）。此外，还可通过引入第三种不同物种来源的抗体实现三重标记免疫荧光染色。同时，细胞核和肌动蛋白等结构也可随后使用其特异性染料或标记物进行染色。因此，本文所述方法可适用于任何初级抗体来源受限的细胞体系。

引言

在细胞水平上研究病原体与宿主细胞的相互作用，可为疾病发生机制提供关键信息，因为不同类别的病原体 （如病毒、细菌和原生动物） 能够感染大多数类型的宿主细胞^1,2,3,4。该研究还有助于发现和鉴定潜在的治疗靶点，从而减缓或抑制病原体的生长。在活体条件下，机体产生的抗体负责识别自身成分、病毒抗原、细菌组分或其产物、真菌、寄生虫以及其他外来物质⁵。

为此，抗体是广泛使用的工具，主要用于了解细胞结构和蛋白质的定位与功能。多项使用多重抗体标记的研究表明，额外的封闭步骤有助于提高免疫定位的特异性。此外，大多数已报道的实验方案均采用特定的商业单克隆抗体，包括来自相同宿主物种的抗体^{6,7,8,9,10,11,12,13,14}。

通常，双重标记免疫荧光技术使用来自不同物种的两种抗体，对目标细胞结构、病原体以及宿主细胞进行染色，以观察它们之间的相互作用。然而，当缺乏针对某些病原体的商业化单克隆或多克隆抗体时，进行双重标记就会遇到困难。尽管目前已有市售的抗体偶联试剂盒，可通过琥珀酰亚胺酯反应将一抗直接与荧光染料偶联¹⁵，但这些试剂盒往往价格昂贵，且需要足够量的抗体用于标记。鉴于上述限制，我们成功开发了一种双重免疫荧光方法，使用来自同一物种的两种不同一抗，用于研究Trypanosoma brucei中的蛋白质定位¹⁶。然而，对于包括Trypanosoma cruzi在内的胞内寄生虫，该方法尚未被证实可行。本文中，我们展示了如何利用来自同一物种且不发生交叉反应的一抗，对胞内T. cruzi寄生虫及其宿主细胞进行双重标记免疫荧光染色。此外，通过引入来自另一物种的第三种抗体，我们还建立了三重免疫荧光标记方法。这些方法在抗体来源受限时尤为有用，并可应用于任何类型的细胞。

方案

1. 细胞与寄生虫培养

1. 在含有RPMI培养基的25 cm² 细胞培养瓶中培养购自美国模式培养物集存库（CCL-7）的LLC-MK2（恒河猴肾上皮）细胞，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）以及抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），于37 °C、5% CO₂条件下培养¹⁷。
2. 按照先前报道的方法¹⁸，用克氏锥虫（Y株）感染LLC-MK2细胞。
3. 收集感染后的LLC-MK2细胞上清液（5 mL）至15 mL细胞培养锥形离心管中，在22 °C下以500 × g离心10分钟以去除细胞碎片。将离心管置于37 °C环境中静置10分钟，使上清液中的上鞭毛体自由游动至液体上层。
4. 将上清液转移至新的锥形管中，在22 °C下以2500 × g离心15分钟。弃去上清液，将含有寄生虫的沉淀重悬于完全RPMI培养基中，通过血球计数板（Neubauer计数室）计数以确定细胞密度。

2. 对照免疫荧光实验方案

注意：固定后，含有盖玻片的培养板可在 1x PBS（pH 7.2）中于 4 °C 保存一周。保存时需确保细胞尚未经过通透化步骤。

1. 将LLC-MK2细胞（2 × 10⁴）接种于24孔板中，每孔含有经紫外灭菌的圆形盖玻片，并加入RPMI培养基，培养16小时。
2. 对于感染组细胞，将含有T. cruzi（步骤1.4）的上清液按感染复数（MOI）10:1的比例加入各孔，感染6小时。用PBS溶液对含有感染和未感染细胞的盖玻片各清洗5次，随后用含2%多聚甲醛的1×PBS（pH 7.2）在室温（RT）下固定10分钟。
3. 用1×PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片3次，每次5分钟。
4. 用含0.2% IGEPAL CA-630的1×PBS（pH 7.2）在室温下对盖玻片进行通透处理，持续10分钟。
5. 用1×PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。
6. 在室温下用封闭液（含2% BSA的1×PBS，pH 7.2）孵育盖玻片30分钟。
7. 在室温下，将盖玻片与小鼠单克隆抗hnRNPA1抗体（稀释比例1:200）或小鼠多克隆抗TcFAZ抗体（稀释比例1:100）在封闭液中孵育30分钟。
8. 用1×PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。
9. 在室温下，将盖玻片与Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG F(ab')2（H+L）二抗（1:600稀释）以及Alexa 594标记的鬼笔环肽（1:300稀释）共同孵育30分钟，以标记宿主细胞中的肌动蛋白丝（F-actin），上述试剂均用封闭液稀释。
10. 用1×PBS（pH 7.2）洗涤3次，每次5分钟。
11. 在载玻片表面滴加少量含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂。
12. 使用镊子将盖玻片轻轻倾斜放入封片剂中，避免产生气泡。待其干燥后，可根据需要对盖玻片进行封固。

3. 使用同一宿主产生的单克隆和多克隆抗体进行双重标记免疫荧光实验方案

1. 重复上述步骤 2.1 至 2.6。
2. 将含有感染和未感染细胞的盖玻片与实验室自制的小鼠多克隆抗 TcFAZ 抗体（1:100）在封闭液中稀释后，在室温下孵育 30 分钟。
3. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
4. 在室温下，将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa Fluor 647 标记的山羊抗小鼠 IgG F(ab')2 (H+L) 抗体（1:600）孵育 30 分钟。
5. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
6. 使用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（0.12 mg/mL），在室温下进行第二次封闭步骤，孵育 30 分钟。
7. 用 pH 7.2 的 1× PBS 洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟；然后在室温下与小鼠单克隆抗 hnRNP A1 IgG2b 抗体（1:200）孵育 30 分钟。
8. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
9. 将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG2b 抗体（1:600）以及 Alexa 594 标记的鬼笔环肽（1:300）在室温下共同孵育 30 分钟。
10. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
11. 重复上述步骤 2.8 至 2.10。

4. 添加来自不同宿主物种的第三种多克隆抗体的三重标记免疫荧光实验方案

注意：进行额外标记时，需注意IgG亚类和抗体同种型，并按以下顺序使用抗体：1. 小鼠多克隆抗体，2. 兔多克隆抗体，3. 第二封闭步骤，4. 小鼠单克隆抗体。应根据共聚焦显微镜所配备的激光器类型，选择合适的荧光素标记的二抗。

1. 重复上述步骤 2.1 至 2.6。
2. 在完成步骤 3.2 至 3.5（洗涤步骤）后，加入用封闭液稀释的兔多克隆抗体，在室温下孵育 30 分钟。
3. 用 1× PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
4. 将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa 647 标记的山羊抗兔 IgG 抗体（1:600）孵育 30 分钟。
5. 用 1× PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。
6. 使用用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG（H+L）（0.12 mg/mL）在室温下封闭 30 分钟。
7. 用 1× PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟，然后与用封闭液稀释的小鼠单克隆 IgG 亚类抗体孵育 30 分钟。
8. 用 1× PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。
9. 将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa 594 标记的特异性山羊抗小鼠 IgG 亚类抗体（1:600）孵育 30 分钟。
10. 用 1× PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。

5. 共聚焦成像采集

1. 使用共聚焦显微镜分析免疫荧光样品，物镜为63倍油镜，通过光电倍增管（PMT）和混合探测器（HyD）检测荧光信号。
   注：本实验采用圣保罗大学里贝朗普雷图医学院共聚焦显微镜多用户实验室（LMMC）的设备设置。
2. 以分通道方式采集所有共聚焦图像，使用 Adobe Photoshop 进行图像处理。

结果

在此，我们展示了当由于缺乏可识别锥虫体中特定结构和蛋白质的商业抗体而导致抗体来源有限时，如何通过免疫荧光研究宿主-寄生虫相互作用。

在锥虫科生物中， T. cruzi 具有最复杂的生活周期之一，涉及在脊椎动物和无脊椎动物宿主之间的一系列不同发育阶段 ¹⁹. 在……期间 T. cruzi 生活周期，在哺乳动物感染的早期阶段，循环型前鞭毛体通过涉及寄生虫和脊椎动物宿主细胞中多种分子的过程侵入细胞 ^19,20. 为研究这些过程，本实验室常规自制针对特定蛋白质的多克隆抗体 T. cruzi, T. brucei 和 利什曼原虫属^16,21,22...

讨论

本文介绍了一种利用同一宿主物种来源的两种不同抗体，在Trypanosoma cruzi感染细胞中进行双重免疫标记的实验方案。为了更详细地研究感染的影响，可利用该方案对标记宿主细胞内的结构（如细胞核或胞质细胞器）进行可视化。此外，该方法也可应用于包埋后超薄切片的免疫胶体金标记技术。该策略有助于克服在研究锥虫科原虫及其他寄生虫时可用抗体种类有限的难题。

此外，我们的实验方案显示，可在同一免疫荧光图像中同时标记细胞内寄生虫及其宿主细胞，实现两种真核生物的同时可视化，这与以往应用于不同类型组织的方案有所不同^{7,8,9,10,11,12,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 - IgG2b 抗体	Life technologies, USA	A21141	羊抗小鼠
AffiniPure 兔抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	抗小鼠抗体
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体	Life technologies, USA	A11017	羊抗小鼠
Alexa Fluor 594 IgG1 抗体	Life technologies, USA	A21125	羊抗小鼠
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体	Life technologies, USA	A21237	羊抗小鼠
抗 hnRNPA1 抗体 IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	小鼠抗体
抗 TcFAZ（T. cruzi FAZ 蛋白）抗体	本实验室	自制	小鼠抗体
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	白蛋白蛋白
去垢剂 Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	非离子型去垢剂
胎牛血清（FBS）	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	血清
青霉素-链霉素	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	抗生素
鬼笔环肽 Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	肌动蛋白标记物
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life technologies, USA	P36935	封片介质试剂
含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 1X 培养基	Corning, USA	10-040-CV	细胞培养基
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	生物试剂