本文介绍了一种利用三维生物反应器从滑膜液间充质干细胞中大量制备符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的外泌体的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）分泌的外泌体被认为是治疗软骨损伤和骨关节炎的有前景的候选药物。临床应用所需的外泌体需要大规模生产。为此，人滑膜液间充质干细胞（hSF-MSCs）被培养在微载体微珠上，随后在动态三维（3D）培养系统中进行培养。通过采用3D动态培养，本方案成功地从SF-MSC的培养上清液中获得了大规模的外泌体。外泌体通过超速离心法收集，并利用透射电子显微镜、纳米颗粒示踪分析和蛋白质印迹法进行鉴定。同时，还检测了外泌体的微生物安全性。外泌体检测结果表明，该方法能够生产出大量符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的外泌体。这些外泌体可用于外泌体生物学研究以及骨关节炎的临床治疗。
引言
骨关节炎（OA）由关节软骨及下方骨组织的退变引起，仍是导致残疾的重大难题1,2。由于软骨缺乏血液和神经供应，一旦受损，其自我修复能力极低3,4。在过去几十年中，基于自体软骨细胞移植（ACI）的治疗方法在骨关节炎治疗方面取得了一定进展5。为了分离和扩增软骨细胞，需从骨关节炎关节的非负重区域获取少量软骨组织，这一过程会对软骨造成损伤。此外，该治疗还需进行第二次手术以植入扩增后的软骨细胞6。因此，无需损伤软骨的一体化治疗方案正在被广泛探索。
间充质干细胞（MSCs）被认为是一种具有前景的骨关节炎（OA）治疗替代方案7,8。MSCs来源于多种组织，在特定刺激下可分化为软骨细胞。重要的是，MSCs可通过抗炎作用调节免疫反应via anti-inflammation9。因此，MSCs在OA治疗中具有显著优势，既能修复软骨缺损，又能调节免疫反应，尤其适用于炎症环境。在OA治疗中，来源....
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方案
本研究经深圳市第二人民医院人体伦理委员会批准。从人滑膜间充质干细胞（hSF-MSCs）分离外泌体的示意图 体外 方案如图所示 图1.
1. 人滑膜间充质干细胞的培养与鉴定
- 使用注射器和针头从临床骨关节炎（OA）患者中采集 20 mL 滑膜液（SF）。
- 对 OA 患者的膝关节进行消毒。用 7# 针头从髌骨外侧的股四头肌腱处穿刺进入关节腔。
- 抽取 10 mL 关节液。用输液贴覆盖穿刺部位，并按压 5 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 10 分钟后，弃去滑膜液上清液。
- 用 10 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 10 分钟，弃去 PBS。
- 用 10 mL 人源间充质干细胞（MSC）培养基重悬沉淀，细胞密度为 5 × 104 个细胞/mL（见材料表），然后将细胞悬液接种至 100 mm 培养皿中。
- 将培养皿置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育。
- 48 小时后，通过更换....
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结果
根据国际细胞治疗学会推荐的人类间充质干细胞定义的最低标准14,15，采用流式细胞术鉴定SF-MSCs的表面标志物。流式细胞术分析显示，本研究中培养的SF-MSCs符合间充质干细胞的鉴定标准。这些细胞对CD34、CD45和HLA-DR呈阴性（低于3%），对CD73、CD90和CD105呈阳性（高于95%）（图2）。
在倒置显微镜下观察到，SF-MSCs在微载体上增殖（图3A）。将细胞从二维培养板和三维培养微载体上消化并洗涤后，对细胞数量进行了计数。与二维培养相比，自第6天起，三维培养显著促进了SF-MSC的增殖速度（图3B）。结果显示为三次独立实验的结果。
为鉴定二维和三维培养的滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）来源的外泌体（Exos.......
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讨论
间充质干细胞由于具有自我更新能力、可分化为具有特定功能的组织细胞以及旁分泌效应，已在再生医学中得到广泛应用16,17。其中，外泌体介导的旁分泌效应尤其受到关注18。外泌体携带间充质干细胞的生物信息，能够发挥其生物学功能，并克服间充质干细胞在储存和运输方面的困难。因此，来源于间充质干细胞的外泌体已被用于治疗干预，在骨关节炎（OA）治疗中尤其受到广泛关注。
目前，有两种方法可用于扩增间充质干细胞（MSCs）：二维（2D）培养和三维（3D）培养19二维培养是培养间充质干细胞（MSCs）的一种常规方法 体外 低成本研究。然而，该方法耗时较长，且扩增规模有限。此外，间充质干细胞在二维微环境中的传代培养会迅速导致干性下降20,21，这是MSCs最关键.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
国家自然科学基金（编号：81972116，编号：81972085，编号：81772394）；广东省自然科学基金重点项目（编号：2018B0303110003）；广东省国际科技合作项目（编号：2021A0505030011）；深圳市科技计划项目（编号：GJHZ20200731095606019，编号：JCYJ20170817172023838，编号：JCYJ20170306092215436，编号：JCYJ20170413161649437）；中国博士后科学基金（编号：2020M682907）；广东省基础与应用基础研究基金（编号：2021A1515010985）；深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201612079）；广东省高水平医院建设专项经费。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher | 23227 | 蛋白质浓度测定 |
| 血琼脂平板 | 南京伊健生物化学科技有限公司 | P0903 | 细菌培养 |
| CD105 抗体 | Elabscience | E-AB-F1243C | 流式细胞术 |
| CD34 抗体 | Elabscience | E-AB-F1143C | 流式细胞术 |
| CD45 抗体 | BD Bioscience | 555483 | 流式细胞术 |
| CD63 抗体 | Abclonal | A5271 | 蛋白质印迹法 |
| CD73 抗体 | Elabscience | E-AB-F1242C | 流式细胞术 |
| CD81 抗体 | ABclonal | A5270 | 蛋白质印迹法 |
| CD9 抗体 | Abclonal | A1703 | 蛋白质印迹法 |
| CD90 抗体 | Elabscience | E-AB-F1167C | 流式细胞术 |
| 离心机 | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 培养箱 | Thermo | 细胞培养 | |
| 共聚焦激光扫描荧光显微镜 | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex 微载体 | GE Healthcare | 微载体 | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | 外泌体标记 |
| EZ-PCR 支原体检测试剂盒 | BI | 20-700-20 | 支原体检测 |
| 流式细胞仪 | Beckman | 间充质干细胞鉴定 | |
| Gene Pulser II 电穿孔系统 | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | 基因转染 |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR 抗体 | Elabscience | E-AB-F1111C | 流式细胞术 |
| 罗氏结核菌培养基 | 南京伊健生物化学科技有限公司 | T0573 | 结核分枝杆菌培养 |
| MesenGro 培养基 | StemRD | MGro-500 | 间充质干细胞培养 |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | 纳米颗粒追踪分析 |
| NTA 2.3 软件 | Malvern | 数据分析 | |
| Odyssey FC 成像系统 | 基因有限公司 | 荧光蛋白质印迹法 | |
| OptiPrep 电穿孔缓冲液 | Sigma | D3911 | 基因转染 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 | 蛋白酶抑制剂 |
| 核糖核酸酶 A | Qiagen | 158924 | 去除 RNA |
| 沙保弱琼脂平板 | 南京伊健生物化学科技有限公司 | P0919 | 真菌培养 |
| 透射电子显微镜（TEM） | JEM-1200EX | ||
| 旋转细胞培养系统（RCCS） | Synthecon | RCCS-4HD | 三维培养 |
| 超速离心机 | Beckman | Optima XPN-100 | 外泌体离心 |
参考文献
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B.
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重印与许可
