方法文章

3D生物反应器培养大规模制备滑液间充质干细胞来源外泌体

DOI：

10.3791/62221

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2022年7月26日

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1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

本文内容

摘要

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在这里，我们提出了一种使用3D生物反应器从滑液间充质干细胞产生大量GMP级外泌体的方案。

摘要

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间充质干细胞（MSCs）分泌的外泌体已被建议作为软骨损伤和骨关节炎治疗的有希望的候选者。临床应用的外泌体需要大规模生产。为此，在微载体珠上生长人滑液MSC（hSF-MSCs），然后在动态三维（3D）培养系统中培养。通过利用3D动态培养，该方案成功地从SF-MSC培养上清液中获得了大规模的外泌体。通过超速离心收获外泌体，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒透射测定和蛋白质印迹法进行验证。此外，还检测了外泌体的微生物安全性。外泌体检测结果表明，该方法可以产生大量良好生产规范（GMP）级外泌体。这些外泌体可用于外泌体生物学研究和临床骨关节炎治疗。

引言

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由关节软骨和潜在骨分解引起的骨关节炎（OA）仍然是导致残疾的严峻挑战1，2。没有血液和神经供应，软骨一旦受伤，自愈能力极小3，4。在过去的几十年中，基于自体软骨细胞植入（ACI）的疗法在OA治疗中取得了一些进展5。对于软骨细胞的分离和扩增，必须从OA关节的非承重区域收集小软骨，从而导致软骨损伤。此外，该程序将需要第二次手术来植入扩增的软骨细胞6。因此，无软骨损伤的OA治疗的一步疗法正在广泛探索中。

间充质干细胞（MSCs）被认为是OA治疗的有希望的替代品7，8。MSCs起源于多个组织，可以在特异性刺激下分化成软骨细胞。重要的是，间充质干细胞可以通过抗炎 调节 免疫反应9。因此，间充质干细胞通过修复软骨缺陷和调节免疫反应，特别是在炎症环境中，在OA治疗中具有显着优势。对于OA治疗，滑液MSCs（SF-MSCs）因其比其他MSC来源更强的软骨细胞分化能力而最近引起了广泛关注....

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方案

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本研究获得深圳市第二人民医院人类伦理委员会批准。从hSF-MSCs体外方案分离的外泌体示意图如图1所示。

1. 人类SF-MSCs培养与鉴定

  1. 使用注射器和针头从临床OA患者中收获20 mL SF。
    1. 对OA患者的膝关节进行消毒。用7#针从髌骨外股四头肌股四头肌肌腱穿刺入关节腔。
    2. 提取 10 mL 关节液。用输血棒覆盖穿刺部位并按压5分钟。
  2. 在4°C下以1，500× g 离心10分钟后弃去SF上清液。
  3. 用10mL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬细胞沉淀，在4°C下以1，500× g 离心10分钟，并弃去PBS。
  4. 用10 mL人MSC培养基以5 x 104个细胞 / mL的细胞密度重悬沉淀（参见 材料表），然后将悬浮液接种在100 mm培养皿中。
  5. 将培养皿在37°C下在含有5%CO2的气氛中孵育。
  6. 48小时后，通过更换培养基去除非贴壁细胞并用1x PBS洗涤。每 3 天更换一次培养基，持续 2 周。
  7. 收集细胞培养上清液。
  8. 使用流式细胞术鉴定S....

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结果

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流式细胞术用于鉴定SF-MSC的表面标志物，根据国际细胞治疗学会推荐的定义人类MSC的最低标准14，15。流式细胞术分析表明，本研究培养的SF-MSCs符合MSCs的鉴定标准。CD34、CD45和HLA-DR呈阴性（低于3%），CD73、CD90和CD105呈阳性（95%以上）（图2）。

在倒置显微镜下，注意到SF-MSCs在微载体上增殖（图3A）。从2D培养板和3D培养微载体中消化并洗涤细胞后，计数细胞数。与2D培养相比，3D培养诱导SF-MSC从6天开始更快地增殖（图3B）。介绍了三个独立实验的结果。

为了鉴定来自2D和3D培养的SF-MSC的外泌体（Exos），使用蛋白质印迹检测外泌体相关蛋白（CD63，CD9和CD81）和阴性.......

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讨论

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间充质干细胞因其自我更新、分化为具有特殊功能的组织细胞和旁分泌效应而广泛应用于再生医学16，17。值得注意的是，外泌体施加的旁分泌效应引起了人们的广泛关注18。外泌体携带MSCs的生物信息，发挥其生物学功能，克服MSC储存和运输麻烦等缺点。因此，来源于间充质干细胞的外泌体已被用于治疗干预，这在OA治疗中引起了最多的关注。

目前，有两种传播MSCs的方法，2D培养和三维（3D）培养19。2D培养是一种低成本培养MSC用于体外研究的传统方法。但是，它既耗时又具有有限的规模潜力。此外，MSC在2D微环境中的繁殖可以快速推断出干性20，21，这是MSCs最关键的特征之一。因此，2D培养不能满足MSC治疗的要求。在这项研究中，为了SF-MSCs在O.......

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披露

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提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

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国家自然科学基金（第81972116、第81972085、第81772394号）;广东省自然科学基金重点项目（No.2018B0303110003）;广东国际合作项目（No.2021A0505030011）;深圳市科技项目（编号）GJHZ20200731095606019，编号JCYJ20170817172023838，编号JCYJ20170306092215436，编号JCYJ20170413161649437）;中国博士后科学基金（No.2020M682907）;广东省基础与应用基础研究基金（No.2021A1515010985）;深圳市三明医药项目（SZSM201612079）;广东省高水平医院建设专项资金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BCA 检测试剂盒ThermoFisher23227蛋白浓度检测
血琼脂平板南京亿基生化科技有限公司P0903细菌培养
CD105 抗体ElabscienceE-AB-F1243C流式细胞术
CD34 抗体ElabscienceE-AB-F1143C流式细胞术
CD45 抗体BD Bioscience555483流式细胞术
CD63 抗体Abclonal A5271Western blotting
CD73 抗体ElabscienceE-AB-F1242C流式细胞术
CD81 抗体ABclonal A5270蛋白质印迹
CD9 抗体Abclonal A1703蛋白质印迹
CD90 抗体ElabscienceE-AB-F1167C流式细胞术
离心机Eppendorf离心机 5810R
CO2 培养箱热细胞培养
共聚焦激光扫描荧光显微镜蔡司LSM 800
CytodexGE Healthcare微载体
DilThermoFisherD1556外泌体标记
EZ-PCR 支原体检测试剂盒BI20-700-20支原体检测
流式细胞术贝克曼MSC 鉴定
基因脉冲 II 系统Bio-Rad Laboratories1652660基因转染
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software， Inc.版本 8.0.2
HLA-DR 抗体ElabscienceE-AB-F1111C流式细胞术
Lowenstein-Jensen 培养基南京亿基生化科技有限公司T0573结核分枝杆菌培养
MesenGroStemRDMGro-500MSC 培养
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300纳米颗粒跟踪分析
NTA 2.3 软件Malvern数据分析
Odyssey FCGene Company Limited荧光蛋白质印迹
OptiPrep电穿孔缓冲液SigmaD3911基因转染
蛋白酶抑制剂 混合物SigmaP8340蛋白酶抑制剂
RNase AQiagen158924RNA 的去除
沙氏琼脂板南京亿基生化科技有限公司P0919真菌培养
TEMJEM-1200EX
旋转细胞培养系统 （RCCS）SyntheconRCCS-4HD3D 培养
超速离心机BeckmanOptima XPN-100外泌体离心机
物 物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
  2. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B.

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