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方法文章

通过三维生物反应器培养大规模制备滑膜液间充质干细胞来源外泌体

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DOI：

10.3791/62221

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2022年7月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用三维生物反应器从滑膜液间充质干细胞中大量制备符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的外泌体的实验方案。

摘要

间充质干细胞（MSCs）分泌的外泌体被认为是治疗软骨损伤和骨关节炎的有前景的候选药物。临床应用所需的外泌体需要大规模生产。为此，人滑膜液间充质干细胞（hSF-MSCs）被培养在微载体微珠上，随后在动态三维（3D）培养系统中进行培养。通过采用3D动态培养，本方案成功地从SF-MSC的培养上清液中获得了大规模的外泌体。外泌体通过超速离心法收集，并利用透射电子显微镜、纳米颗粒示踪分析和蛋白质印迹法进行鉴定。同时，还检测了外泌体的微生物安全性。外泌体检测结果表明，该方法能够生产出大量符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的外泌体。这些外泌体可用于外泌体生物学研究以及骨关节炎的临床治疗。

引言

骨关节炎（OA）由关节软骨及下方骨组织的退变引起，仍是导致残疾的重大难题1,2。由于软骨缺乏血液和神经供应，一旦受损，其自我修复能力极低3,4。在过去几十年中，基于自体软骨细胞移植（ACI）的治疗方法在骨关节炎治疗方面取得了一定进展5。为了分离和扩增软骨细胞，需从骨关节炎关节的非负重区域获取少量软骨组织，这一过程会对软骨造成损伤。此外，该治疗还需进行第二次手术以植入扩增后的软骨细胞6。因此，无需损伤软骨的一体化治疗方案正在被广泛探索。

间充质干细胞（MSCs）被认为是一种具有前景的骨关节炎（OA）治疗替代方案7,8。MSCs来源于多种组织，在特定刺激下可分化为软骨细胞。重要的是，MSCs可通过抗炎作用调节免疫反应via anti-inflammation9。因此，MSCs在OA治疗中具有显著优势，既能修复软骨缺损，又能调节免疫反应，尤其适用于炎症环境。在OA治疗中，来源于滑膜液的MSCs（SF-MSCs）近年来受到广泛关注，因其软骨细胞分化能力较其他来源的MSCs更强10,11。值得注意的是，在骨科临床实践中，从关节腔中抽取炎性滑膜液是缓解OA患者疼痛症状的常规治疗方法。所提取的炎性滑膜液通常作为医疗废物处理。患者和医生均易于接受将自体来源的SF-MSCs用于OA治疗，且伦理争议极少。然而，SF-MSC疗法的应用受到致瘤风险、长期储存以及远距离运输障碍的限制。

外泌体由包括间充质干细胞（MSCs）在内的多种细胞分泌，携带了亲代细胞的大部分生物信息。作为一种无细胞疗法，外泌体已得到深入研究12,13。根据美国政府临床试验网站（ClinicalTrials.gov）提供的最新资源，目前已有更多大规模的外泌体临床研究在癌症、高血压以及神经退行性疾病等领域启动并开展。采用滑膜来源间充质干细胞（SF-MSC）外泌体治疗骨关节炎（OA）可能是一项令人期待且具有挑战性的尝试。符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的大规模外泌体生产是实现临床转化的关键。目前小规模外泌体分离通常基于二维（2D）细胞培养方法进行，但大规模外泌体生产策略仍需优化。本研究建立了一种在无异源成分条件下大规模培养SF-MSC并制备外泌体的方法。通过超速离心从细胞培养上清液中分离外泌体后，进一步验证了其安全性与功能。

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方案

本研究经深圳市第二人民医院人体伦理委员会批准。从人滑膜间充质干细胞（hSF-MSCs）分离外泌体的示意图 体外 方案如图所示 图1.

1. 人滑膜间充质干细胞的培养与鉴定

  1. 使用注射器和针头从临床骨关节炎（OA）患者中采集 20 mL 滑膜液（SF）。
    1. 对 OA 患者的膝关节进行消毒。用 7# 针头从髌骨外侧的股四头肌腱处穿刺进入关节腔。
    2. 抽取 10 mL 关节液。用输液贴覆盖穿刺部位，并按压 5 分钟。
  2. 在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 10 分钟后，弃去滑膜液上清液。
  3. 用 10 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 10 分钟，弃去 PBS。
  4. 用 10 mL 人源间充质干细胞（MSC）培养基重悬沉淀，细胞密度为 5 × 104 个细胞/mL（见材料表），然后将细胞悬液接种至 100 mm 培养皿中。
  5. 将培养皿置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育。
  6. 48 小时后，通过更换培养基并用 1× PBS 洗涤去除未贴壁细胞。每 3 天更换一次培养基，持续 2 周。
  7. 收集细胞培养上清液。
  8. 使用流式细胞术鉴定滑膜液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）。
    1. 消化第三代（P3）SF-MSCs，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，收集细胞沉淀。
      注：传代是指将细胞继代培养至另一培养皿中。从滑膜液中分离并首次接种于培养皿中的原代细胞标记为第零代（P0）。当细胞融合度达到约 75% 时，消化并脱离培养皿，接种至新的培养皿中，标记为第一代（P1）。
    2. 向细胞沉淀（5 × 104）中加入 400 µL 封闭缓冲液（含 1% BSA 的 1× PBS），室温（RT）静置 15 分钟。
    3. 在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL 1× PBS 中。
    4. 每管加入 1 µL CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、HLA-DR 单克隆荧光抗体（稀释比例 1:100）（见材料表），室温避光孵育 30 分钟。
    5. 用 1× PBS 洗涤两次，弃去上清液。收集细胞沉淀，并重悬于 100 µL 1× PBS 中。
    6. 使用流式细胞仪检测，每样本检测至 10,000 个细胞，采用 525/50 和 585/40 滤光片检测荧光信号。

2. 三维生物反应器细胞培养

  1. 微载体准备
    1. 将0.75 g干燥微载体（见材料表）溶胀，并在1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中水化（每克微载体使用50 mL DPBS），室温下至少孵育3小时。
    2. 倾去上清液，用新鲜DPBS（每克微载体50 mL）洗涤微载体5分钟。弃去PBS，更换为新鲜1×DPBS（每克微载体50 mL）。
    3. 通过高压灭菌（121 °C，15分钟，15 psi）对微载体进行灭菌。待灭菌后的微载体沉降后，倾去上清液。
    4. 在培养基中短暂冲洗微载体（每克微载体50 mL），室温下进行。待微载体沉降后，弃去上清液。
  2. 灌注式生物反应器
    1. 通过高压灭菌（121 °C，15分钟，15 psi）对生物反应器进行灭菌。
    2. 计数SF-MSCs数量，将2.5 × 107个SF-MSCs和微载体接种至生物反应器中，并加入符合GMP标准的MSC培养基（250 mL）进行灌注培养。
    3. 将生物反应器置于37 °C、含5% CO2的培养箱中，以15 rpm的转速旋转。每6天更换一次培养基。
    4. 培养14天后，收集细胞培养上清液和微载体用于进一步分析。

3. 外泌体鉴定与安全性检测

  1. 超速离心
    1. 将细胞培养上清液在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 10 分钟，收集上清液；弃去细胞碎片。
    2. 将上清液在 4 °C 条件下以 2,000 x g 离心 10 分钟，收集上清液；弃去较大的囊泡（凋亡小体和部分较大的微囊泡）。
    3. 将上清液再次在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 30 分钟，以去除较大的囊泡；收集沉淀物并将其重悬于 40 mL 的 1x PBS 中。
    4. 将重悬的沉淀物在 4 °C 条件下以 120,000 x g 离心 70 分钟，弃去上清液，并将含有外泌体的沉淀物重悬于 500 µL 的 1x PBS 中。
  2. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
    注意：每次运行时，以 30 µL/min 的流速将 500 µL 样品注入检测室。分析温度应控制在 24.4 °C–24.5 °C。
    1. 用无菌 1x PBS 将新分离的外泌体样品稀释至 1 mL，使颗粒浓度达到 107–109 /mL，并将其注入纳米颗粒追踪分析系统（参见材料表）。
    2. 根据制造商的说明书手动设置捕获和分析系统。通过激光散射观察颗粒，并以数字视频记录其布朗运动。
    3. 使用软件（参见材料表）对录制的视频进行分析，每次运行需追踪至少 200 个单独颗粒。
  3. 透射电子显微镜
    1. 用冷的 1x DPBS 中的 4% 多聚甲醛固定外泌体 5 分钟。
    2. 将 5 µL 外泌体样品滴加至铜网上。本实验中外泌体浓度为 1 mg/mL，由蛋白检测试剂盒定量（参见材料表）。
    3. 将外泌体在冰上用 3% 磷钨酸嵌入染色 10 分钟。去除多余的酸液，并在室温下干燥样品。
    4. 在 100 kV 加速电压下使用透射电子显微镜对外泌体样品进行成像。
  4. 蛋白质印迹
    1. 向外泌体中加入 300 µL 裂解缓冲液（1% Triton X-100，0.1% SDS，0.1 M Tris HCl，pH 7）以及蛋白酶抑制剂混合物（参见材料表）。
    2. 通过移液上下吹打混匀外泌体与裂解缓冲液，并在冰上静置 20 分钟。
    3. 将混合物在 4 °C 条件下以 9,391 x g 离心 10 分钟，收集上清液。使用蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度（参见材料表）。
    4. 加入 100 µL 的 4x 蛋白上样缓冲液，并在 100 °C 下加热 10 分钟。
    5. 上样 15 µL 浓度为 10 mg/mL 的蛋白样品，进行凝胶电泳（120 V，70 分钟），随后在 4 °C 条件下以 100 V 电转印 60 分钟。
    6. 通过荧光蛋白质印迹法检测非外泌体特异性标志物（calnexin）和外泌体生物标志物（CD9、CD63 和 CD81）（参见材料表）。
  5. 安全性检测
    1. 针对细菌、真菌和Mycobacterium tuberculosis的检测，执行步骤 3.5.2–3.5.5。
    2. 将 100 µL 外泌体溶液（1 mg/mL）接种至血琼脂培养平板（参见材料表），在 37 °C 培养 24 小时。
    3. 将 100 µL 外泌体溶液（1 mg/mL）接种至沙保弱氏琼脂培养基平板（参见材料表），在 35 °C 培养 48 小时。
    4. 将 100 µL 外泌体溶液（1 mg/mL）接种至罗氏培养基平板（参见材料表），在 37 °C 培养 3 周。
    5. 通过肉眼观察判断是否存在细菌、真菌和Mycobacterium tuberculosis菌落。
      注意：评估外泌体安全性的标准为培养平板上无微生物生长。
    6. 针对支原体检测，执行步骤 3.5.7–3.5.9。
    7. 将外泌体重悬于试剂盒提供的 50 µL 缓冲液中，并在 95 °C 加热 3 分钟。
    8. 使用支原体 PCR 检测试剂盒对外泌体溶液中的支原体进行扩增（参见材料表）。
    9. 在 1.5% 琼脂糖凝胶（120 V，30 分钟）上检测 PCR 产物。

4. 体外 外泌体功能检测

  1. 外泌体标记
    1. 将100 µL外泌体（1 mg/mL）用1 mM Dil（1000倍稀释）标记（参见 材料表）并在室温下孵育30分钟。
    2. 通过超速离心在 100,000 x g 条件下回收外泌体 g 70分钟。将沉淀重悬于500 µL的1x PBS中。
  2. Cy3-miR-140 模拟物加载至外泌体中
    1. 将1 µg/µL外泌体蛋白与5 µmol/mL Cy3-miR-140混合，总体积为400 µL电穿孔缓冲液（1.15 mM磷酸钾（pH 7.2）、25 mM氯化钾和21%（v/v）（参见 材料表).
    2. 将混合物转移至预冷的0.4 cm电穿孔杯中，使用基因转染系统在300 V/100 µF电容条件下进行电穿孔（参见 材料表).
    3. 电穿孔后立即在室温下孵育混合物30分钟，以确保外泌体膜完全恢复。
    4. 用一单位的RNase A处理混合物（参见 材料表孵育20分钟，以去除外泌体外的miRNA模拟物。
    5. 在120,000 x g条件下超速离心外泌体混合物 g 孵育90分钟，弃去上清液，并将外泌体重悬于500 µL的1×PBS中。
  3. 外泌体摄取实验
    1. 将软骨细胞（1 x 107在含1 mL添加10% FBS的DMEM/F12培养基的35 mm共聚焦培养皿中培养。
    2. 24小时后，用DiI标记的外泌体（100 ng/mL）或载有cy3-miR-140的外泌体（100 ng/mL）处理软骨细胞1小时。
    3. 用1×PBS洗涤3次，然后在室温下用DAPI（10 ng/mL）孵育10分钟。
    4. 使用适当的滤光片，在共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）中记录荧光信号（参见 材料表).

5. 统计分析

  1. 使用适当的统计软件进行统计分析。
    注：每个图中的代表性数据以均值 ± 标准差（SD）表示。使用统计软件对两组之间的比较采用学生 t 检验（Student's t-test）。对于多组之间的比较，则采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验。P 值 <0.05（*）、<0.01（**）或 <0.001（***）。

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结果

根据国际细胞治疗学会推荐的人类间充质干细胞定义的最低标准14,15，采用流式细胞术鉴定SF-MSCs的表面标志物。流式细胞术分析显示，本研究中培养的SF-MSCs符合间充质干细胞的鉴定标准。这些细胞对CD34、CD45和HLA-DR呈阴性（低于3%），对CD73、CD90和CD105呈阳性（高于95%）（图2）。

在倒置显微镜下观察到，SF-MSCs在微载体上增殖（图3A）。将细胞从二维培养板和三维培养微载体上消化并洗涤后，对细胞数量进行了计数。与二维培养相比，自第6天起，三维培养显著促进了SF-MSC的增殖速度（图3B）。结果显示为三次独立实验的结果。

为鉴定二维和三维培养的滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）来源的外泌体（Exos...

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讨论

间充质干细胞由于具有自我更新能力、可分化为具有特定功能的组织细胞以及旁分泌效应，已在再生医学中得到广泛应用16,17。其中，外泌体介导的旁分泌效应尤其受到关注18。外泌体携带间充质干细胞的生物信息，能够发挥其生物学功能，并克服间充质干细胞在储存和运输方面的困难。因此，来源于间充质干细胞的外泌体已被用于治疗干预，在骨关节炎（OA）治疗中尤其受到广泛关注。

目前，有两种方法可用于扩增间充质干细胞（MSCs）：二维（2D）培养和三维（3D）培养19二维培养是培养间充质干细胞（MSCs）的一种常规方法 体外 低成本研究。然而，该方法耗时较长，且扩增规模有限。此外，间充质干细胞在二维微环境中的传代培养会迅速导致干性下降20,21，这是MSCs最关键...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

国家自然科学基金（编号：81972116，编号：81972085，编号：81772394）；广东省自然科学基金重点项目（编号：2018B0303110003）；广东省国际科技合作项目（编号：2021A0505030011）；深圳市科技计划项目（编号：GJHZ20200731095606019，编号：JCYJ20170817172023838，编号：JCYJ20170306092215436，编号：JCYJ20170413161649437）；中国博士后科学基金（编号：2020M682907）；广东省基础与应用基础研究基金（编号：2021A1515010985）；深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201612079）；广东省高水平医院建设专项经费。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher23227蛋白质浓度测定
血琼脂平板南京伊健生物化学科技有限公司P0903细菌培养
CD105 抗体ElabscienceE-AB-F1243C流式细胞术
CD34 抗体ElabscienceE-AB-F1143C流式细胞术
CD45 抗体BD Bioscience555483流式细胞术
CD63 抗体Abclonal A5271蛋白质印迹法
CD73 抗体ElabscienceE-AB-F1242C流式细胞术
CD81 抗体ABclonal A5270蛋白质印迹法
CD9 抗体Abclonal A1703蛋白质印迹法
CD90 抗体ElabscienceE-AB-F1167C流式细胞术
离心机EppendorfCentrifuge 5810R
CO2 培养箱Thermo细胞培养
共聚焦激光扫描荧光显微镜ZEISSLSM 800
Cytodex 微载体GE Healthcare微载体
DilThermoFisherD1556外泌体标记
EZ-PCR 支原体检测试剂盒BI20-700-20支原体检测
流式细胞仪Beckman间充质干细胞鉴定
Gene Pulser II 电穿孔系统Bio-Rad Laboratories1652660基因转染
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Version 8.0.2
HLA-DR 抗体ElabscienceE-AB-F1111C流式细胞术
罗氏结核菌培养基南京伊健生物化学科技有限公司T0573结核分枝杆菌培养
MesenGro 培养基StemRDMGro-500间充质干细胞培养
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300纳米颗粒追踪分析
NTA 2.3 软件Malvern数据分析
Odyssey FC 成像系统基因有限公司荧光蛋白质印迹法
OptiPrep 电穿孔缓冲液SigmaD3911基因转染
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340蛋白酶抑制剂
核糖核酸酶 AQiagen158924去除 RNA
沙保弱琼脂平板南京伊健生物化学科技有限公司P0919真菌培养
透射电子显微镜（TEM）JEM-1200EX
旋转细胞培养系统（RCCS）SyntheconRCCS-4HD三维培养
超速离心机BeckmanOptima XPN-100外泌体离心

参考文献

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滑膜液外泌体间充质干细胞三维生物反应器培养外泌体分离微载体珠超速离心纳米颗粒追踪蛋白质印迹流式细胞术外泌体标志物
通过三维生物反应器培养大规模制备滑膜液间充质干细胞来源外泌体
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