高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

摘要

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道¹，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3 小时。

摘要

眼部疾病影响着全球数百万人，但人类组织样本的有限可及性严重阻碍了相关研究。由于小鼠在解剖结构和生理特性上与人类具有高度相似性，因此小鼠模型成为研究眼病病理生理机制的有力工具。视网膜色素上皮（RPE）的改变，包括形态和功能的变化，是多种眼部疾病共有的特征。然而，原代小鼠RPE细胞的成功分离与培养极具挑战性。本文是对Fernandez-Godino等人于2016年发表的实验方案所更新的视听版本，旨在高效地分离和培养原代小鼠RPE细胞。该方法具有高度可重复性，能够获得结构完整、极性良好且富含色素的RPE单层细胞，可在Transwell小室中稳定维持数周。该模型为研究眼病背后的分子与细胞机制开辟了新的途径，同时也为测试可用于治疗目前尚无有效疗法的重要眼病（包括遗传性视网膜病变和黄斑变性）的治疗策略提供了平台。

引言

本方案最初由Fernandez-Godino等人于2016年报道¹，描述了一种高效分离和培养小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，该方法可在Transwell板上于一周内形成具有功能性和极性的RPE单层细胞。 视网膜色素上皮 位于眼球内神经视网膜与布鲁赫膜之间的一层单层结构。该单层由高度极化且富含色素的上皮细胞构成，细胞间通过紧密连接相连，呈六边形排列，形似蜂巢²尽管视网膜色素上皮（RPE）在组织学结构上看似简单，但它执行着多种对视网膜和正常视觉循环至关重要的功能^2,3,4RPE单层的主要功能包括光吸收、为光感受器提供营养和更新、清除代谢终产物、调控视网膜下腔的离子稳态以及维持血-视网膜屏障^2,3视网膜色素上皮（RPE）在眼部免疫系统的局部调节中也具有重要作用^5,6,7,8....

方案

遵循了ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用声明的指南。

注意：该方法已在不同遗传背景的小鼠中证明有效，包括 C57BL/6J、B10.D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ 和白化小鼠，适用于不同年龄阶段。建议使用 8 至 12 周龄的小鼠以获取视网膜色素上皮（RPE）细胞。较年老小鼠的 RPE 细胞在培养中增殖能力较低，而较年轻小鼠的细胞数量较少且体积较小，因此需要合并来自不同个体的眼组织以获得可存活的培养物。

1. 试剂和膜插件的准备

1. 准备以下试剂。
   1. 制备 HBSS-H−（不含钙、不含镁的 HBSS 缓冲液 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 加入 99 mL 的 HBSS-（不含 Ca/Mg）缓冲液中。4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
   2. 制备 HBSS-H+（含钙、含镁的 HBSS 缓冲液 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 加入 99 mL 的 HBSS+（含 Ca/Mg）缓冲液中。4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
   3. 制备透明质酸酶溶液（1 mg/mL）：将 10 mg 透明质酸酶加入 10 mL 的 HBSS-H− 中，并使用 10 mL 注射器通过 0.4 µm 无菌注射器滤....

结果

本方案已用于从基因修饰小鼠中分离和培养视网膜色素上皮（RPE）细胞¹。在不同小鼠品系或性别之间未观察到差异。该研究结果有助于理解与年龄相关性黄斑变性等眼部疾病发病机制相关的若干重要方面，后者是老年人视力丧失的最常见原因⁹。按照本方案分离的RPE细胞在接种后24小时已完全贴附于膜插件上，并在72小时后表现出典型的RPE细胞大小、形态和色素沉积¹。一周后，由呈六边形的色素化RPE细胞形成高度极化的单层RPE细胞层，细胞间通过表达ZO-1的紧密连接相连，且可见双核结构（图1C、2）。透射电子显微镜图像显示细胞具有顶端微绒毛和基底褶皱（图1C）。RPE单层细胞的极性通过跨上皮电阻（TER）值得以确认，其平均值高于200 Ω×cm²，且随时间保持稳定（图2）。

通过吞噬作用实验.......

讨论

尽管此前已开发出多种小鼠RPE细胞分离与培养方法^{1,13,20,22,26,27}，但Fernandez-Godino的方法首次采用膜插件，使RPE细胞在体外培养中可高效生长数周^1,9。该方案的另一重大改进^1,9是使用酶解溶液替代机械剥离法来解离RPE细胞^1,13,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 ml BD Luer-Lok 尖端注射器，一次性	BD Biosciences	309604
15 ml 离心管	VWR International	21008-103
50 ml 离心管	VWR International	21008-951
Alpha 最低必需培养基	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
弯头显微镊子	WPI	501727
台式离心机	任意
CO2 培养箱	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
解剖显微镜	任意
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液，无钙，无镁	Gibco	14190144
Dumont #5 45° 医用生物学镊子，尖端 0.05 x 0.01 mm，长度 11 cm	WPI	14101
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon 易握透明聚苯乙烯细胞培养皿，35 mm	BD Biosciences	353001
胎牛血清	Hyclone	SH30071.03	经热灭活处理
Hank’s 平衡盐溶液，含钙和镁，无酚红	Life Technologies	14175095
Hank’s 平衡盐溶液，含钙和镁，无酚红 B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H-0396
层流罩	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
层粘连蛋白 1 mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	在 37°C 下用 PBS 稀释至 1 mg/ml
McPherson-Vannas 微型剪刀，长 8 cm	WPI	503216
非必需氨基酸 100X	Gibco	11140050
N1 添加剂 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
青霉素-链霉素	Gibco	15140-148
无菌 Bard-Parker 碳钢手术刀片，尺寸 11	Fisher-Scientific	08-914B
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T-0625
组织培养处理的 12 孔板	Fisher-Scientific	08-772-29
组织培养处理的 6 孔板	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell 支持膜，6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
三碘甲腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T-5516
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红	Gibco	25200056
镊子，Dumont #5 医用生物学，11 cm，弯头，不锈钢，尖端 0.02 x 0.06 mm Mod	WPI	500232
Vannas 剪刀，长 8 cm，不锈钢	WPI	501790
Whatman Puradisc 25 mm 注射器滤器，孔径 0.45μm	Fisher-Scientific	6780-2504