高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

摘要

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道¹，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3 小时。

摘要

眼部疾病影响着全球数百万人，但人类组织样本的有限可及性严重阻碍了相关研究。由于小鼠在解剖结构和生理特性上与人类具有高度相似性，因此小鼠模型成为研究眼病病理生理机制的有力工具。视网膜色素上皮（RPE）的改变，包括形态和功能的变化，是多种眼部疾病共有的特征。然而，原代小鼠RPE细胞的成功分离与培养极具挑战性。本文是对Fernandez-Godino等人于2016年发表的实验方案所更新的视听版本，旨在高效地分离和培养原代小鼠RPE细胞。该方法具有高度可重复性，能够获得结构完整、极性良好且富含色素的RPE单层细胞，可在Transwell小室中稳定维持数周。该模型为研究眼病背后的分子与细胞机制开辟了新的途径，同时也为测试可用于治疗目前尚无有效疗法的重要眼病（包括遗传性视网膜病变和黄斑变性）的治疗策略提供了平台。

引言

本方案最初由Fernandez-Godino等人于2016年报道¹，描述了一种高效分离和培养小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，该方法可在Transwell板上于一周内形成具有功能性和极性的RPE单层细胞。 视网膜色素上皮 位于眼球内神经视网膜与布鲁赫膜之间的一层单层结构。该单层由高度极化且富含色素的上皮细胞构成，细胞间通过紧密连接相连，呈六边形排列，形似蜂巢²尽管视网膜色素上皮（RPE）在组织学结构上看似简单，但它执行着多种对视网膜和正常视觉循环至关重要的功能^2,3,4RPE单层的主要功能包括光吸收、为光感受器提供营养和更新、清除代谢终产物、调控视网膜下腔的离子稳态以及维持血-视网膜屏障^2,3视网膜色素上皮（RPE）在眼部免疫系统的局部调节中也具有重要作用^{5,6,7,8,9,10,11}视网膜色素上皮（RPE）的变性及/或功能障碍是多种眼部疾病共有的特征，例如视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙、白化病、糖尿病视网膜病变和黄斑变性。^12,13,14,15遗憾的是，人体组织的可获取性有限。由于小鼠与人类具有高度保守的遗传同源性，小鼠模型成为研究眼病的合适且有用的工具^16,17,18,19此外，使用培养的原代RPE细胞具有多种优势，例如可进行基因操作和药物筛选，从而加速针对这些威胁视力疾病的新型疗法的开发。^9,11.

现有的小鼠RPE分离与培养方法缺乏可重复性，且无法再现RPE的特征 体内 具有足够的可靠性。细胞在培养数天后 tends to 失去色素沉着、六边形形态以及跨上皮电阻（TER）^{13, 20}由于从小鼠建立原代RPE细胞培养是一项具有挑战性的过程，本优化方案基于已有的大鼠和人眼RPE细胞分离方案而制定^21,22,23 解剖小鼠眼球，收集视网膜色素上皮（RPE），并培养小鼠RPE细胞 体外

方案

遵循了ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用声明的指南。

注意：该方法已在不同遗传背景的小鼠中证明有效，包括 C57BL/6J、B10.D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ 和白化小鼠，适用于不同年龄阶段。建议使用 8 至 12 周龄的小鼠以获取视网膜色素上皮（RPE）细胞。较年老小鼠的 RPE 细胞在培养中增殖能力较低，而较年轻小鼠的细胞数量较少且体积较小，因此需要合并来自不同个体的眼组织以获得可存活的培养物。

1. 试剂和膜插件的准备

1. 准备以下试剂。
   1. 制备 HBSS-H−（不含钙、不含镁的 HBSS 缓冲液 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 加入 99 mL 的 HBSS-（不含 Ca/Mg）缓冲液中。4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
   2. 制备 HBSS-H+（含钙、含镁的 HBSS 缓冲液 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 加入 99 mL 的 HBSS+（含 Ca/Mg）缓冲液中。4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
   3. 制备透明质酸酶溶液（1 mg/mL）：将 10 mg 透明质酸酶加入 10 mL 的 HBSS-H− 中，并使用 10 mL 注射器通过 0.4 µm 无菌注射器滤器过滤。使用前新鲜配制，并在室温（RT；20–25 °C）下放置。
   4. 制备 FBS 溶液：将 20% FBS 与 HBSS-H+ 混合。将 2 mL FBS 加入 8 mL HBSS-H+ 中。使用前新鲜配制。
   5. 制备 RPE 培养基：在 α MEM 中加入 N1 培养基添加剂 1/100（v/v）、谷氨酰胺 1/100（v/v）、青霉素-链霉素 1/100（v/v）、非必需氨基酸溶液 1/100（v/v）、氢化可的松（20 µg/L）、牛磺酸（250 mg/L）和三碘甲腺原氨酸（0.013 µg/L），并添加 5% FBS 或不含 FBS^1,23,24。如需要，FBS 可进行热灭活；但未观察到显著差异。RPE 分离时需新鲜配制。用于细胞培养维持时，4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
   6. 制备胰蛋白酶-EDTA：将新鲜胰蛋白酶-EDTA（0.25%）分装成小份单次使用量（约 8 mL），于 -20 ᵒC 冻存。每次使用前在室温下解冻。避免反复冻融。
2. 准备膜插件（例如 Transwell 插件）。
   1. 将 6.5 mm 膜插件在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中用 RPE 培养基平衡至少 30 分钟。每两只小鼠眼球来源的 RPE 细胞使用一个膜插件进行接种。
   2. 孵育后，将下室中的培养基更换为 700 µL 的 PBS。
   3. 移除上室中的培养基，并在膜插件上加入 100 µL 浓度为 10 µg/mL 的小鼠层粘连蛋白（溶于 PBS），在室温下包被至少 2 小时（较短的孵育时间可能导致细胞在插件上的贴附不良）。
   4. 额外包被一个膜插件，用于 TER 测量时作为空白对照。

2. 小鼠眼球的解剖与去核

1. 通过将小鼠放入 CO₂ 室并以每分钟30-70%腔室体积的充气速率缓慢释放 CO₂，使小鼠因 CO₂ 窒息安乐死。
2. 将带锯齿的斜头显微镊分别置于小鼠眼睛两侧，轻轻按压以使眼球突出（摘除眼球）。
3. 闭合夹住眼球的镊子，然后在前后移动的同时轻柔牵拉，将整个眼球连同视神经从眼外肌中分离，确保巩膜上无残留结缔组织。
4. 将摘除的眼球用70%乙醇冲洗，然后置于六孔板的一个孔中，加入3 mL 冰上预冷的 HBSS-H−。
5. 重复步骤2.2至2.4以摘除小鼠的另一只眼球。所有操作应在30分钟内完成。
   注意：建议在积累一定经验前，每次仅处理两只眼球。

3. 视网膜色素上皮（RPE）的收集

注意：以下步骤需在层流罩内的无菌条件下进行。为避免在冰上孵育时间过长导致视网膜色素上皮（RPE）细胞死亡，每次收集的眼球不得超过两个。

1. 使用解剖体视显微镜、Dumont #5 镊子和弯头剪刀，小心清除附着在眼球上的所有结缔组织、血液和肌肉，注意不要切破巩膜。根据需要定期更换 3 mL HBSS-H− 缓冲液，以保持眼球新鲜清洁，避免污染 RPE 培养物。
2. 以视神经作为手柄固定眼球，用锋利的碳钢 #11 刀片在角膜中央打一个小孔。
3. 使用 Dumont #5 剪刀通过上述小孔在角膜上做三个切口，确保有足够的空间取出晶状体。
4. 握住视神经，用弯头剪刀的底部轻轻按压锯齿缘，直至晶状体完全脱出。保留虹膜上皮，以防止在孵育过程中神经视网膜和 RPE 脱落。将眼球放入 HBSS-H 缓冲液中。
5. 重复步骤 3.1–3.4 以解剖第二只眼球。
6. 将无晶状体的眼球置于含透明质酸酶溶液的 12 孔板中，在 37 °C、5% CO₂ 恒温培养箱中孵育 45 分钟（每孔 1.5 mL），以使神经视网膜与 RPE 分离。
7. 将每个眼球转移至新的孔中，每孔加入 1.5 mL 冷的 HBSS-H+ 缓冲液，在冰上孵育 30 分钟，以终止透明质酸酶活性。孵育时间不得超过 45 分钟。
8. 清洗后，将每个眼球放入含新鲜 HBSS-H+ 缓冲液的 35 mm 培养皿中，使用 8 cm Vannas 剪刀沿原有切口剪开角膜，直至锯齿缘 。然后，在锯齿缘下方剪开，以去除虹膜上皮和角膜。
9. 用弯头镊子夹住眼杯边缘/锯齿缘，使用弯头显微镊子小心剥离神经视网膜，确保不损伤 RPE 层。随后剪断视神经处的内部连接。若部分 RPE 细胞仍附着于神经视网膜上，可适当延长孵育时间，但总时间不得超过 45 分钟。
10. 剪断视神经，将每个眼杯转移至另一块 12 孔板中，每孔含 1.5 mL 新鲜胰蛋白酶-EDTA 溶液。确保眼杯保持张开状态并完全浸没在胰蛋白酶中。在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 45 分钟。
11. 收集每个眼杯以及在胰蛋白酶孵育过程中脱落的任何 RPE 片段，转移至另一块 12 孔板中，每孔含 1.5 mL 胎牛血清（FBS）溶液。若 RPE 片段仍留在胰蛋白酶溶液中，使用微量移液器将其转移至含 FBS 溶液的孔中。

4. 小鼠原代RPE细胞的分离

1. 用手握住每个眼球杯的视神经部分，将其倒置并轻轻摇晃，放入含有1.5 mL含20%胎牛血清（FBS）的HBSS-H+的12孔板中，直至视网膜色素上皮（RPE）层完全脱落。
2. 使用微量移液器收集所有RPE层片和RPE细胞团块，并转移至15 mL离心管中。避免混入任何白色巩膜或脉络膜组织碎片，以防污染培养物。将同一只小鼠的两个眼球样本合并至同一离心管中。
3. 在室温下以340 × g 离心2分钟，弃去上清液。
4. 用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA轻柔重悬RPE沉淀，在37 °C水浴中孵育1分钟，使RPE层片解离为单个细胞。孵育后，用移液器轻柔吹打10次，注意移液过程中避免产生气泡。
5. 加入9 mL新配制的RPE培养基以稀释并终止胰蛋白酶活性，随后在室温下以340 × g 离心2分钟。
6. 吸除上清液，使用微量移液器将细胞沉淀轻柔重悬于150 µL含5% FBS的RPE培养基中，确保细胞均匀悬浮，且移液过程中避免产生气泡。
7. 取步骤1.2中制备的经层粘连蛋白包被的膜插件，移除底部腔室中的PBS，并加入700 µL RPE培养基。
8. 移除膜插件上腔室中的层粘连蛋白，将RPE细胞悬液以滴加方式均匀地分布于腔室中央，注意移液过程中避免产生气泡。
9. 将膜插件置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，静置至少24小时，期间避免扰动。
10. 24小时后，在显微镜下检查膜插件，确认大部分RPE细胞已贴壁，融合度至少达到50%（图1A）。在最初72小时内不得更换培养基，这一点至关重要。

5. 极化RPE单层的培养

1. 分离的RPE细胞在培养中至少维持72小时后再更换RPE培养基，以确保细胞充分贴壁。接种时细胞融合度达到50%或以上，是形成合适极化RPE单层的关键。
2. 细胞贴壁后，每周更换两次新鲜且预热的RPE培养基（步骤1.1.5）。在培养最初的72小时后，可从培养基中去除血清。
   ​注意：培养一周后，细胞应达到融合状态，呈六边形、双核、有色素沉着并具有极性（图1B），每6.5 mm Transwell小室的细胞数量约为50,000个。培养两周后，可观察到由健康细胞组成的RPE单层。RPE培养物表现出顶端微绒毛、基底褶皱和紧密连接（图1C）。

6. TER 测量

注意：培养 RPE 细胞至少 4 天后进行 TER 测量，以确保 RPE 单层细胞具有良好的完整性和极化状态。

1. 用70%乙醇清洁伏特欧姆计的电极，并小心擦干。
2. 从培养箱中取出Transwell小室，在3分钟内完成经上皮电阻（TER）测量，以避免因温度波动导致测量值变化。测量TER时，将伏特欧姆计的短电极浸入上室，长电极浸入膜插件的下室。避免接触视网膜色素上皮（RPE）单层细胞，以防细胞脱落。
3. 计算TER时，先从样品读数中减去空白值（即涂有层粘连蛋白但无细胞的膜插件）的读数，再将所得数值（单位为欧姆）乘以膜插件的表面积（对于6.5 mm膜插件，表面积为0.33 cm²）。培养72小时后，结果应至少达到200 Ω × cm²；两周后TER值应高于400 Ω × cm²。TER值偏低的RPE培养物应予以弃用。

结果

本方案已用于从基因修饰小鼠中分离和培养视网膜色素上皮（RPE）细胞¹。在不同小鼠品系或性别之间未观察到差异。该研究结果有助于理解与年龄相关性黄斑变性等眼部疾病发病机制相关的若干重要方面，后者是老年人视力丧失的最常见原因⁹。按照本方案分离的RPE细胞在接种后24小时已完全贴附于膜插件上，并在72小时后表现出典型的RPE细胞大小、形态和色素沉积¹。一周后，由呈六边形的色素化RPE细胞形成高度极化的单层RPE细胞层，细胞间通过表达ZO-1的紧密连接相连，且可见双核结构（图1C、2）。透射电子显微镜图像显示细胞具有顶端微绒毛和基底褶皱（图1C）。RPE单层细胞的极性通过跨上皮电阻（TER）值得以确认，其平均值高于200 Ω×cm²，且随时间保持稳定（图2）。

通过吞噬作用实验...

讨论

尽管此前已开发出多种小鼠RPE细胞分离与培养方法^{1,13,20,22,26,27}，但Fernandez-Godino的方法首次采用膜插件，使RPE细胞在体外培养中可高效生长数周^1,9。该方案的另一重大改进^1,9是使用酶解溶液替代机械剥离法来解离RPE细胞^1,13,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 ml BD Luer-Lok 尖端注射器，一次性	BD Biosciences	309604
15 ml 离心管	VWR International	21008-103
50 ml 离心管	VWR International	21008-951
Alpha 最低必需培养基	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
弯头显微镊子	WPI	501727
台式离心机	任意
CO2 培养箱	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
解剖显微镜	任意
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液，无钙，无镁	Gibco	14190144
Dumont #5 45° 医用生物学镊子，尖端 0.05 x 0.01 mm，长度 11 cm	WPI	14101
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon 易握透明聚苯乙烯细胞培养皿，35 mm	BD Biosciences	353001
胎牛血清	Hyclone	SH30071.03	经热灭活处理
Hank’s 平衡盐溶液，含钙和镁，无酚红	Life Technologies	14175095
Hank’s 平衡盐溶液，含钙和镁，无酚红 B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H-0396
层流罩	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
层粘连蛋白 1 mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	在 37°C 下用 PBS 稀释至 1 mg/ml
McPherson-Vannas 微型剪刀，长 8 cm	WPI	503216
非必需氨基酸 100X	Gibco	11140050
N1 添加剂 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
青霉素-链霉素	Gibco	15140-148
无菌 Bard-Parker 碳钢手术刀片，尺寸 11	Fisher-Scientific	08-914B
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T-0625
组织培养处理的 12 孔板	Fisher-Scientific	08-772-29
组织培养处理的 6 孔板	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell 支持膜，6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
三碘甲腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T-5516
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红	Gibco	25200056
镊子，Dumont #5 医用生物学，11 cm，弯头，不锈钢，尖端 0.02 x 0.06 mm Mod	WPI	500232
Vannas 剪刀，长 8 cm，不锈钢	WPI	501790
Whatman Puradisc 25 mm 注射器滤器，孔径 0.45μm	Fisher-Scientific	6780-2504