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方法文章

利用单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序对视网膜基因表达与染色质可及性进行多重分析

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DOI：

10.3791/62239

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2021年3月12日

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，作者展示了MULTI-seq在表型分析及后续配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）中的应用价值，用于表征视网膜中的转录组和染色质可及性谱型。

摘要

强大的新一代测序技术为研究视网膜基因调控网络在发育过程及疾病状态下的功能提供了稳健且全面的分析手段。单细胞RNA测序能够全面描绘视网膜发育和疾病过程中细胞水平上的基因表达变化，而单细胞ATAC-Seq则可在相似分辨率下分析染色质可及性及转录因子结合情况。本文介绍了这些技术在发育中视网膜中的应用，并展示了MULTI-Seq方法，即通过使用修饰的寡核苷酸-脂质复合物对单个样本进行标记，使研究人员能够扩大单次实验的规模并显著降低成本。

引言

了解基因如何影响细胞命运在研究疾病和胚胎发育等过程时起着关键作用。转录因子与其靶基因之间的复杂关系可被归类为基因调控网络。越来越多的证据表明，这些基因调控网络在进化谱系中的发育和疾病过程中均处于核心地位1。尽管以往的技术（如qRT-PCR）主要针对单个基因或一组基因，高通量测序技术的应用则使得对完整细胞转录组的分析成为可能。

RNA-seq 可以提供大规模转录组学的视图2,3。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）使研究人员不仅能够分析转录组，还能将特定细胞类型与基因表达谱关联起来4。这一过程通过生物信息学方法实现，即将单个细胞的表达谱输入基于已知基因标记的分选算法中进行分析5。利用脂质标记索引测序（MULTI-seq）的多重检测技术，可前所未有地增加可获取的 scRNA-seq 谱的数量6。这种基于脂质的技术不同于其他样本索引技术（如细胞哈希法），后者依赖于细胞表面抗原和高亲和力抗体，而 MULTI-seq 则通过整合到质膜中实现标记7。如今，不仅可以将基因表达谱归类到特定细胞类型，还可以将不同的实验整合到同一个测序文库中，从而显著降低单个 scRNA-seq 实验的成本6。尽管在需要分析多种不同基因型、处理条件或患者样本的表型实验中，scRNA-seq 的成本可能显得过高，但多重检测技术允许将多达 96 个样本合并至单个文库中6。

通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析基因表达并非唯一一种基于高通量测序、彻底改变当前对分子机制如何决定细胞命运认知的技术。虽然了解细胞中存在哪些基因转录本有助于鉴定细胞类型，但同样重要的是理解基因组结构如何调控发育和疾病进展。早期研究依赖于检测DNase介导的未与组蛋白结合序列的切割，随后对产生的DNA片段进行测序，以鉴定开放染色质区域。相比之下，单细胞转座酶可及染色质测序技术（scATAC-seq）使研究人员能够利用改造后的转座子探测DNA，从而在单核苷酸水平上快速绘制开放染色质图谱8。该技术经历了与scRNA-seq类似的大规模发展，如今研究者可鉴定单个细胞类型，并在数千个独立基因组中分析表型特征8。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞ATAC-seq的联合应用使研究人员能够对数千个细胞进行分析，以确定疾病模型和发育过程中的细胞群体、基因组结构以及基因调控网络9,10,11,12。本文作者概述了如何首先利用MULTI-seq技术简化多种动物模型的表型分析，并结合scRNA-seq与scATAC-seq，深入解析这些动物模型中的染色质景观及调控网络。

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方案

这些研究中动物的使用均依照约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的方案进行，符合ARRIVE指南要求，并严格遵循相关指南和法规执行。

1. MULTI-seq

  1. 培养基制备
    1. 制备并平衡卵黏蛋白抑制剂：使用前30分钟，将每毫升Earle's平衡盐溶液（EBSS）中加入10 mg卵黏蛋白抑制剂和10 mg白蛋白，混匀。13. 用95% O₂平衡25% CO₂2 在培养箱中。
      1. 在孵育步骤期间，配制含20单位/毫升木瓜蛋白酶和0.005% DNase的EBSS木瓜蛋白酶消化液13.
        注意：一管DNase溶液足以用于5个样本。若对超过5个样本进行MULTI-seq实验，可能需要重新配制额外的管装溶液。
    2. 制备脂质修饰的寡核苷酸条形码溶液。
      1. 为每个样本配制独特的条形码稀释液，将0.5 µL的100 µM条形码储备液与4.5 µL磷酸盐缓冲液（PBS）混合。
      2. 以1:1摩尔比配制锚定序列：条形码溶液，将4.4 µL的10 µM条形码稀释液、0.9 µL的50 µM锚定序列溶液与16.7 µL的PBS混合，置于冰上。条形码链和锚定序列链的终浓度均为2 µM。
      3. 配制共锚定溶液：将 0.88 µL 的 50 µM 共锚定溶液与 21.12 µL 的 PBS 混合，置于冰上。共锚定溶液的终浓度应为 2 µM。将本步骤中的体积乘以样品数量的 1.1 倍。
    3. 配制1% BSA的PBS溶液：将0.1 g牛血清白蛋白（BSA）溶解于10 mL PBS中，置于冰上。
    4. 将 2.5 µL 的 40 U/µL RNase 抑制剂与 197.5 µL PBS 混合，置于冰上保存。将此步骤中的体积乘以样本数的 1.1 倍。
  2. 样品解离
    1. 通过颈椎脱位和/或二氧化碳安乐死动物2 根据机构IACUC要求进行窒息处死。安乐死方法将取决于机构要求和所使用的模式生物。
    2. 在解剖显微镜下，用移液管将双眼的视网膜在冷的PBS中解剖下来，并转移至无菌的1.5 mL离心管中。
    3. 为每个样本将 500 µL 的木瓜蛋白酶溶液转移至 1.5 mL 离心管中。
    4. 将样本放入木瓜蛋白酶溶液中，并立即盖紧管盖。
    5. 将含有样品的试管在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 孵育30分钟。每10分钟将离心管颠倒3次。随着每次颠倒操作，样品应逐渐解离。
    6. 将离心管恢复至室温，用设置为300 µL的1 mL移液器对每个样品进行3-4次吹打混匀。
    7. 让吹打后残留的未解离组织沉淀。
    8. 去除浑浊的细胞悬液，避免混入未解离的组织碎片，并将每个样本的细胞悬液转移至新的无菌15 mL螺口离心管中。
    9. 将细胞悬液在室温下以300 × g离心5分钟。
    10. 离心步骤期间，准备细胞重悬培养基。
      1. 在无菌的 1.5 mL 螺口离心管中，将 857 µL EBSS（1 号小瓶）与 95 µL 重组白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液混合。加入 48 µL 来自 1.1.1 步骤中保存的 DNase 溶液。将此步骤中的体积乘以样本数的 1.1 倍。
    11. 弃去上清液，注意保留细胞沉淀，并立即用1.2.10步骤中配制的1 mL细胞重悬液重悬细胞沉淀。
    12. 制备不连续密度梯度。
      1. 每个样本中，向一个新的15 mL无菌螺旋盖管中加入1.6 mL卵黏蛋白抑制剂溶液，然后小心地将细胞悬液叠加在上层。两层梯度液之间的界面应可见，但轻微混合不影响结果。
    13. 在室温下以 70 × g 离心不连续密度梯度 6 分钟。离解的细胞应沉淀于管底，而膜碎片则停留在界面处。
    14. 弃去上清液，加入 200 µL PBS 洗涤沉淀的细胞。以 300 x g 室温下孵育5分钟。
    15. 弃去上清液，将细胞重悬于含有RNase抑制剂的180 µL PBS中。将细胞悬液通过40 µm细胞滤网，收集至无菌的1.5 mL微量离心管中。
  3. 细胞条形码
    1. 向每个样本中加入20 µL的anchor:barcode溶液，轻轻吹打混匀。确保每个样本加入的anchor:barcode溶液均不相同，冰上孵育5 min。
      1. 在此孵育期间，准备凝胶珠-乳液（GEM）生成和条形码标记所需的材料。14.
    2. 向每个样本中加入20 µL共锚定溶液，轻轻吹打混匀。冰上孵育5分钟。
    3. 向每个样品中加入1 mL预冷的含1% BSA的PBS，于4 °C下以300 x g离心5 min。
    4. 移去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，加入400 µL预冷的含1% BSA的PBS。在4 °C下以300 x g离心5分钟。
      1. 重复步骤 1.3.4，共洗涤 2 次。弃去上清液，将沉淀重悬于 400 µL 冰冷的含 1% BSA 的 PBS 中。
    5. 使用血细胞计数板测定每个样本的细胞浓度。
      1. 确定每个样本需要上样的细胞总数。通常情况下，该数值为所需细胞总数除以样本数量。然而，如果某一条件下的某个生物学重复样本丢失，则可将该样本对应的细胞数平均分配给该条件下其余的生物学重复样本。
      2. 将每个样本所需细胞数量除以步骤3.5中计算得到的该样本细胞浓度，以确定加载所需细胞数量所需的体积。
    6. 将步骤 3.5.2 中计算的各样本体积合并至一个新的无菌 1.5 mL 离心管中。为防止 GEM 生成失败，建议取用每份样本体积的两倍量。
      1. 确定 "最终" 使用血细胞计数板测定合并样品的细胞浓度。
  4. GEM 生成与条形码标记
    1. 使用混合样本生成并加标签GEMs14.
  5. GEM-RT 产物纯化及 cDNA 扩增
    1. 根据制造商说明书准备用于GEM后逆转录酶清洁及cDNA扩增的材料，但需进行以下修改14通过大小选择进行GEM-RT后的纯化步骤14.
      1. 将80%乙醇的体积增加2 mL。
      2. 在冰上配制 cDNA 扩增混合液14加入1 µL浓度为2.5 µM的MULTI-seq引物至cDNA扩增混合液中。涡旋振荡5秒，然后在台式小型离心机中离心5秒。
    2. 进行cDNA扩增14此时，cDNA 可在 4 °C 下保存长达 72 小时。
    3. 通过大小选择进行 cDNA 纯化14此时，内源性转录本cDNA可在4 °C下保存最多72小时，或在-20 °C下保存最多4周。
      1. 不要丢弃第一次尺寸筛选后的上清液，该组分含有样本条形码。 将上清液转移至新的无菌1.5 mL微量离心管中。
      2. 将上清液置于冰上保存。
    4. 涡旋重悬基于磁珠的片段筛选试剂，向上清液中加入260 µL基于磁珠的片段筛选试剂（终浓度3.2倍）和180 µL 100%异丙醇（1.8倍）。用移液器吹打混合10次，室温孵育5分钟。
    5. 将试管置于磁力架上，静置至溶液澄清。随后移除并弃去上清液。
    6. 向珠子中加入500 µL 80%乙醇，静置30 s。移除并弃去上清液。
      1. 重复上述步骤，共洗涤2次。
    7. 短暂离心磁珠，然后放回磁力架。启动计时器，计时2分钟。
    8. 用 P10 移液器除去残留乙醇，并将磁珠置于磁力架上晾干，干燥时间不超过 2 分钟。
    9. 从磁力架上取下磁珠，重悬于100 µL洗脱缓冲液（EB）中。充分吹打混匀以重悬。
    10. 室温孵育2分钟。
    11. 返回磁力架，静置至溶液澄清。
    12. 将上清液转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。
    13. 重复步骤 1.5.4 至 1.5.12。在步骤 1.5.9 中使用的缓冲液 EB 的体积减半。
    14. 使用双链DNA高灵敏度检测试剂盒、荧光计和片段分析仪测定条形码DNA的浓度和片段大小分布15,16此时，条形码cDNA可在4 °C下保存长达72小时，或在-20 °C下保存长达4周。
  6. 条形码文库构建
    1. 配制1 mL 80%乙醇。
    2. 在无菌PCR条状管中配制条形码文库PCR主混合液：将26.25 µL的2x热启动PCR预混液、2.5 µL的10 µM通用i5引物、2.5 µL的10 µM RPI引物、3.5 ng条形码cDNA（体积根据步骤5.14的浓度确定）混合，并加入足量无核酸酶水，使最终体积为50 µL。
      1. 若多个MULTI-seq文库同时测序，每个条形码文库应使用独特的RPI引物。
    3. 将条形码文库混合液进行文库制备PCR：95 °C预变性5 min；98 °C 15 s、60 °C 30 s、72 °C 30 s，循环10次；72 °C延伸1 min；然后置于4 °C保存。
    4. 涡旋重悬基于磁珠的片段大小筛选试剂。
    5. 从PCR仪中取出PCR产物，加入80 µL（1.6倍体积）基于磁性微珠的片段筛选试剂，用移液器充分混匀。
    6. 室温孵育5分钟。将样品置于磁力架的高位，静置至溶液澄清。
    7. 移除并弃去上清液。
    8. 向珠中加入 200 µL 80% 乙醇，静置 30 秒。移除并弃去上清液。
      1. 重复步骤 1.6.8，共洗涤 2 次。
    9. 短暂离心试管，并将其置于磁力架的低位。启动计时器，计时2分钟。
    10. 用P20移液器除去残留的乙醇，并将磁珠置于磁力架上继续干燥至满2分钟。干燥时间不得超过2分钟。
    11. 从磁力架上取下离心管，加入25 µL EB缓冲液重悬磁珠。用移液器充分吹打混匀以彻底重悬磁珠。
    12. 室温孵育2分钟。
    13. 将样本放回磁力架的低位，静置至溶液澄清。将上清液转移至新的PCR条形管中。
    14. 使用adsDNA高灵敏度检测试剂盒、荧光计和片段分析仪，定量测定表达文库和条形码文库的浓度及片段大小分布。
  7. 3' 基因表达文库构建
    1. 根据制造商说明书进行3'基因表达文库构建14.
  8. 测序
    1. 除了第7步扩增的内源性cDNA文库外，还需提交第6步扩增的条形码文库。为简便起见，可将这两个文库分别提交，或作为节约成本的措施，将一份样本条形码材料等分后与内源性cDNA文库合并提交。建议每个细胞的目标测序深度为20,000–50,000条cDNA读段和3,000–5,000条条形码读段。
    2. 使用 cellranger mkfastq 将生成的测序 bcl 文件转换为 fastq 文件，并通过 cellranger count 从这些 fastq 文件生成计数矩阵。
    3. 使用 MULTI-seq GitHub 仓库（https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq）提供的 deMULTIplex R 包，在 Cellranger 分析后对样本进行去卷积处理。

2. 配对的单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序

  1. 用于单细胞ATAC测序的组织快速冷冻及用于单细胞RNA测序的视网膜细胞甲醇固定
    1. 溶液配制
      1. 为配制视网膜组织解离所需溶液，重复步骤1.1.1和1.1.4。
      2. 在小型冰桶中制备乙醇-干冰浴。
      3. 通过将10.5 mL乙醇加入4.5 mL无核酸酶水中，配制15 mL 70%乙醇。
      4. 向冰桶中加入足量干冰（最好为颗粒状），使加入15 mL液体后液面刚好覆盖干冰。随后加入15 mL乙醇。
      5. 将PBS置于冰上，并在方便取用的-20 °C冰箱中预置1 mL分装的100%甲醇。
    2. 样品制备
      1. 按照步骤1.2.1和1.2.2分离视网膜；但此次将每只视网膜分别放入独立的微量离心管中。
      2. 对于用于单细胞ATAC测序（scATAC-seq）的样品，使用P200移液器吸除微量离心管中的液体，立即盖紧管盖，并将管子放入乙醇-干冰浴中进行快速冷冻。
      3. 对于用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）的样品，对已解剖的视网膜重复步骤1.2.3至1.2.15以解离细胞。
      4. 在室温下以300 × g离心3分钟。
      5. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
      6. 加入1 mL预冷PBS，轻柔吹打混匀10次，或直至细胞完全悬浮。
      7. 在4 °C下以300 × g离心5分钟。
        1. 重复步骤2.1.2.5至2.1.2.7，共完成2次洗涤。
      8. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
      9. 加入100 µL预冷PBS，轻柔混匀10次，或直至细胞完全悬浮。
      10. 将离心管置于涡旋振荡器上，以最低转速开始涡旋；同时逐滴加入900 µL预冷甲醇（-20 °C），持续轻柔涡旋以防止细胞聚集。
      11. 将细胞在冰上孵育15分钟。
      12. 使用血细胞计数板测定固定后细胞的浓度。
      13. 使用台盼蓝评估固定效果。若活细胞比例较高，表明需要延长固定时间。
      14. 将冷冻组织和固定后的细胞储存于-80 °C。
  2. 从快速冷冻组织中分离细胞核用于单细胞ATAC测序
    1. 溶液配制
      1. 通过混合9.77 mL无核酸酶水、100 µL 1 M Tris-HCl（pH 7.4）、100 µL 1 M NaCl、30 µL 1 M MgCl2和0.1 g BSA，配制裂解稀释缓冲液。
      2. 可提前（如前一天）配制裂解稀释缓冲液，并于4 °C保存。实验当天取出后置于冰上。
      3. 将单细胞ATAC测序试剂盒厂家提供的20倍浓缩细胞核缓冲液从-20 °C平衡至室温，短暂涡旋并离心。
      4. 将5% Digitonin溶液置于65 °C水浴中加热至沉淀完全溶解，用于配制1倍裂解缓冲液。然后混合2 mL裂解稀释缓冲液、20 µL 10% Tween-20、20 µL Nonidet P40替代物（也可标记为IGEPAL）和4 µL Digitonin。
      5. 将1倍裂解缓冲液置于冰上保存。
      6. 通过混合1.8 mL裂解稀释缓冲液与200 µL 1倍裂解缓冲液，配制0.1倍裂解缓冲液，并置于冰上保存。
      7. 通过混合2 mL裂解稀释缓冲液与20 µL 10% Tween-20，配制洗涤缓冲液，并置于冰上保存。
      8. 通过混合950 µL无核酸酶水与50 µL细胞核缓冲液（20倍），配制稀释细胞核缓冲液，并置于冰上保存。
    2. 细胞核分离
      1. 在裂解前切勿解冻样品。 向含有冷冻样品的1.5 mL微量离心管中加入500 µL预冷的0.1倍裂解缓冲液，立即使用研磨杵匀浆15次。
      2. 在冰上孵育5分钟。在此期间准备单细胞ATAC转座反应所需的材料17。
      3. 使用1 mL移液器吹打混匀10次，继续在冰上孵育10分钟。若尚未完成，需在此期间完成单细胞ATAC转座反应所需材料的准备。无需额外配制稀释细胞核缓冲液。
      4. 向裂解后的细胞中加入500 µL预冷洗涤缓冲液，吹打混匀5次。
      5. 将悬液通过70 µm细胞筛过滤至新的1.5 mL微量离心管中。每次使用新的70 µm细胞筛，分批过滤约300 µL。
      6. 将收集的滤液通过40 µm细胞筛过滤至另一新的1.5 mL微量离心管中，并置于冰上保存。
      7. 使用血细胞计数板测定细胞核浓度。根据细胞核浓度和细胞悬液总体积，计算解离出的细胞核总数。
      8. 在4 °C下以500 × g离心5分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞核沉淀。
      9. 根据步骤2.2.2.7中确定的总细胞核数量，用适量稀释细胞核缓冲液重悬细胞核，以达到目标细胞核浓度。
        注：目标细胞核浓度取决于单细胞ATAC测序实验的目标细胞核回收率，具体数值可参考厂家说明书中的细胞核浓度指南17。例如，若最终需要10,000个细胞核，则细胞核储备液的目标浓度应在3,080至7,700个细胞核/µL之间。建议选择该范围的中间值作为目标浓度。
      10. 使用血细胞计数板测定细胞核浓度。
      11. 立即使用制备好的细胞核储备液进行单细胞ATAC转座反应17。
  3. 甲醇固定细胞的重悬处理及其在单细胞RNA测序中的应用
    1. 溶液配制
      1. 通过将0.01 g BSA溶解于1 mL PBS中配制洗涤/稀释缓冲液，然后加入12.5 µL 40 U/µL RNase抑制剂，轻柔混匀。置于冰上保存。
    2. 细胞重悬
      1. 将甲醇固定的细胞在1.5 mL微量离心管中于4 °C下以3000 × g离心10分钟，随后吸除上清液。
      2. 向微量离心管中加入200 µL预冷的洗涤/稀释缓冲液，于4 °C下以300 × g离心10分钟，吸除上清液。重复该步骤，共完成2次洗涤。
        ​注：在前两个步骤期间准备GEM生成与条形码标记所需的材料14。
      3. 根据步骤2.1.2.12中计算的总细胞数，用适量洗涤/稀释缓冲液重悬细胞，以达到目标细胞浓度。推荐细胞浓度范围为700至1200个细胞/µL。
      4. 使用血细胞计数板测定细胞储备液的细胞浓度。
      5. 立即使用细胞储备液进行GEM生成与条形码标记14。
    3. 测序
      1. 在进行时间序列分析（如发育或疾病过程）时，建议将多个样品在一次测序运行中进行多重检测（即单个流动池上加载多个文库），以减少技术变异。

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结果

该工作流程阐述了利用单细胞测序技术研究发育表型和调控过程的策略。MULTI-seq样本多重化技术可实现低成本的初步表型分析，而同时采集并固定样本用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq），则可进一步开展更深入的研究（图1）。

MULTI-seq 条形码技术能够实现多个样本的联合测序及其后续的计算去卷积。每个细胞的来源样本可根据其条形码的表达情况确定（图 2A）。这些合并的样本可作为单一数据集进行细胞聚类和细胞类型鉴定分析（图 2B）。由于每个细胞在 GEM 生成之前已被标记条形码，因此细胞双胞体（doublet）极有可能表现出多个 MULTI-seq 条形码的共表达，从而可在聚类与细胞类型鉴定之前识别并去除大部分双胞体（图 2C）。增加 GEM 生成步骤中所使用的细胞数量，将提高检测到的双胞体比例。sc...

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讨论

MULTI-seq 的优势在于能够无缝整合来自多种实验条件或模型的数据，并在降低成本和减少批次效应方面具有显著优势。使用 MULTI-seq 可使实验室获得前所未有的表型分析深度。细胞哈希（cell hashing）或细胞核哈希（nuclei hashing）等非遗传多重检测方法通过使用条形码标记的抗体实现了样本的多重检测7,19,20。然而，该方法依赖于高亲和力抗体的可获得性，这些抗体需能识别细胞或其细胞核表面表达的蛋白；如果缺乏此类抗体，或细胞不表达合适的细胞表面或细胞核抗原，则该方法无法实施7。由于 MULTI-seq 采用脂质修饰的寡核苷酸条形码，可稳定地嵌入细胞或其细胞核中，因此研究人员能够以更低成本、更广泛适用的方式，从多达 96 个新鲜或固定样本中获取转录组数据6。

建议并展示了在初始的M...

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致谢

我们感谢约翰斯·霍普金斯大学转录组学与深度测序核心的 Linda Orzolek 在文库测序方面的帮助，以及 Lizhi Jiang 在执行相关实验中的贡献 离体 视网膜外植体

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 µL, 200 µL, 1000 µL型移液滤芯吸头
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100 µM条形码溶液来自 Gartner 实验室的申请https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
true
100% 乙醇Millipore SigmaE7023-500ML
100% 甲醇Millipore Sigma322415-100ML
10x 芯片支架10x Genomics1000195
10x Chromium 控制器 &和配件工具包10x GenomicsPN-120263
15 mL 离心管优质生物材料P886-229411
40 µm FlowMi 细胞滤筛Bel-ArtH13680-0040
50 µM锚定溶液Sigma 或向 Gartner 实验室申请https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&&edit_requested
true
50 µM 共锚定溶液Sigma 或向 Gartner 实验室申请https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
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=真
5200 Fragment Analyzer 系统安捷伦M5310AA
70 μm FlowMi 细胞滤网Bel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R 离心机VWRBK392302
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9647
Chromium Next GEM 芯片 G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM 芯片 H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem 单细胞ATAC试剂盒 v1.110x GenomicsPN-1000175
Chromium 单细胞 3' GEM，文库 & 凝胶珠试剂盒 v3.110x GenomicsPN-1000121
皂苷元Fisher ScientificBN2006
解剖显微镜Leica
DNA低吸附管，1.5 mLEppendorf22431021
干冰
EVA泡沫冰格Tequipment04393-54
FA 12-毛细管阵列短型，33 cm安捷伦A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp 水浴锅Fisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 水套式培养箱ThermoFisher Scientific3110
50% 甘油水溶液Ricca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Bright-Line 计数室Fisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq 或 NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
低TE缓冲液优质生物材料351-324-721
氯化镁溶液 1 MSigma-AldrichM1028
1.5 mL 离心管用磁力分离架Millipore Sigma20-400
200型磁力分离架 µL型管10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq 引物Sigma 或 IDT参见序列列表
MyFuge微型离心机Benchmark ScientificC1008
Nonidet P40 替代品Sigma-Aldrich74385
无核酸酶水Fisher ScientificAM9937
P2、P10、P20、P200、P1000 微量移液器Eppendorf
木瓜蛋白酶解离系统沃辛顿生化公司LK003150
PBS pH 7.4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
冷冻离心机 5424 REppendorf2231000655
无RNase一次性研磨杵Fisher Scientific12-141-368
RNasin Plus RNase抑制剂PromegaN2615
RPI 引物Sigma 或 IDT参见序列列表
单指数试剂盒 N，A 套件10x GenomicsPN-1000212
单指数试剂盒 T A组10x GenomicsPN-1000213
5 M 氯化钠溶液Sigma-Aldrich59222C
SPRIselect 试剂盒Beckman CoulterB23318
标准一次性移液管Fisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8管排USA Scientific1402-4700
Trizma 盐酸盐溶液，pH 7.4Sigma-AldrichT2194
0.4% (w/v) 台盼蓝溶液康宁25-900-CI
通用I5引物Sigma 或 IDT参见序列列表
Veriti 热循环仪应用生物系统公司4375786
涡旋混合器VWR10153-838

参考文献

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