Method Article

使用 scRNA-Seq 和 scATAC-Seq 对视网膜基因表达和染色质可及性进行多重分析

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，作者展示了MULTI-seq用于表型的效用，以及随后配对的scRNA-seq和scATAC-seq在表征视网膜转录组和染色质可及性图谱方面的效用。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

强大的下一代测序技术提供了强大而全面的分析，以研究视网膜基因调控网络在发育和疾病状态下如何发挥作用。单细胞RNA测序使我们能够在细胞水平上全面分析在视网膜发育和疾病中观察到的基因表达变化，而单细胞ATAC-Seq允许分析染色质可及性和转录因子结合，以相似的分辨率进行分析。这里描述了这些技术在发育中的视网膜中的使用，并演示了MULTI-Seq，其中单个样品用修饰的寡核苷酸 - 脂质复合物标记，使研究人员能够增加单个实验的范围并大大降低成本。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

了解基因如何影响细胞命运在询问疾病和胚胎进展等过程中起着关键作用。转录因子与其靶基因之间的复杂关系可以在基因调控网络中分组。越来越多的证据表明，这些基因调控网络处于疾病和进化谱系发展的中心1。虽然以前的技术（如qRT-PCR）专注于单个基因或一组基因，但高通量测序技术的应用允许分析完整的细胞转录组。

RNA-seq提供了对大规模转录组学2，3的一瞥。单细胞RNA测序（scRNA-seq）使研究人员不仅能够分析转录组，还可以将特定细胞类型与基因表达谱联系起来4。这是通过使用已知的基因标记5将单个细胞谱输入到分选算法中来实现的生物信息学。使用脂质标记索引测序（MULTI-seq）进行多重检测，在可收集的scRNA-Seq谱数量方面提供了前所未有的多样性6.这种基于脂质的技术与其他样品索引技术不同，例如依赖于表面抗原和高亲和抗体的存在而不是质膜整合7的细胞散列。现在不仅可以将基因表达谱谱分析为细胞类型，还可以将不同的实验组合到单个测序文库中，从而大大降低了单个scRNA-seq实验的成本6。scRNA-seq的成本对于用于分析许多不同基因型，条件或患者样本的表型实验似乎令人望而却步，但多重检测允许在单个文库中组合多达96个样本6。

通过scRNA-seq分析基因表达并不是唯一一种基于高通量测序的技术，它彻底改变了目前对分子机制如何决定细胞命运的理解。虽然了解细胞中存在哪些基因转录本可以识别细胞类型，但同样重要的是了解基因组组织如何调节发育和疾病进展。早期研究依赖于检测DNase介导的不与组蛋白结合的序列的切割，然后对产生的DNA片段进行测序以鉴定开放染色质的区域。相比之下，转座子可访问染色质测序（scATAC-seq）的单细胞测定允许研究人员用驯化的转座子探测DNA，以便在单核苷酸水平8上轻松谱分析开放染色质。这已经经历了与scRNA-seq类似的缩放，现在研究人员可以识别单个细胞类型并分析数千个单个基因组中的表型8。

scRNA-seq和scATAC-seq的配对使研究人员能够分析数千个细胞，以确定疾病模型和发育过程中的细胞群，基因组组织和基因调控网络9，10，11，12。在这里，作者概述了如何首先利用 MULTI-seq 来凝聚无数动物模型的表型，并采用配对的 scRNA-seq 和 scATAC-seq 来更好地了解这些动物模型中的染色质景观和调控网络。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这些研究中的动物使用是使用约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的协议进行的，符合ARREAT指南，并按照相关指南和法规进行。

1. 多级

  1. 培养基制备
    1. 制备并平衡卵粘液抑制剂，10mg卵粘液抑制剂和每mL厄尔平衡盐溶液（EBSS）10mg白蛋白，使用前30分钟13。在培养箱中与 95% O2:5% CO2 平衡。
      1. 在此孵育步骤13中制备木瓜蛋白酶解离溶液，20单位/ mL木瓜蛋白酶和EBSS中的0.005%DNase。
        注意:一瓶DNase溶液足以容纳5个样品。如果对超过 5 个样品进行 MULTI-seq，则可能需要重组其他小瓶。
    2. 制备脂质修饰的寡核苷酸条形码溶液。
      1. 通过将0.5 μL 100 μM条形码储备溶液与4.5 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合，为每个样品进行独特的条形码稀释。
      2. 为了以1:1摩尔比制备锚点:条形码溶液，将4.4μL10μM条形码稀释液，0.9μL50μM锚固溶液和16.7μLPBS混合并置于冰上。条形码链和锚链的最终浓度应为2μM。
      3. 为了制备共锚溶液，将0.88μL 50μM共锚溶液和21.12μL PBS混合并放在冰上。共锚的最终浓度应为2μM.将此步骤中的体积乘以样品数量的1.1倍。
    3. 要在PBS中产生1%的BSA，将0.1g牛血清白蛋白（BSA）溶解在10 mL PBS中并放在冰上。
    4. 要用RNase抑制剂制备PBS，将2.5μL 40 U / μL RNase抑制剂与197.5μL PBS混合并储存在冰上。将此步骤中的体积乘以样品数量的 1.1 倍。
  2. 样品解离
    1. 根据机构IACUC要求，通过宫颈脱位和/或CO2 窒息对动物实施安乐死。安乐死的方法将取决于机构要求和所使用的模式生物。
    2. 在冷PBS的解剖显微镜下从双眼解剖视网膜，并使用转移移液管转移到无菌的1.5 mL微量离心管中。
    3. 将500μL木瓜蛋白酶溶液转移到每个样品的1.5mL管中。
    4. 将样品放入木瓜蛋白酶溶液中，并立即盖住管子。
    5. 将含有样品的试管在37°C，5%CO2 下孵育30分钟。每10分钟倒置小瓶3次。样本应逐渐与每轮反转解离。
    6. 将样品瓶返回室温，并用1 mL移液管将每个样品研磨3-4次，设置为300μL。
    7. 让研磨后剩余的任何未分离组织碎片沉降。
    8. 取出浑浊的细胞悬浮液，同时避免任何未分离的组织碎片，并将每个样品的细胞悬浮液置于新的无菌15 mL旋盖管中。
    9. 在室温下以300×g离心细胞悬浮液5分钟。
    10. 在离心步骤中，制备细胞重悬培养基。
      1. 将857μLEBSS（小瓶1）与95μL重组的白蛋白 - 卵粘液样抑制剂溶液混合在无菌的1.5mL旋盖管中。加入从1.1.1中保存的48μLDNase溶液。将此步骤中的体积乘以样品数量的 1.1 倍。
    11. 弃去上清液，小心地保留细胞沉淀，并立即将细胞沉淀重悬于步骤1.2.10中制备的1 mL细胞重悬溶液中。
    12. 准备不连续的密度梯度。
      1. 对于每个样品，将1.6 mL卵粘液抑制剂溶液加入新的15 mL无菌旋盖管中，并小心地将细胞悬浮液铺在上面。梯度的两层之间的界面应该是可见的，但有些混合不会影响结果。
    13. 在室温下以70×g离心不连续的密度梯度6分钟。解离的细胞应在管的底部沉淀，而膜碎片保留在界面处。
    14. 弃去上清液并加入200μLPBS以洗涤沉淀细胞。在室温下以300× g 离心5分钟。
    15. 弃去上清液，并用RNase抑制剂将细胞重悬于180μLPBS中。将细胞通过40μm细胞过滤器进入无菌的1.5mL微量离心管。
  3. 单元格条形码
    1. 向每个样品中加入20μL锚定:条形码溶液，轻轻移液以混合。确保每个样品都收到唯一的锚点:条形码溶液，并在冰上孵育5分钟。
      1. 在此孵育期间准备凝胶乳液（GEM）生成和条形码所需的材料14.
    2. 向每个样品中加入20μL共锚定溶液，轻轻移液器混合。在冰上孵育5分钟。
    3. 向每个样品中加入1mL冰冷的1%BSA PBS，并在4°C下以300×g离心细胞5分钟。
    4. 在不干扰细胞沉淀的情况下除去上清液，并在PBS中加入400μL冰冷的1%BSA。在4°C下以300×g离心5分钟。
      1. 重复步骤1.3.4共洗涤2次。取出上清液，在PBS中重悬于400μL冰冷的1%BSA中。
    5. 使用血细胞计数器确定每个样品的细胞浓度。
      1. 确定每个样品要加载的电池总数。通常，这是所需细胞总数除以样本数。但是，如果一种病症的生物重复丢失，则其份额可以在该病症的其他生物重复中分配。
      2. 将每个样品所需的细胞数除以步骤3.5中计算的该样品的细胞浓度，以确定加载所需细胞数所需的体积。
    6. 将步骤3.5.2中计算的体积从每个样品中合并到一个新的无菌1.5 mL离心管中。谨慎的做法是，在创业板生成失败的情况下，从每个样本中取出的体积增加一倍。
      1. 使用血细胞计数器测定组合样品的"最终"细胞浓度。
  4. 创业板生成和条形码
    1. 使用组合样品生成 GEMs14 并对其进行条形码。
  5. 后创业板-RT纯化和化学DNA扩增
    1. 根据制造商的说明准备用于 GEM 后逆转录酶纯化和 cDNA 扩增的材料，并进行以下修改14.通过尺寸选择14 执行 GEM-RT 后清理。
      1. 增加由2mL制备的80%乙醇的体积。
      2. 在冰上准备cDNA扩增混合物14。向cDNA扩增混合物中加入1 μL 2.5 μM 多链引物。涡旋5秒，在台式小型离心机中离心5秒。
    2. 进行化学合成编码扩增14.此时，cDNA可以在4°C下储存长达72小时。
    3. 通过尺寸选择14进行cDNA纯化。内源性转录本cDNA可以在4°C下储存长达72小时，或者在-20°C下储存长达4周。
      1. 不要丢弃第一轮尺寸选择的上清液。该分数包含示例条形码。 将上清液转移到新的无菌1.5 mL微量离心管中。
      2. 将上清液储存在冰上。
    4. 涡旋重悬顺磁性微球基尺寸选择试剂，并向上清液中加入260μL顺磁性珠基尺寸选择试剂（最终3.2x）和180μL100%异丙醇（1.8x）。移液混合物10次，并在室温下孵育5分钟。
    5. 将管子放在磁性架上，等待溶液清除。然后取出并丢弃上清液。
    6. 向珠子中加入500μL80%乙醇，静置30秒。取出并丢弃上清液。
      1. 重复共洗涤2次。
    7. 短暂离心磁珠并返回磁架。启动计时器 2 分钟。
    8. 用P10移液管除去剩余的乙醇，并在剩余的2分钟内将磁珠风干磁性架上的磁珠。不要超过2分钟。
    9. 从磁架上取下磁珠，然后重悬于100μL洗脱缓冲液（EB）中。彻底移液以重悬。
    10. 在室温下孵育2分钟。
    11. 返回磁力机架并等待溶液清除。
    12. 将上清液转移到新鲜的1.5 mL微量离心管中。
    13. 重复步骤 1.5.4 至 1.5.12。将步骤 1.5.9 中使用的缓冲器 EB 体积减半。
    14. 使用dsDNA高灵敏度测定试剂盒和荧光计和片段分析仪15，16测定条形码DNA浓度和粒径分布。条形码cDNA可以在4°C下储存长达72小时，或者在-20°C下储存长达4周。
  6. 条码库构建
    1. 准备1毫升80%乙醇。
    2. 在无菌PCR条管中制备条形码库PCR预混液:将26.25μL2x热启动PCR预混液，2.5μL10μM通用i5引物，2.5μL10μM RPI引物，3.5ng条形码cDNA（体积由步骤5.14的浓度决定）和足够的无核酸酶水混合，使最终体积达到50μL。
      1. 如果多个 MULTI-seq 库一起排序，则对每个条形码库使用唯一的 RPI 引物。
    3. 将条形码文库预混液置于文库制备PCR:95°C下5分钟;10次循环，98°C持续15秒，60°C循环30秒，72°C循环30秒;72°C持续1分钟;然后保持在4°C。
    4. 涡旋以重悬顺磁性微球基尺寸选择试剂。
    5. 从热循环仪中取出PCR产物，并加入80μL（1.6x）顺磁珠基尺寸选择试剂。彻底移液。
    6. 在室温下孵育5分钟。将磁铁分离器放在高位，等待溶液清除。
    7. 取出并丢弃上清液。
    8. 向珠子中加入200μL80%乙醇，静置30秒。取出并丢弃上清液。
      1. 重复步骤1.6.8，共洗涤2次。
    9. 短暂离心管子，放在磁选机的低位。启动计时器 2 分钟。
    10. 用P20移液管除去剩余的乙醇，并在2分钟余下的磁珠上风干磁珠。不要超过2分钟。
    11. 从磁分离器中取出管子，并将磁珠重悬于25μL缓冲液EB中。移液器充分混合以重悬珠。
    12. 在室温下孵育2分钟。
    13. 返回到低位的磁选机，等待溶液清空。将上清液转移到新的PCR条带管中。
    14. 使用 adsDNA 高灵敏度测定试剂盒和荧光计和片段分析仪量化表达库和条形码库浓度和片段大小分布。
  7. 3' 基因表达文库构建
    1. 根据制造商的说明进行3'基因表达库构建14.
  8. 测 序
    1. 除了在步骤7中扩增的内源性cDNA文库外，提交在步骤6中扩增的条形码文库。为简单起见，请单独提交这些文库，或作为一种具有成本效益的措施，包括将样品条形码材料的等分试样与内源性cDNA文库一起提交。每个细胞的目标值为 20，000-50，000 cDNA 和 3，000-5，000 次条形码读取。
    2. 将生成的测序 bcl 文件转换为通过细胞游谱 mkfastq 生成的 fastq 文件，并通过细胞游侠计数从这些文件中生成的计数矩阵。
    3. 在细胞游侠分析后使用多级复用 GitHub 存储库（https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq）中提供的解复级复数 r 包对样本进行反卷积。

2. 配对的scRNA-seq和scATAC-seq

  1. 用于 scATAC-seq 的瞬时冷冻组织和用于 scRNA-seq 的视网膜细胞的甲醇固定
    1. 培养基制备
      1. 要制备视网膜解离的溶液，请重复步骤1.1.1和1.1.4。
      2. 在一个小冰桶中准备乙醇干冰浴。
      3. 通过将10.5 mL乙醇加入4.5 mL无核酸酶水中来制备15 mL 70%乙醇。
      4. 向冰桶中加入足够的干冰（最好是颗粒形式），使15毫升液体升起以覆盖冰块。加入15毫升乙醇。
      5. 将PBS放在冰上，并将1 mL等分试样的100%甲醇放入方便的-20°C冰箱中。
    2. 样品制备
      1. 按照步骤1.2.1和1.2.2隔离视网膜;然而，这次将每个视网膜放入单独的微量离心管中。
      2. 对于运往scATAC-seq的样品，使用P200移液管从微量离心管中取出任何液体，并立即盖上盖子并将管置于乙醇干冰浴中以快速冷冻样品。
      3. 对于去向scRNA-seq的样品，要解离细胞，在解剖的视网膜上重复步骤1.2.3至1.2.15。
      4. 在室温下以300×g离心细胞3分钟。
      5. 除去上清液而不破坏细胞沉淀。
      6. 加入1 mL冷冻PBS，轻轻移液10次或直到细胞完全悬浮。
      7. 在4°C下以300×g离心5分钟。
        1. 重复步骤 2.1.2.5 至 2.1.2.7，共洗涤 2 次。
      8. 除去上清液而不破坏细胞沉淀。
      9. 加入100μL冷藏PBS，轻轻混合10倍或直到细胞完全悬浮。
      10. 以最低速度设置开始涡旋管。逐滴加入900μL冷冻甲醇（-20°C），同时继续轻轻涡旋管以防止细胞结块。
      11. 将细胞在冰上孵育15分钟。
      12. 使用血细胞计数器确定固定细胞的浓度。
      13. 使用台盼蓝评估固定步骤的功效。高比例的活细胞表明需要更多的固定时间。
      14. 将冷冻组织和固定细胞储存在-80°C。
  2. 从快速冷冻组织中分离细胞核，用于 scATAC-seq
    1. 培养基制备
      1. 通过结合9.77mL无核酸酶水，100μL 1M Tris-HCl（pH 7.4），100μL1 M NaCl，30μL1MMgCl2和0.1gBSA来制备裂解稀释缓冲液。
      2. 提前准备裂解稀释缓冲液，例如前一天，并储存在4°C。 在协议当天，放在冰上。
      3. 由 scATAC 试剂盒制造商提供的平衡 20x 细胞核缓冲液，从 -20 °C 到室温。短暂涡旋和离心机。
      4. 通过将5%洋地黄苷溶液在65°C水浴中孵育至沉淀溶解来制备1x裂解缓冲液。然后混合2mL裂解稀释缓冲液，20μL10%吐温-20，20μL非尼德P40替代品（可选标记IGEPAL）和4μL洋地黄素。
      5. 将1x裂解缓冲液储存在冰上。
      6. 为了制备0.1x裂解缓冲液，将1.8 mL裂解稀释缓冲液与200μL1x裂解缓冲液混合并储存在冰上。
      7. 为了制备洗涤缓冲液，将2 mL裂解稀释缓冲液和20μL10%吐温-20混合并储存在冰上。
      8. 为了制备稀释的细胞核缓冲液，将950μL无核酸酶水与50μL细胞核缓冲液（20x）混合并储存在冰上。
    2. 细胞核分离
      1. 裂解前不要解冻样品。 将500μL冷冻的0.1x裂解缓冲液加入含有冷冻样品的1.5 mL微量离心管中。立即使用颗粒杵均质化15x。
      2. 在冰上孵育5分钟。在此孵育步骤17中准备scATAC转位所需的材料。
      3. 移液器与1 mL移液管混合10x，并在冰上孵育10分钟。如果尚未完成，请在此孵育步骤中完成scATAC转位所需材料的制备。没有必要准备更多的稀释的细胞核缓冲液。
      4. 向裂解的细胞中加入500μL冷冻洗涤缓冲液。移液器混合物5x。
      5. 将悬浮液通过70μm细胞过滤器进入新的1.5mL微量离心管。每次使用新的70μm细胞过滤器一次过滤约300μL。
      6. 将收集的流通过40μm细胞过滤器传递到新的1.5mL微量离心管中并储存在冰上。
      7. 使用血细胞计数器测定细胞核浓度。根据细胞核浓度和细胞悬浮液的总体积，计算解离细胞核的总数。
      8. 在4°C下以500×g离心5分钟，并在不破坏细胞核沉淀的情况下除去上清液。
      9. 为了根据步骤2.2.2.7中确定的总细胞核计数产生细胞核储备，将细胞核重悬于足够稀释的细胞核缓冲液中以达到所需的细胞核浓度。
        注意:所需的细胞核浓度基于 scATAC-seq 实验的目标细胞核回收率，并根据制造商实验方案17 中的细胞核浓度指南确定。例如，如果最终需要 10，000 个细胞核，则细胞核储液所需的细胞核浓度在 3，080 至 7，700 个细胞核/μL 之间。最好瞄准浓度范围的中间。
      10. 使用血细胞计数器测定细胞核浓度。
      11. 立即使用制备的细胞核储液17进行scATAC转位。
  3. 甲醇固定细胞的再水合，用于 scRNA-Seq
    1. 培养基制备
      1. 为了制备洗涤/稀释缓冲液，将0.01gBSA溶解在1 mL PBS中。然后加入12.5μL 40 U / μL RN酶抑制剂并轻轻混合。存放在冰上。
    2. 细胞补液
      1. 在1.5mL微量离心管中以3000×g在4°C下离心甲醇固定细胞10分钟。 然后除去上清液。
      2. 向微量离心管中加入200μL冷冻洗涤/稀释缓冲液。在4°C下以300×g离心10分钟，除去上清液。重复共洗涤2次。
        注:在前两个步骤中准备 GEM 生成和条形码所需的材料14.
      3. 为了制备细胞储液，根据2.1.2.12中计算的总细胞数，将细胞重悬于足够的洗涤/稀释缓冲液中以达到所需的细胞浓度。优选的细胞浓度在700至1200个细胞/μL之间。
      4. 使用血细胞计数器测定细胞储液的细胞浓度。
      5. 立即使用细胞库14 进行 GEM 生成和条形码。
    3. 测 序
      1. 当执行时程分析（如在发育或疾病中）时，在多重运行中对多个样品进行序列（即单个流通池上的多个库）以减少技术变化。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该工作流程列出了使用单细胞测序研究发育表型和调节过程的策略。MULTI-seq 样品多重检测可实现初始低成本表型分析，同时配对采集和固定 scRNA-seq 和 scATAC-seq 样品有助于进行更深入的研究（图 1）。

MULTI-seq 条形码可实现多个样本的组合排序及其随后的计算反卷积。可以根据每个细胞的条形码表达来确定其原产地样品（图2A）。这些组合样品可以作为单个数据集进行分析，以便进行细胞聚类和细胞类型鉴定（图2B）。由于每个细胞在GEM生成之前都是条形码的，因此细胞二联体将很有可能显示多个MULTI-seq条形码的表达，因此可以在聚类和细胞类型鉴定之前识别和去除大多数双胞（图2C）。增加GEM生成步骤中使用的细胞数量将增加发现的双倍细胞的比例。scATAC-seq可用于生成具有细胞类型的数据集，以匹配scRNA-seq发现的细胞类...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MULTI-seq 的强大功能源于来自多个实验条件或模型的数据的无缝集成，以及在成本和限制批次效应方面的巨大优势。利用 MULTI-seq 提供了前所未有的实验室表型深度。非遗传多重检测方法，如细胞散列或细胞核散列，通过使用条形码抗体7，19，20为多路复用样品打开了大门。然而，这依赖于识别细胞或其细胞核上表达的表面蛋白的高亲和力抗体的可用性，如果这些抗体不可用或细胞不表达适当的细胞表面或核抗原，则是不可能的7。由于 MULTI-seq 利用脂质修饰的寡核苷酸条形码稳定地整合到细胞或其细胞核中，因此研究人员能够以更便宜、更广泛适用的方式从多达 96 个新鲜或固定样品中收集转录组数据6.

建议并展示对初始多链表型进行随配对的scRNA-Seq和scATAC-Seq，以了解与转录组学数据一致的基因组组织

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢约翰霍普金斯大学转录组学和深度测序核心的 Linda Orzolek 帮助对产生的文库进行测序，并感谢蒋立志进行 离体 视网膜外植体。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL、200 和微量;L、1000 和微量;L 移液器滤芯吸头
10% 吐温 20Bio-Rad1662404
100 &微量;来自 Gartner 实验室的请求 https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform？ts=5c47a897&edit_requested
=真正的
100% 乙醇Millipore SigmaE7023-500ML
100% 甲醇Millipore Sigma322415-100ML
10x 芯片支架10x Genomics1000195
10x 铬控制器 &配件套件10x GenomicsPN-120263
15mL 离心管质量生物P886-229411
40 µm FlowMi 细胞过滤器Bel-ArtH13680-0040
50 µM 锚解决方案Sigma 或向 Gartner 实验室索取https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform？ts=5c47a897&edit_requested
=真
50 µM Co-Anchor 解决方案Sigma 或向 Gartner 实验室索取https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
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=真正的
5200 片段分析仪系统安捷伦M5310AA
70 um FlowMi 细胞过滤器Bel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R 离心机VWRBK392302
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9647
铬 Next GEM 芯片 G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM 芯片 H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem 单细胞 ATAC 试剂盒 v1.110x GenomicsPN-1000175
铬单细胞 3' GEM、文库和凝胶微珠套件 v3.110x GenomicsPN-1000121
洋地黄霉素Fisher ScientificBN2006
解剖显微镜Leica
DNA LoBind 管，1.5 mLEppendorf22431021
干冰
EVA 泡沫冰盘精装配件04393-54
FA 12-毛细管阵列短型，33 cmAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp 水浴Fisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 水套式培养箱ThermoFisher Scientific3110
甘油 50% 水溶液Ricca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Bright-Line 计数室Fisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq 或 NovaSeqIllumina
Kapa HiFi 热启动 ReadyMixHiFi7958927001
低 TE 缓冲液质量生物 351-324-721
氯化镁溶液 1 MSigma-AldrichM1028
磁分离器架，用于 1.5 mL 试管Millipore Sigma20-400
磁选架，适用于 200 µL 管10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq 引物Sigma 或 IDT参见序列列表
MyFuge Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1008 Nonidet
P40 替代品Sigma-Aldrich74385
无核酸酶水Fisher ScientificAM9937
P2、P10、P20、P200、P1000 微量移液器Eppendorf
木瓜蛋白酶解离系统Worthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7.4 （1X）Fisher Scientific10010-023
Qiagen 缓冲液 EBQiagen19086
冷冻离心机 5424 REppendorf2231000655
无 RNase 的一次性颗粒杵Fisher Scientific12-141-368
RNasin 加 RNase 抑制剂PromegaN2615
RPI 引物Sigma 或 IDT参见序列列表
单索引试剂盒 N，套装 A10x GenomicsPN-1000212
单索引试剂盒 T 套装 A10x GenomicsPN-1000213
氯化钠溶液 5 MSigma-Aldrich59222C
SPRIselect 试剂盒贝克曼库尔特B23318
标准一次性移液管Fisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8 联排管USA Scientific1402-4700
Trizma 盐酸盐溶液，pH 7.4Sigma-AldrichT2194
台盼蓝溶液，0.4% （w/v）康宁25-900-CI
通用 I5 引物Sigma 或 IDT参见序列列表
Veriti 热循环仪Applied Biosystems4375786
涡旋混合器VWR10153-838
M 条形码解决方案

References

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