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颗粒模板乳化实现无需微流控的液滴分析

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DOI：

10.3791/62248

⸱

2021年3月9日

 ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, 2Chan Zuckerberg Biohub

本文内容

摘要

油包水液滴检测在分析化学、酶进化和单细胞分析中具有重要应用价值，但通常需要微流控技术来生成液滴。本文中，我们描述了一种基于颗粒模板的乳化方法，这是一种无需微流控设备即可进行液滴检测的技术。

摘要

与在体相中进行的反应相比，在单分散液滴中进行的反应具有更高的准确性和灵敏度。然而，形成可控液滴所需的微流控技术对非专业人员构成了使用障碍，限制了其广泛应用。本文中，我们介绍了一种无需微流控设备即可生成单分散液滴的方法——颗粒模板乳化法。通过使用模板化水凝胶微球，仅需简单的涡旋操作即可将样品包封于单分散液滴中。我们以无微流控的数字PCR为例，验证了该方法的有效性。

引言

液滴微流控技术利用皮升级液滴中的区室化效应，相较于体相反应，可显著提高检测的灵敏度和准确性，在化学筛选、蛋白质工程以及下一代测序中具有广泛应用1,2,3。例如，数字液滴聚合酶链式反应（ddPCR）相较于传统的定量聚合酶链式反应（qPCR）具有更高的检测准确性，可用于癌症中的遗传变异分析、致病突变的检测以及产前诊断4,5,6。然而，液滴微流控技术面临的一个挑战是需要使用微流控装置对样品进行分液；尽管微流控技术能够对液滴特性实现精确控制，但其构建和操作需要专门的技术 expertise7,8。因此，基于液滴的方法目前主要局限于专业实验室，或在极少数情况下，仅限于有商用仪器可用的应用场景9,10。为了拓展液滴检测技术的应用，必须克服对专用微流控仪器的依赖这一障碍。

本文介绍了一种无需微流控技术的单分散液滴反应方法——颗粒模板乳化法（Particle Templated Emulsification, PTE）。在PTE中，通过简单的涡旋操作，模板颗粒即可将样品包裹进载油中形成液滴（图1）。随着体系混合，水相部分逐渐断裂为尺寸不断减小的液滴，直至每个液滴中仅包含单个颗粒；此时液滴无法进一步分裂，因为继续断裂将导致颗粒破裂。样品以壳层形式包裹在颗粒周围，从而将分散的细胞、试剂或功能基团封装于液滴之中（图1D）。因此，PTE仅需常规涡旋仪即可完成液滴反应，无需特殊设备或专业技术。此外，液滴生成仅需数秒，远快于微流控技术所需的数分钟甚至数小时；且产物量与容器体积成正比，而非依赖设备运行时间，因而具有极佳的可扩展性。这些优势使PTE成为在多种不适合使用微流控技术的场景下开展液滴分析的理想选择。本文中，我们演示了PTE的操作流程，并利用该方法实现了数字液滴PCR（ddPCR）。

figure-introduction-1
图1．颗粒模板乳化过程示意图。（A）将模板颗粒与试剂混合。（B）离心后去除过量试剂。（C）在加入油相之前加入模板分子。（D）涡旋振荡生成包含单个模板分子的液滴。（E）随后进行热循环和成像，实现对目标模板的数字液滴分析。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 用于颗粒模板乳化法的水凝胶颗粒的制备。

用于颗粒模板乳化法的水凝胶颗粒可通过两种不同的方法制备。

  1. 使用市售颗粒的制备方法
    1. 加入0.5 g与PTE相容的干燥聚丙烯酰胺颗粒（例如，Bio-Gel P-60 Gel（Bio-Rad），45-90 µm 将直径）加入到50 mL锥形管中的30 mL无菌水中，充分混匀。室温孵育30分钟。
  2. 采用微流控技术制备颗粒
    注意：可使用市售的液滴生成装置（例如 QX200 Drop Generator (Bio-Rad)、RayDrop (Fluigent) 等）或定制的微流控设计来制备适用于 PTE 的聚丙烯酰胺微粒。
    1. 定制母模的制备
      1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计软光刻掩模。使用高分辨率打印机打印光掩模 10 µm 电路板薄膜的分辨率。
      2. 在3英寸硅片的中心加入1 mL光刻胶。使用匀胶机旋转涂覆以形成 50 µm 以500 rpm转速旋涂光刻胶30秒，随后以1250 rpm转速旋涂30秒。将晶圆置于设定温度的热板上 95 °C 15分钟以蒸发溶剂。
      3. 用盖玻片将光掩模固定在硅片上，并在准直的190 mW光照下曝光硅片， 365 µm 紫外LED照射2.5分钟。将晶圆置于设定温度的加热板上 95 °C 5 分钟，用于曝光后烘烤。
      4. 将涂有光刻胶的硅片浸入100%丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）溶液中显影，时间最长不超过15分钟。随后用新鲜的100% PGMEA冲洗硅片，再用100%异丙醇冲洗。用空气吹干硅片。
      5. 通过将晶圆置于设定温度的加热板上干燥，以去除残留的异丙醇 95 °C 1 分钟。将晶圆放入干净的 3 英寸培养皿中。
    2. 定制微流控装置的制备
      1. 按质量比10:1混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）硅胶基质与固化剂。将混合后的PDMS置于真空干燥器中，在常压真空条件下脱气，直至无可见气泡。
      2. 将脱气后的PDMS倒入培养皿中的模具上，确保硅晶片完全浸没。对硅晶片和PDMS进行脱气处理，以去除倾倒过程中可能产生的任何气泡。
      3. 将硅片和PDMS放入设定温度的烘箱中，固化PDMS 65 °C 至少 60 分钟。使用解剖刀从培养皿中切除含有微流控结构的 PDMS 块。操作时需格外小心，避免损坏硅模板上的任何结构。
      4. 使用0.75 mm活检打孔器在PDMS块上对应微流控装置的进样口和出样口位置打孔。通过反复粘贴和撕去包装胶带，清除PDMS块表面的灰尘和颗粒污染物。
      5. 用100%异丙醇冲洗一块50 mm × 75 mm的玻璃载玻片，随后将表面空气干燥。使用1 mbar的O₂对玻璃载玻片和PDMS（微结构面朝上）进行等离子体处理。2 使用等离子体键合仪处理血浆1分钟。
      6. 将经过等离子体处理的PDMS（微结构面向下）贴附到经等离子体处理的载玻片（处理面朝上）上。将载玻片放入设定温度的烘箱中 65 °C 至少30分钟以完成结合。
      7. 用氟化表面处理剂处理所有微流控通道，以确保表面疏水性并防止润湿。将装置在 65 °C 至少10分钟。
    3. 模板颗粒的制备
      1. 制备一种聚丙烯酰胺（PAA）溶液，包含6.2%丙烯酰胺、0.18% N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.05%过硫酸铵和0.005%四甲基乙二胺′-甲叉双丙烯酰胺和0.3%过硫酸铵。将该溶液吸入1 mL注射器，配备28G针头。
      2. 制备不混溶的连续相，其中包含 5%（w/w）氟化表面活性剂和 1% N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）的氢氟醚（HFE）油溶液，用于液滴的生成与稳定。将该溶液装入新的 1 mL 注射器中。
      3. 将装有PAA和含HFE溶液的注射器分别装入注射泵（例如，NE-501）。使用聚乙烯管将两支注射器连接至微流控装置，聚乙烯管需插入注射器端口并接入装置。连接前，先启动泵以排空管路中的空气。
        注意：根据型号不同，注射泵可通过内置输入、厂商软件或自定义脚本进行控制（脚本可从 https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program 获取）。
      4. 以PAA和HFE油为输入运行液滴生成装置 300 µL/h 和 500 µL/h分别收集1 mL液滴至15 mL收集管中，室温孵育3 h以完成聚合。孵育结束后，用移液器移除下层油相。
      5. 向15 mL收集管中加入1 mL体积分数为20%的全氟-1-辛醇（PFO）HFE油溶液作为化学破乳剂。混匀后，将15 mL收集管在2000 x g 孵育2分钟。用移液器吸除PFO/HFE上清液。重复一次。
      6. 向15 mL收集管中加入2 mL 2%的山梨醇单油酸酯正己烷溶液，涡旋混匀。以3000 x g 孵育3分钟。用移液法吸除上清液以去除表面活性剂/己烷溶液。重复2次。
      7. 加入5 mL TEBST缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，274 mM NaCl，5.4 mM KCl，20 mM EDTA，0.2% Triton X-100），充分混匀。在3,000 x g 3分钟。用移液器吸除上清液。重复3次。
      8. 用 5 mL TEBST 重悬。该溶液可保存于 4 °C 无限期地

2. 颗粒模板乳化法。

在模板颗粒制备完成后，采用PTE将样品和试剂包裹于液滴中。

  1. 将聚丙烯酰胺颗粒在6000 x g 条件下离心1分钟，使颗粒沉淀，然后用移液器吸除上清液，并用无菌水重悬颗粒。重复此步骤3次，以确保彻底去除任何残留的TEBST。
  2. 使用血细胞计数板（或等效设备）测定模板颗粒的浓度和直径。通过测量像素下的直径并将其转换为微米来计算单个颗粒的直径。可通过将血细胞计数板（或等效设备）作为校准载玻片，测量已知网格距离的像素数，从而计算像素与微米之间的换算关系。
  3. 在新的1.5 mL微量离心管中，根据表1，使用PCR主混合液、相应的引物和荧光素水解探针配制分散相。将混合物置于试管旋转仪中，在室温下以轻柔振荡（10 rpm）孵育5分钟，以确保各组分均匀分布。
    ​注意：颗粒的体积和目标浓度基于泊松装载原则。一般规则是，颗粒数量应比待包封样品数量高一个数量级。对于浓度未知的样品，需进行系列稀释，以确保实现泊松装载。
体积试剂
100 μL颗粒（450 颗粒/μL）
200 μL2x PCR 预混液
18 μL10 μM 正向引物
18 μL10 μM 反向引物
18 μL10 μM 探针
0.8 μLTriton X100
45.2 μL无核酸酶水

表1. 数字化液滴PCR中与PTE联用的PCR预混液的配制。

  1. 将分散相在6000 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液。记录所提取的上清液体积，并结合2.3中计算的总分散相体积，确定沉淀体积。
    注意：所提取的上清液体积取决于颗粒的堆积程度、直径和浓度，预期最小体积为300 µL。
  2. 向2.4步骤所得沉淀中加入1 µL浓度为1.62 pg/µL的Saccharomyces cerevisiae基因组DNA，通过移液或剧烈轻弹充分混匀。
    注意：过量的水相成分可能降低包封效率。若样品体积超过沉淀体积的1%，需对样品进行浓缩。若无法浓缩样品，则应根据样品体积相应调整PCR主混合液及最终沉淀体积。PTE技术可实现对小体积（10 µL）至大体积（2 mL）模板颗粒的乳化。PCR主混合液（2.3）和油相（2.6）可根据目标（2.3）和实测（2.4）的颗粒沉淀体积按比例调整。
  3. 向离心管中加入200 µL含2%氟化表面活性剂的HFE油，作为乳化用的不溶性连续相。通过移液或轻弹/弹击管壁确保沉淀完全悬浮。随后在3000 rpm条件下涡旋振荡30秒。
    注意：不同品牌和型号的涡旋振荡器，其3000 rpm对应的设置可能有所不同。
  4. 静置乳液1分钟。移除底部100 µL油相，并用等体积新鲜的含2%氟化表面活性剂的HFE油替换。轻轻翻转离心管数次以混匀。重复此步骤3–5次，或直至小的卫星液滴被完全去除。

3. 数字化液滴PCR及分析。

  1. 静置 2-5 分钟后，移除下层油相。用氟碳油中的 5% 氟表面活性剂（例如 FC-40）补足该体积。
  2. 使用宽口吸头，小心将 100 µL 样品移入 200 µL PCR 管中。将 PCR 管放入热循环仪，并按照 表 2 运行程序。
步骤温度持续时间备注
195 °C2 min
295 °C30 s
350 °C90 s
472 °C60 s
5重复步骤 2 至 4，共 34 次
672 °C2 min
74 °C保持

表2. 使用PTE乳液进行数字液滴PCR的热循环条件。

  1. 使用宽口移液器吸头将样品移取到计数板上，用于荧光成像。采用荧光显微镜对样品进行成像，激发波长为 490 nm，发射检测波长为 525 nm。
  2. 定量分析呈阳性的荧光液滴（Np）和总液滴数（NT），利用阳性液滴比例（Np/NT）及泊松统计学验证模板分子的存在，并计算其数量（λ）：
    figure-protocol-1
  3. 通过以下公式计算 95% 置信区间（zc = 1.96）：
    figure-protocol-2
  4. 根据步骤 2.5 中加入的样品体积（ν，单位为 µL），使用下方给出的公式计算样品浓度（分子数/µL）。通过技术重复样测定样品浓度的平均值和标准偏差。
    figure-protocol-3

结果

figure-results-1
图2采用颗粒模板乳化法将样品封装至液滴中 (A) 用于颗粒模板乳化法的模板颗粒。B) 离心后将模板颗粒沉淀与上清液分离。C) 由颗粒模板乳化产生的液滴D可识别的水相外壳 请点击此处以查看此图的放大版本。

在PTE中，乳液的单分散性由模板颗粒的单分散性决定，因为液滴的直径略大于颗粒。因此，均一的颗粒对于实现可控的PTE包封至关重要11。目前存在多种制备均一模板颗粒的方法，包括化学法（溶胶-凝胶法、乳液聚合法）、流体动力学法（膜乳化法、均质化法）以及过滤法。其中，微流控方法尤其能够实现极佳的单分散性（图2A），并可进一步对颗粒进行工程化设计，以增强其在PTE中的功能12。此外，模板颗粒也可直接购买，但其均一性虽然足够使用，通常仍低于微流控法制备的颗粒11。

进行PTE操作时，先将颗粒与待包封的样品混合（图1A），然后通过离心和移液去除上清液（图1B），PCR管底部可见颗粒沉淀的照片展示了这一过程（图2B）。随后加入含有稳定型表面活性剂的包封油相（图1C），轻柔移取样品后涡旋震荡30秒（图1D），以形成乳液（图2C）。所得液滴包含一个颗粒核心以及由初始样品构成的水相外壳，其中含有反应所需的试剂、目标分子和细胞（图2D）。与液滴微流控包封类似，离散的实体（如小珠或细胞）被随机包封，并遵循泊松分布，但由于PTE物理机制的特性，几乎所有液滴均含有一个模板颗粒。

figure-results-2
图3．颗粒模板乳化液滴的鉴定与纯化。（A）由于涡旋振荡不足，导致每个液滴中包含多个颗粒，从而产生不均匀液滴的示例。（B）颗粒模板乳化后卫星液滴和主液滴的预期分布情况，以及（C）水包油相的分离情况。（D）经油相洗涤后的乳化结果。（E）在颗粒模板乳化过程中，由于残留上清液导致卫星液滴过度生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

即使在成功的相转移乳化（PTE）过程中，也会存在双核或三核液滴，尽管只要其出现频率较低，通常对反应的贡献可忽略不计。在保持足够外壳数量的同时，降低多核液滴的频率需要对工艺参数进行优化，包括表面张力、颗粒间黏附力、样品黏度、容器尺寸以及涡旋强度和时间。例如，若乳化过程未充分优化，可能产生粒径分布不均的液滴，并含有大量模板颗粒（图3A），表明涡旋作用不足以使样品完全乳化。在此情况下，可添加去污剂以减少颗粒间黏附并降低表面张力，或提高涡旋强度或延长涡旋时间。另一个常见问题是产生过多的卫星液滴，即微小的空液滴（图3B）。在PTE乳化体系中，卫星液滴的生成可能难以避免，具体取决于样品与载油之间的界面张力及流变特性。然而，它们通常源于乳化前未充分去除多余的样品（图2B），或因涡旋强度过高，导致液滴外壳被剥离。在成功的PTE乳化中，卫星液滴所占总体积应不超过约10%（图3C）11。在此水平下，它们对反应的贡献通常可忽略，可不予考虑。出于美观目的，可通过新鲜油洗涤去除乳液中的卫星液滴（图3D）。

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图4．基于颗粒模板乳化数字液滴PCR的评估。（A）液滴的荧光成像可识别出呈荧光阳性的液滴和无荧光的阴性液滴。（B）利用数字液滴PCR检测稀有模板或低浓度模板。（C）模板过量导致每个液滴中模板分子数量不均一。 请点击此处查看该图的高清版本。

为了展示PTE的实用性，我们利用它进行了无需微流控的数字PCR11。通过该过程，我们将包含S. cerevisiae基因组DNA的样品进行包封，并进行热循环。在数字PCR中，含有扩增靶标的液滴会发出荧光，而未含有靶标的液滴则保持低荧光。因此，荧光液滴的存在表明含有靶标，通过计数阳性液滴即可直接定量靶标数量（图4A）。荧光液滴的数量与靶分子数量成正比：当靶标稀少时，阳性液滴较少（图4B）；当靶标丰富时，阳性液滴较多（图4C）。与封装其他离散组分类似，靶标的封装遵循泊松分布，因此可将阳性液滴的比例转换为靶标浓度（图4D），从而证明了利用PTE进行数字PCR的能力11。

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图5。使用市售PAA进行数字液滴PCR的演示。（A）液滴的荧光成像可识别出无荧光信号的阴性液滴。（B）通过数字液滴PCR检测模板的低浓度。（C）通过数字液滴PCR检测模板的高浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

使用市售的聚丙烯酰胺微粒（图5）可重复获得上述结果，这证明了PTE能够利用市售聚丙烯酰胺微粒进行标准数字PCR，并在相同范围内实现准确测量。

补充文件。  请点击此处下载该文件。

讨论

PTE 通过涡旋使颗粒将样品封装成单分散的液滴。除了操作简单和易于获取之外，PTE 还具有多种额外优势，包括能够瞬时生成大量液滴。此外，该过程可在封闭的离心管中进行，无需将样品转移至微流控装置，从而简化整体操作流程，并减少样品污染或损失的风险。模板颗粒还提供了一种手段，可用于设计最终液滴反应的内容。例如，可通过调控颗粒的尺寸、化学性质和润湿性，实现对特定生物分子或细胞的靶向捕获；同时，可在颗粒表面展示酶、活性物质或核酸等功能基团，以促进反应，如用于单细胞测序或功能表征。尽管该方法具有灵活性，但其应用仍存在一些重要限制。例如，目前尚无法像微流控技术那样在液滴形成后添加组分，因此所有反应组分必须在封装前加入；这就要求试剂在液滴生成前保持相容性和稳定性，对于不稳定的组合，通常可通过在冰上快速混合并乳化样品来解决。或者，也可使用可通过光或热等外部刺激触发的反应性组分13。因此，PTE 为非专业人员提供了一种灵活且可扩展的液滴分析方法。结合其固有的简便性和灵活性，PTE 非常适用于多种液滴应用的实施与开发。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究开发该方案得到了美国国立卫生研究院（R01-EB019453-02）、国家情报总监办公室情报高级研究计划活动（通过Raytheon BBN Technologies Corp，合同号N66001-18-C-4507）、Chan-Zuckerberg Biohub研究员项目以及美国国防高级研究计划局（通过德克萨斯A&M大学）的资助。&M大学（W911NF1920013）以及通过约翰斯·霍普金斯大学应用物理实验室获得的美国疾病控制与预防中心资助（75D30-11-9C-06818（CDC3））。本文所表达的观点和结论均为作者个人意见，不应被解读为上述机构或美国政府的官方政策，无论明示或暗示。尽管文中存在版权标注，美国政府仍被授权为政府用途复制和分发重印本。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 注射器滤器Milipore SigmaSLGP033RS
0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo-Fisher15575020
0.75 mm 活检打孔器World Precision Instruments504529
1 mL 注射器BD309628
1H,1H,2H-全氟-1-辛醇（PFO）Sigma-Aldrich370533
1 M Tris-HCl，pH 8.0Thermo-Fisher15568025
27 号针头BD305109
3" 硅片，P 型，未使用测试级University Wafers447
3D 打印离心机注射器支架(定制)(定制)
丙烯酰胺溶液，40%，用于电泳，无菌过滤Sigma-AldrichA4058-100ML
过硫酸铵Sigma-AldrichA3678-25G
Aquapel（氟化表面处理剂）Pittsburgh Glass Works47100
正己烷Sigma-Aldrich139386
FC-40 氟化油Sigma-AldrichF9755
异丙醇Sigma-Aldrich109827
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺Sigma-Aldrich146072-100G
NaClSigma-AldrichS9888
Novec-7500 工程流体（HFE 油）3M98-0212-2928-5
聚乙烯管Scientific CommoditiesB31695-PE/2
氟化表面活性剂Ran Biotechnologies008-FluoroSurfactant
PGMEA 显影液Sigma-Aldrich484431
光刻掩模CadArt Services(定制)
Platinum 多重 PCR 预混液（Taq 预混液）Applied Biosystems4464263
旋涂仪Specialty Coating SystemsG3P-8
Span 80（单油酸山梨醇酯）Sigma-Aldrichs6760
SU-8 3025 光刻胶Kayaku17030192
Triton X-100（辛基苯基聚氧乙烯醚）Sigma-Aldricht8787
Tween 20（聚山梨酯 20）Sigma-Aldrichp2287
Platinum 多重 PCR 预混液（Taq 预混液）Applied Biosystems4464263
酵母 FWDIDT5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′
酵母 REVIDT5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA
AC-3
酵母探针IDT5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk
FQ/-3′
EVOS FL AUTOLife Technologies
EVOS LED 模块，GFPLife Technologies AMEP4651
SYLGARD 184 试剂盒 1.1 磅（PDMS 基液和固化剂） Dow CorningDC4019862
TEMEDThermo Fisher17919
酿酒酵母基因组 DNAMilipore69240-3
扩展型等离子清洗仪（等离子键合仪）Harrick PlasmaPDC-002 (230V)

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PCR

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