3D打印 体外 通过交替黏性-惯性力喷射法制备水凝胶微载体

摘要

本文介绍了一种由交变粘性-惯性力驱动的温和3D打印技术，可用于构建水凝胶微载体。自制喷嘴具有灵活性，可方便地更换以适应不同材料和直径。可获得并收集直径为50-500 µm的细胞结合微载体，用于后续培养。

摘要

微载体是直径为60-250 µm、具有较大比表面积的微珠，常用于大规模细胞培养的载体。微载体培养技术已成为细胞学研究中的主要技术之一，广泛应用于大规模细胞扩增领域。微载体在体外组织工程构建和临床药物筛选中也显示出日益重要的作用。in vitro组织工程构建和临床药物筛选。目前制备微载体的方法包括微流控芯片和喷墨打印技术，这些方法通常依赖于复杂的流道设计、不相容的两相界面以及固定的喷嘴形状。这些方法在应用于多种生物墨水时，面临喷嘴加工复杂、更换喷嘴不便以及挤出力过大的挑战。本研究采用一种称为交替黏性-惯性力喷射的3D打印技术，实现了直径为100-300 µm的水凝胶微载体的构建。随后将细胞接种于微载体上，形成组织工程模块。与现有方法相比，该方法具有喷嘴尖端直径自由可调、喷嘴切换灵活、打印参数可自由控制以及适用于多种生物活性材料的温和打印条件等优势。

引言

微载体是直径为60-250 µm、具有较大比表面积的微珠，常用于细胞的大规模培养^1,2。其外表面为细胞提供了丰富的生长位点，内部则为细胞的空间增殖提供了支撑结构。球形结构还便于对pH、O₂以及营养物质和代谢产物浓度等参数进行监测和控制。当与搅拌式生物反应器联合使用时，微载体可在相对较小的体积内实现比传统培养更高的细胞密度，从而为大规模培养提供了一种经济有效的方法³。微载体培养技术已成为细胞学研究中的主要技术之一，在干细胞、肝细胞、软骨细胞、成纤维细胞及其他结构的大规模扩增领域已取得显著进展⁴。此外，微载体也被认为是理想的药物递送载体和自下而上的构建单元，因此在临床药物筛选和体外组织工程修复中发挥着日益重要的作用⁵。

为了满足不同应用场景下的力学性能要求，已开发出多种类型的水凝胶材料用于微载体的构建^6,7,8,9,

方案

1. 细胞培养

1. 在高糖 Dulbecco 改良最低必需培养基（H-DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 非必需氨基酸溶液（NEAA）、1% 青霉素 G 和链霉素，以及 1% 谷氨酰胺补充剂，配制成 A549 细胞的培养基。
2. 将 A549 细胞在 37 °C、5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中培养。
3. 当细胞融合度达到约 80% 时，使用胰蛋白酶消化进行传代。
   1. 在 T75 培养瓶中加入 3 mL 胰蛋白酶，在 37 °C 下处理 3 分钟，然后加入 6 mL 培养基以终止消化。
   2. 用移液器吹打培养基，收集松散贴壁的细胞。
   3. 以 72.5 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，并用 3 mL 新鲜培养基重悬细胞。
   4. 将 1 mL 细胞悬液转移至含有 10 mL 新鲜培养基的新 T75 培养瓶中。每 2 天更换一次培养基。

2. 喷嘴的制备

1. 按照制造商的说明将玻璃微量移液管装载到拉制仪上。微喷管的外径、内径和长度分别为 1.5 mm、1.1 mm 和 100 mm。
2. 设置拉制仪的拉制参数。默认情况下，HEAT、PULL、VELOCITY、TIME 和 PRESSURE 的....

结果

制造了具有不同会聚速率和直径的打印头，以实现多种材料的打印。随着拉伸强度增加而获得的喷嘴如图所示 图1B喷嘴被分为三个区域：储液区（III）、收缩区（II）和喷头区（I）。储液区为喷嘴未加工部分，用于提供液体静压及生物墨水的输入。收缩区是产生向下驱动力的主要区域。拉力强度对喷头区有显著影响，拉力越长，收敛速率越低。喷头区越窄且越长，打印过程中的表面张力越大，导致离散微液滴的形成更加困难，但有利于后续操作中切割出更小直径的喷头尖端。随后，使用针头锻造仪器在指定直径处截断喷头图1C）。具有不同直径的吸头，包括 100、120、150 和 200 µm，可用于制备不同尺寸的微载体，满足不同应用的需求 体外 微组织

首先通过在培养皿上打印液滴来验证打印过程的稳定性和可控性。使用30 µm尖端喷嘴，多种生物墨水（包括PBS、1.5%海藻酸钠和1.5%明胶）均实现了稳定打印（图2A，.......

讨论

本文所述方案提供了多种水凝胶微载体的制备方法及后续细胞接种的操作指导。与微流控芯片和喷墨打印方法相比，AVIFJ法在构建微载体方面具有更高的灵活性和生物相容性。该方法采用独立喷嘴设计，可兼容多种轻质喷头，包括玻璃微量移液管，适用于此类打印系统。其高度可控的加工过程允许自由调节包括储液腔体积、喷头内径和喷头形状在内的各项参数。此外，一次性喷嘴便于在不同材料之间切换时进行灭菌处理，避免因重复使用可能带来的污染风险。最后，在打印过程中，仅对喷嘴施加微小且快速的位移，而非强烈的力或热条件，从而最大程度地保持了所打印生物墨水原有的物理和化学特性；这一特点在生物材料应用中具有显著优势。

成功制备合适尺寸微载体最关键的步骤是：1）准备具有适当直径尖端的喷嘴，以及2）根据所打印生物墨水的黏度调整合适的采样频率和Vpp。通过去除卫星液滴并施加外部驱动力，可进一步实现微载体构建的稳定性。增加参数有助于微载体的形成，但过强的驱动力是产生卫星微载体的主要原因，会导致微载体尺寸不均一。因此，为提高微载体尺寸的均匀性，建议采用适当（而非过强）的采样频率和Vpp。提高微载体稳定性的另一个方面是施加外部驱动力。外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549 细胞	ATCC	CCL-185	人非小细胞肺癌细胞系
明场显微镜	Olympus	DP70
共聚焦显微镜	Nikon	TI-FL
胎牛血清，FBS	BI	04-001-1ACS
明胶	SIGMA	G1890
玻璃移液管	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	杜氏改良伊格尔培养基
辣根过氧化物酶粉末	SIGMA	P6782
疏水剂	3M	PN7026	按照生产商说明稀释后使用
微电极拉制仪	narishige	MF-900
非必需氨基酸，NEAA	GIBCO	11140-050	非必需氨基酸
青霉素 G 和链霉素	GIBCO	15140-122
培养皿	SIGMA	P5731-500EA
拉针仪	sutter instrument	P-1000
海藻酸钠	SIGMA	A0682
胰蛋白酶	GIBCO	25200-056
大鼠尾Ⅰ型胶原溶液	SIGMA	C3867