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方法文章

用于识别清醒束缚家兔癫痫发作、心律失常和呼吸暂停的多系统监测

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DOI：

10.3791/62256

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2021年3月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Upstate Medical University, 2Department of Neurology, Upstate Medical University, 3Strong Epilepsy Center, Departments of Neurology, Anesthesiology / Perioperative Medicine, & Pediatrics, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

通过同步视频-脑电图-心电图-血氧饱和度-二氧化碳监测，我们建立了一种评估兔模型诱发心律失常和癫痫发作易感性的方法。这一新型记录系统为测试治疗药物的有效性和安全性提供了平台，并能够捕捉最终导致猝死的多系统复杂事件级联过程。

摘要

离子通道病患者发生癫痫发作和致死性心律失常的风险较高。癫痫患者（即“癫痫性心脏病”）中心脏病和心律失常的患病率更高。此外，已有报道称在癫痫发作前后可出现心脏和自主神经功能紊乱。每年每1,000名癫痫患者中有1例死于癫痫猝死（SUDEP）。目前SUDEP的发病机制尚未完全阐明。脑电图（EEG）和心电图（ECG）是临床中常用于检测和研究癫痫发作及心律失常基础机制或诱因的两种技术。尽管已有大量关于该方法学的研究和描述集中于啮齿类动物，但其心脏电活动与人类存在显著差异。本文介绍了一种在清醒家兔中非侵入性同步记录视频-脑电图-心电图-血氧饱和度-二氧化碳监测的方法。由于家兔与人类的心脏电生理功能相似，因此家兔是开展转化性诊断与治疗研究的理想模型。本文除阐述数据采集的方法学外，还讨论了分析家兔神经-心脏电活动功能及病理状态的分析方法，包括心律失常检测、脑电图谱分析以及为束缚状态家兔建立的癫痫发作评分量表。

引言

心电图（ECG）在临床中常规用于评估心脏电传导以及电激活-复极过程的动态变化。心电图对于心律失常、缺血和梗死的检测、定位及风险评估具有重要意义。通常将电极贴附于患者的胸部、手臂和腿部，以提供心脏的三维视图。当心肌去极化方向朝向电极时，产生正向偏转；当去极化方向远离电极时，则产生负向偏转。心脏周期的心电图成分包括心房去极化（P波）、房室传导（P-R间期）、心室兴奋（QRS波群）和心室复极化（T波）。在多种哺乳动物（包括人类、兔、犬、豚鼠、猪、山羊和马）中，心电图与动作电位的测量结果具有高度相似性 1,2,3。

兔子是心脏转化研究的理想模型。兔心在离子通道组成和动作电位特性方面与人心脏相似2,4,5。兔子已被用于构建遗传性、获得性和药物诱导的心脏疾病模型2,4,6,7,8。在人类和兔子中，心脏心电图（ECG）及动作电位对药物的反应具有高度相似性7,10,11。

啮齿类动物的心率和心脏电活动去极化-复极化过程与兔、人类及其他较大型哺乳动物存在显著差异12,13,14. 啮齿类动物的心脏跳动频率约为人类的10倍。与人类 和兔心电图中明显的等电位ST段不同，啮齿类动物心电图中不存在ST段14,15,16。此外，啮齿类动物具有QRS-r'波形，并伴有倒置的T波14,15,16。在QT间期的测量方面，啮齿类动物与人类及兔之间也存在显著差异14,15,16。此外，正常心电图参数在人类与啮齿类动物之间也大不相同12,15,16。这些心电图波形的差异可归因于动作电位形态以及驱动心脏复极化的离子通道之间的不同9,14。在啮齿类动物中，短暂外向钾电流是短时程（无平台期）心肌动作电位形态中的主要复极化电流；而在人类和兔中，动作电位具有明显的2相平台（phase-2 dome），且延迟整流钾电流（IKr 和 IKs）是人类和兔中主要的复极化电流4,9,13,17。重要的是，IKr 和 IKs 在啮齿类动物中的表达缺失或极低，且由于 IKr 和 IKs 的时间激活动力学特性，其在啮齿类动物的心肌动作电位形态中并不发挥作用9,13。因此，兔在评估药物诱导性、获得性及遗传性心电图异常和心律失常机制方面提供了更具转化价值的动物模型4,7,13。此外，已有大量研究表明，在原发性心脏疾病（如长QT综合征18,19,20）或神经系统疾病（如癫痫21,22,23,24）中均存在神经与心脏电活动异常，因此在能够更准确模拟人类生理状态的动物模型中研究其潜在机制显得尤为重要。尽管啮齿类动物可能足以模拟人类大脑功能，但其并非人类心脏生理的理想模型7。

脑电图（EEG）利用电极（通常放置于头皮或颅内）记录大脑皮层的电活动。这些电极能够检测大脑皮层附近成簇锥体神经元放电频率和同步性的变化25。该信息可用于评估脑功能以及清醒/睡眠状态。此外，脑电图有助于定位癫痫样放电活动，并区分癫痫发作与非癫痫性事件（例如心因性非癫痫样活动和心源性事件）。为了诊断癫痫类型、诱发因素及发作起源，癫痫患者需接受多种可能诱发发作的操作 。常用方法包括过度通气、光刺激和睡眠剥夺。本方案演示了在兔模型中使用光刺激诱发脑电图异常及癫痫发作的方法26,27,28,29。

同步视频-脑电图（EEG）-心电图（ECG）记录已广泛应用于人类和啮齿类动物，以评估发作前、发作期和发作后状态下的行为、神经元及心脏活动30。尽管已有若干研究分别在兔中进行脑电图和心电图记录4,31,32,33，但在清醒且固定状态的兔中实现同步视频-脑电图-心电图记录的系统尚未完善建立34。本文描述了一种用于在清醒兔中同步记录视频-脑电图-心电图 -二氧化碳浓度监测-血氧饱和度监测数据的方案设计与实施方法，旨在评估神经-心脏电活动及呼吸功能。通过该方法获得的结果可用于揭示心律失常、癫痫发作、呼吸紊乱及躯体表现之间的易感性、诱因、动态特征 和一致性 。本实验系统的一个优势在于，无需使用镇静剂即可获取清醒状态下的记录数据。兔在固定装置中可保持≥5小时，且活动极少。由于麻醉药物会干扰神经元、心脏、呼吸及自主神经功能，清醒状态下的记录能够提供最接近生理状态的数据。

该记录系统最终可能提供详细的见解，以促进对癫痫猝死（SUDEP）相关的神经、心脏和呼吸机制的理解。除了上述神经和心脏监测外，近期证据还支持呼吸衰竭在癫痫发作后猝死中的潜在作用35,36。为监测兔的呼吸状态，采用血氧饱和度监测和二氧化碳浓度监测来评估癫痫发作前、中、后的呼吸系统状态。本文所述方案旨在评估药物和光刺激诱发兔癫痫发作的阈值。该方案可检测可能不会引起明显体征的细微脑电图（EEG）和心电图（ECG）异常。此外，该方法还可用于新型药物和器械的心脏安全性及抗心律失常有效性测试。 

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方案

所有实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南以及上州医科大学动物护理与使用委员会（IACUC）的规定进行。此外，本方案的概要见图1。

1. 准备记录设备

  1. 将计算机连接至带有64针头盒的放大器。
    注意：每只动物头部四个象限各植入一根直型皮下头皮针电极（7 或 13 mm），用于记录脑电图，胸部植入三根弯型皮下针电极（13 mm，35˚ 心电图（Einthoven）导联夹角’s 三角形），右腿放置一个弯曲的皮下针状接地电极，头部中央放置一个直的皮下头皮针电极作为参考电极。
  2. 为了制作每个8th 在头箱上固定参考电极，并更新采集软件设置中的采集选项卡，使参考电极为 “独立的” （即研究模式）。
    注意：此设置可通过一个放大器、模数转换器和计算机同时记录最多7只动物的信号，每只动物配备7个电极，另加一个专用参考电极和一个接地电极。所有电极均以单极导联方式采集信号，并以头部中心为参考点。在记录过程中或记录后，可另行设置双极导联和加压导联等其他导联配置。 由于该装置能够同时记录多只动物的信号，因此每只动物的接地电极均并联连接至放大器的接地输入端图2).
  3. 将兔子从笼中取出并称重，以计算每只动物所需的适当药物剂量。将兔子放入运输箱中，并转移至独立房间，以尽量减少对非实验动物的应激。本研究使用了雄性和雌性新西兰白兔及其后代。实验在兔子上进行 > 1月龄。实验时，这些兔子的体重在0.47之间 – 5.00 kg
    注意：由于兔子需要处于同一房间内并位于摄像机视野中，因此不要将兔子完全隔离。一只兔子可能会通过视觉或听觉刺激影响另一只兔子，造成应激反应。因此，在进行光刺激实验时，理想的做法是每次仅让一只兔子待在房间内。对于其他所有实验，则应在保证所有兔子均处于视频摄像机视野范围内的前提下，尽可能将它们分开安置。理想情况下应使用隔板，或每次仅观察一只动物。不过在本研究中，该因素并未构成显著的混杂影响，因为兔子’ 实验期间心率保持相对稳定，且频繁出现睡眠纺锤波。同时对多只动物进行记录，可确保对照组和实验组动物的数据均在相同的环境条件下获取。

2. 植入脑电图-心电图电极 并连接呼吸监测仪

  1. 从运输箱中取出一只兔子，放在坐着的研究人员腿上。
  2. 将兔子垂直握住，并使其靠近操作者’身体。
  3. 将兔子置于仰卧位’调查人员的头部’s 膝盖，以及兔子’头部低于身体其他部位。
    注意：此操作可使动物放松，并尽量减少在放置电极时其试图移动或逃脱的可能性。
  4. 现在 确保兔子呈仰卧位固定后，让第二位研究人员将毛发拨开，直至能够识别并分离出皮肤与下方组织。
  5. 插入 35˚ 每个腋下皮下植入弯曲电极（图3A).
    注意：应将电极推入皮肤，使其牢固地钩在皮肤内，但不要穿透更深层的结构。让电极进入皮肤后再穿出（贯穿式）可降低在将兔子放入固定装置时或实验过程中因动物移动而导致导联脱落的风险。图 3B所有电极在放置前均需用70%乙醇灭菌。
  6. 将导联电极置于胸部右侧和左侧前肢后方，以及腹部左侧后肢前方。将接地针式电极置于腹部右侧后肢前方。图 4A).
  7. 所有心电图导联正确放置后，将兔子恢复至俯卧位，导联线沿兔子腹部一侧引出，然后将兔子转移至合适尺寸的固定器中（例如，6号" ×18" × 6").  将兔子放入固定器时，将松动的导线向上拉，以尽量防止兔子用腿拔出电极。用胶带将导线固定在固定器侧面，以免实验过程中导线被兔子压到下方。图4B).
  8. 将兔放入固定器中，下压颈部固定装置并锁定。同时，将后肢向上移至动物腹部下方，并固定后部约束装置。
    ​注意：应确保颈圈下方的空间可容纳1-2根手指，以确认其松紧适度，不过紧。特别是在可能存在运动活动的实验过程中，务必收紧固定装置，以尽量减少动物移动、潜在的脊柱损伤、肢体脱位以及后肢挣脱尾部固定装置的风险。图4B兔子被固定在束缚器中约5小时，未出现与活动增加或脱水迹象相关的问题。
    1. 对于体型较小的兔子（例如，2个月以下），应在动物身下放置一个橡胶增高垫以抬高兔子，防止其颈部接触头部固定装置的底部图4C).
      注意：呼吸频率和心率的突然下降可能继发于颈部受压。若发生此情况，应松开颈部固定装置并抬起兔子’头部上抬以缓解颈部受压。
    2. 当后部固定装置未能紧密贴合兔子的背部/脊柱时，应放置一个PVC垫片以防止可能造成脊柱损伤的任何移动。
      注意：例如，可使用长约14 cm、内径4英寸的PVC管，将其下部25–33%切除后置于兔体上，并配合泡沫材料以实现适当的固定图4C).
  9. 现在，将兔子安全地放入固定器后，将7-13 mm的皮下直针电极插入头皮图3A）。使用45˚ 进入角度应倾斜，将导线从耳间向上引出，并松散地将导线固定在头部后方的固定装置上，以维持导联位置。放置5个脑电图（EEG）导联，位置如下：右前侧、左前侧、右枕部、左枕部，以及位于其余4个导联之间的中央参考点（Cz）导联。图4D).
    注意：当电极被正确置入颅骨外皮下组织时，即为适当放置。此位置可最大程度减少来自鼻部、耳部及其他周围肌肉的伪迹。节律性鼻部运动产生的部分伪迹不可避免。前部脑电图导联应置于兔耳内侧’眼睛向前看。枕部导联应置于耳前，并朝向内侧方向。Cz 导联放置于头顶正中央，位于全部 4 个电极之间的中点位置（沿缝合线，Lambda 与 Bregma 的中点）。Cz 电极的针脚朝向前方。
    1. 将脑电图导线从兔子双耳之间向上穿过，以避免兔子咬到导线。
  10. 将脉搏血氧仪的脉搏波传感器连接至兔耳的耳缘静脉处。
    注意：可能需要剃除耳部多余的毛发以增强信号，或使用纱布固定传感器。
    1. 确保体积描记法显示的心率与心电图心率一致，并显示血氧饱和度（图 5C).
  11. 轻轻地将带有二氧化碳监测管的面罩覆盖在兔子的口鼻上（图4H用绳子将面罩固定，并将绳子两端系在固定装置上。将二氧化碳监测管的另一端连接至生命体征监护仪。
    注意：实验过程中应防止绳索覆盖兔子的眼睛。为此，可将绳索用胶带固定在兔耳之间束缚器的中部。为了改善微流二氧化碳测定信号，可使用胶带和一片薄的丁腈橡胶材料制作一个单向阀，使氧气能够进入T型管，同时将呼出的CO2导入微流二氧化碳测定管路中图 4I).

3. 视频脑电图-心电图的记录

  1. 使用市售的 EEG 软件进行视频-EEG-ECG 记录。
    注意：生物电位导联和视频需时间同步，以便后续关联电生理信号与视频信号（例如，EEG 尖波与肌阵挛抽动）。
  2. 确认连接状态良好，无基线漂移、无 60 Hz 电噪声干扰，并具有高信噪比。具体而言，确保 ECG 上可清晰观察到心电波形的各个时相，且 EEG 上的 δ、θ 和 α 波未被高频噪声所掩盖。
    1. 若所有电极均产生过多噪声，则调整中央参考电极；若仅单个电极噪声过大，则将该电极稍用力压入皮肤或重新定位，直至无金属暴露部分。
  3. 调整视频画面，确保所有兔子可同时被观察到，以便将运动活动与 EEG 发现结果进行关联（图 5A）。
    注意：该系统可同时对最多 7 只兔子进行 EEG/ECG/血氧测定/二氧化碳测定记录。
  4. 对每只动物至少进行 10–20 分钟的基线记录，或持续至心率稳定于安静放松状态（200–250 bpm），且兔子至少连续 5 分钟无大幅度活动。采集全频带电生理数据，不使用任何滤波器。为更清晰地观察数据，可将低频滤波器（=高通滤波器）设为 1 Hz，高频滤波器（=低通滤波器）设为 59 Hz。
    注意：兔子处于放松状态的另一表现是 EEG 睡眠纺锤波的出现（后文将讨论）。
  5. 在实验过程中实时添加时间同步注释，以标记干预措施（如给药）和神经-心脏事件（如 EEG 尖波、运动性癫痫发作、异位搏动和心律失常）以及运动或操作者引起的伪迹。
    注意：由于操作者需频繁实施干预（如光刺激、给药），为尽量减少进出房间及开关门对动物造成的应激，操作者在整个实验期间应始终位于房间的对侧。操作者应尽可能远离动物，并保持静止和安静，以避免对动物造成干扰。

4. 实验方案

注意：如果在同一动物上进行以下各项实验，则每项实验需在不同日期完成。口服测试化合物药物研究与急性终末致惊厥药物研究之间需间隔两周。必要时，先进行光刺激实验，等待30分钟后，再进行PTZ药物研究。

  1. 为使兔子适应固定装置，并便于研究者客观确认心肺速率的稳定，应对所有兔子进行仪器连接 使用心肺和神经传感器并进行连续视频监测 > 每只动物每次1小时，每天1至3次。 
  2. 光刺激实验
    1. 除了上述方法外，还需在兔子眼睛水平位置前方30 cm处放置一个带有圆形反射器的光源，闪光强度设为最大（16 坎德拉）29光源由一个白点表示 图4E.
      ​注意：应使用光线较暗的房间以诱发光敏感反应37.
    2.  作为兔子’兔子的眼睛位于头部两侧而非像人类一样位于前方，因此需在兔子两侧各放置一面镜子，并在兔子后方放置一面镜子，以使光线进入兔子眼中’s 眼睛。
      注意：使用一个高度 ≥ 20 cm、长度 ≥ 120 cm 的平面镜在兔周围形成三角形围挡，以确保闪光能够进入兔眼’s 眼睛中所见的 图 4E.
    3. 将光源连接至具有可调节频率、强度和持续时间的控制器。
    4. 使用具备红光和红外记录功能的相机进行视频录制。
    5. 让兔子在睁眼状态下暴露于每个频率30秒，然后用外科口罩覆盖其面部以模拟或引起闭眼，再持续暴露于同一频率30秒。
      注意：先前的研究表明，闭眼是诱发光敏感性癫痫发作的最有效刺激方法29此外，10%的光敏感患者仅在闭眼时表现出脑电图异常迹象29临床上可通过观察头部及全身肌阵挛抽动、阵挛或强直状态来识别癫痫发作。脑电图记录需更全面地分析其与运动表现的脑电相关性（如尖波、多尖波和节律性放电），以明确诊断癫痫样放电活动。对于脑电图因肌电伪迹干扰或存在癫痫源性不明确的波形而难以判读的情况，应由癫痫专科医生进行复核确认。
    6.  将光刺激器频率以2 Hz为步长，从1 Hz逐步增加至25 Hz。然后执行相同的光刺激程序，但此次将频率从60 Hz以5 Hz为步长逐步降低至25 Hz。
      注意：如果兔子出现癫痫发作，应立即停止实验。继续监测兔子30分钟，然后将其送回饲养室，并在接下来的3小时内每1小时监测一次，直至完全恢复。然而，如果光刺激诱发了光阵发性反应，则跳过剩余的升频阶段，改为从60 Hz开始降频重复刺激序列，直至再次出现光阵发性反应。这有助于确定光刺激的上限和下限阈值。由于光阵发性反应在光刺激停止后会立即终止，因此无需等待。如果无法确定是否出现了光阵发性反应，可在10秒延迟后重复该频率刺激。38.
    7.  实验结束后，移除兔子的脑电图（EEG）和心电图（ECG）导联，并将其送回饲养笼，由饲养人员进行常规护理。
  3. 口服给药
    1. 由于许多药物通过口服给药，可通过将化合物与食品级苹果泥混合来制备口服制剂。将 0.3 mg/kg 的 E-4031 与 3 mL 苹果泥混合，吸入 3 mL 口服/冲洗注射器（无针头）中。
      注意：可通过此种方式给予多种药物，包括待测化合物、已知可改变QT间期的药物（如莫西沙星或E-4031）以及阴性对照或溶媒对照。部分药物无静脉制剂。此外，许多药物通常以口服剂型处方使用，因此静脉给药的临床相关性可能较低。
    2. 抬起兔子的上唇，将口服注射器的尖端从侧边滑入口腔’兔子未遮挡的口腔’牙齿，并将全部药物和苹果酱注入兔子体内’s的嘴。
    3. 继续进行2小时的视频-EEG-ECG记录，然后将动物放回其饲养笼中进行常规护理。
    4. 在实验第2天和第3天，将兔连接至视频脑电-心电图（video-EEG-ECG）系统，记录10–20分钟基线数据，随后注射相同药物，并持续记录2小时。
    5. 经过1周的洗脱期后，进行10-20分钟的基线记录，随后连续3天每天给予每只兔子单剂量安慰剂，并记录2小时。
      注意：口服药物的给药方案可设计为交叉研究，即第1周给予安慰剂，第2周给予药物。
  4. 静脉注射药物实验（戊四氮，PTZ）
    1. 为了观察耳缘静脉，需剃除兔子耳部背面的毛发’耳部。使用70%乙醇棉片消毒部位并扩张耳缘静脉。该位置由黑色虚线椭圆指示。 图4F.
    2. 此时，由一名实验人员将兔子盖住’用其手轻抚兔的面部，以减轻实验操作给兔带来的应激。第二位实验者小心地用套管针穿刺耳缘静脉  无菌25G套管针
    3. 导管进入静脉后，放置无菌敷料 导管末端的注射塞，以便通过针头静脉注射药物。注射塞的位置在图中用蓝色圆圈标出 图4G.
    4. 用4英寸×4英寸的纱布制作夹板 用胶带固定成管状，并将其放入兔子体内’用胶带将夹板固定在耳朵上，使导管固定在位并保持直立，类似于未插管的耳朵。
    5. 注入1 mL含10 USP单位/mL的肝素化生理盐水。
      注意：导管和血管应明显排尽空气并保持通畅。如果导管未进入血管，注射器将难以推动，且生理盐水会积聚在皮下组织中。
    6. 从1 mg/kg开始，以1 mg/kg为增量，每隔10分钟通过静脉注射给予家兔递增剂量的PTZ，直至剂量达到10 mg/kg。每次给药开始时应记录接受注射的动物编号及药物浓度。
      注意：这可以评估PTZ给药的急性效应和累积效应。或者，为了进一步评估低剂量PTZ的慢性效应，可对兔子在每个低剂量浓度下进行重复给药，依次给予7次2 mg/kg剂量、3次5 mg/kg剂量和3次10 mg/kg剂量，每次给药间隔10分钟。
    7. 每次给药后，应仔细监测视频脑电图-心电图-二氧化碳图-血氧饱和度，以发现任何神经-心脏电活动及呼吸异常，以及癫痫样活动的视觉证据。需在实时监测和后续分析中记录这些变化。
      注意：给予PTZ后，癫痫样活动通常在60秒内开始。

5. 非存活实验的结论。

  1. 如果家兔在戊四氮（PTZ）实验过程中未发生猝死，则按每4.54 kg体重给予1 mL浓度为390 mg/mL的戊巴比妥钠（或对所有家兔统一给予1.5 mL），随后用1 mL生理盐水冲洗。监测心电图，以确认家兔发生心脏停搏。
  2. 一旦家兔出现心脏停搏，应立即进行尸体解剖，新鲜分离各种器官，包括心脏、肺脏、肝脏、脑组织、骨骼肌以及后续分子/生物化学分析所需的其他任何组织。
  3.  根据机构规定处理家兔尸体。

6. 心电图分析

  1. 使用市售的ECG分析软件对ECG进行目视检查，识别心动过速、心动过缓、异位搏动及其他心律失常的时段（图6）。为减少需审查的数据量，可生成心动周期图（tachogram），以便更便捷地识别心动过速、心动过缓或RR间期不规则的时段。 
    注意：ECG异常（例如QTc间期延长）和心律失常需通过人工审查ECG来识别，包括心率异常（例如心动过缓/心动过速性心律失常）、节律异常（例如房性/室性早搏）、传导异常（例如房室传导阻滞）以及波形异常（例如非窦性房性/室性心动过速和颤动）。通过检查心动周期图中RR间期的不规则性可发现心律失常。当心动周期图中某段心率超过每分钟300次时，可识别为心动过速；当心率低于每分钟120次时，则可识别为心动过缓。
  2. 使用市售的ECG分析软件，在基线状态及诱发条件下（例如研究者对动物进行操作、给予试验药物、或诱发癫痫所致的ECG变化）进行标准ECG测量（包括心率、心动周期间期）。

7. 视频脑电图分析

  1. 使用市售软件通过视频和脑电图追踪进行视觉滚动，以识别基线信号（图7）以及存在预期的脑电图放电，例如睡眠纺锤波（图8）和顶点波（图9).
    注意：尽管以全频带宽采集电生理数据时不使用任何滤波器，但数据显示时应设置低频滤波器（即高通滤波器）为 1 Hz，并依据奈奎斯特采样定理进行处理’s 定理，设置高频滤波器（即低通滤波器）为 120 Hz，以避免遗漏任何信号。在回顾较低频率信号时，可根据需要调整滤波器，以实现更好的可视化效果和噪声抑制（例如 1-59 Hz）。<25 Hz）脑电活动
  2. 除了使用二氧化碳波形图外，还可利用脑电图（EEG）上的鼻部运动伪迹来判断呼吸的存在与否。这一点也可与视频记录中观察到的鼻部运动进行对照。
  3. 使用市售软件对视频和脑电图记录进行视觉滚动浏览，以区分每次给予PTZ剂量后至少1分钟内的癫痫样与非癫痫样（如意识存在）运动图10）。扫描发作间期癫痫样放电，以及发作前、发作中和发作后的脑电图变化。临床上可通过观察头部及全身肌阵挛性抽动、阵挛或强直状态，并结合脑电图相关表现来识别癫痫发作。脑电图变化可能包括脑电尖波、多尖波以及节律性放电。
    注意： EEG 被肌电伪迹遮蔽或出现癫痫发生性质不确定的波形时，应由神经科医生进行复核确认。可优先将视频聚焦于一只兔子，以便更仔细地观察其行为及其 EEG 和 ECG 记录，图 5B).
  4. 根据运动表现的类型和严重程度对视频脑电图（video-EEG）进行癫痫发作评分，这些表现通常在注射PTZ后1分钟内出现表1).
  5. 在光刺激实验后，使用市售的脑电图分析软件对脑电图的枕区导联进行频谱分析，以检测是否存在枕区驱动节律。枕区驱动节律会在频谱分析中产生一个与光刺激器频率相对应的峰值。图11).
    注意：光刺激可能在产生基频峰的同时，还产生谐波频率峰。

7. 呼吸功能分析

  1. 查看生命体征监护仪的输出结果（图4I），并导出信号以供进一步分析。
  2. 注意癫痫发作期间及发作后呼吸模式的变化，特别是呼吸暂停开始的时间点。

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结果

上述方法能够检测脑部和心脏的电传导系统异常以及呼吸紊乱。使用数据采集软件评估心电图（ECG）波形，并检测任何异常心率、传导障碍或心电节律（房性/室性异位搏动以及心动过速/过缓性心律失常）（图6）。除了可视化心电图波形外，还对心电图波形进行分析，以量化RR间期、心率、PR间期、P波持续时间、QRS间期、QT间期、校正QT间期（QTc）、JT间期以及Tpeak至Tend间期。数据分析结果表明，心动过速/过缓性心律失常可被轻易检测到。

除了分析心电图（ECG）数据外，还对脑电图（EEG）数据进行了分析。基线脑电图通过频谱分析进行采集和分析（图7）。该数据显示，枕区导联的波幅高于额区导联，且所有导联中的主导频率均处于δ波范围。能够以高信噪比记录兔脑电图，对于检测癫痫样放电以及对记录数据进行进一步分析...

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讨论

该实验装置可实现对兔子进行详细的同时视频-脑电图-心电图-血氧测定-二氧化碳图记录与分析，尤其适用于心脏和/或神经系统疾病模型。本文结果表明，该方法能够检测癫痫发作和心律失常，并将其与脑电伪迹区分开来。当给予兔子致惊厥剂以诱发癫痫发作时，获得了预期的结果。通过视频-脑电图记录获得的数据可进一步分析，以区分自主运动与运动性癫痫发作严重程度的进展，以及脑电图异常，包括光驱动反应、脑病和癫痫样放电。各种类型的癫痫样放电被进一步表征，并与运动活动相关联。心电图分析显示该方法具有高信噪比，能够识别并量化心脏周期中各个电生理相关成分。该方法还可检测多种心脏异常，包括室性早搏、心动过缓、心脏传导阻滞、心动过速、快速性心律失常以及心搏停止。建立一种稳健的方法以深入研究多系统疾病中的神经-心脏相互作用，是一项重要的技术进步，对于更好地理解这些疾病至关重要。此外，对呼吸功能进行长期监测有助于更深入地理解癫痫发作后呼吸衰竭及其在猝死中的作用。

该系统还为药物研究（例如心脏安全性测试）提供了一个可靠的平台。采用这些技术的研究项目能够实时探究神经、 心脏和呼吸表现之间的相互作用。尽管已有大量研究在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢美国心脏协会、美国癫痫学会以及纽约州立大学上州分校药理学系提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠灌洗液，USP - 软质容器辉瑞（赫士睿）7983-09稀释剂
10毫升鲁尔锁型注射器配20G×1" 针Sur-VetSS-10L2025药物注射后的冲洗使用
4×4 纱布敷料Fisher Scientific22-415-469用套管针固定耳部并卷入试管中进行夹板固定
苹果酱柯克兰897971口服药物载体
计算机DellOptiplex 5040采集计算机
E-4031Tocris1808已知可延长QT间期的药物
心电图电极RhythmLinkRLSND116-2.513毫米35度弯曲（0.4毫米直径）皮下针电极
脑电图电极RhythmLinkRLSP5135圈扭转 13毫米直型（0.4毫米直径）皮下针电极
EEGLAB (2020)斯瓦茨计算神经科学中心开放获取可进行脑电图的频谱分析
以太网转以太网适配器LinksysUSB3G16连接相机与计算机的适配器
安乐死-III 溶液Med-PharmexANADA 200-280包含戊巴比妥钠和苯妥英钠，管制药品
泡沫垫通用型N/A减少固定装置对小型兔子颈部施加的压力，以防止颈部受压引发的心肺不良反应
肝素封管冲洗液MedlineEMZ50051240保持血管导管通畅
红外光博世EX12LED-3BD-8W便于在暗处进行记录
LabChart Pro（2019，版本 8.1.16）ADInstrumentsN/A心电图分析
JELCO PROTECTIV 安全型静脉留置针，25 号规格Smiths Medical3060用于导管插入耳缘静脉
MATLAB（R2019b，Update 5）MathWorksN/A运行 EEGLAB 所需条件
麦克风索尼立体声ECM-D570P记录癫痫发作的可听表现
白色纸质微孔医用胶带3M1530-1用于固定导线并制作耳夹板
Natus NeuroWorksNatusLC101-8数据采集与分析软件
戊四氮（1 - 10 mg/kg，始终溶于1 mL体积中）Sigma-Aldrich88580在生理盐水中配制的稀释液
光刺激器草PS22用于控制光脉冲频率、延迟、持续时间及强度的刺激器
塑料线缆整理器/捆扎器12Vwire.comLM-12-100-BLK捆绑电线以减少噪声
PS 22 光刺激器Grass InstrumentsBZA641035可调节闪光频率、延迟和强度的频闪灯
PVC管通用N/A防止小型兔子因后肢蹬踢而导致脊柱损伤
量子放大器Natus13926放大器/数字化仪
Quantum HeadBox 放大器Natus2213464针引出盒
兔用固定器Plas-Labs501-TC可提供多种尺寸的兔用固定器。6" ×18" × 6" 在本研究中。
橡胶垫（增压垫）通用N/A将小兔子在固定器中轻轻抬起，以防止颈部受压
SpO2 耳夹NONIN61000纯化SAT/SpO2
SpO2传感器适配器NONIN13931XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p HDMI与IP云台摄像机 & 3G-SDI 输出索尼SRG-X120Impela 摄像头
Terumo Sur-Vet 结核菌素注射器 1cc 25G × 5/8" 标准鲁尔Sur-Vet13882用于注射静脉药物
兽医注射塞 Luer 锁Sur-VetSRIP2V用于静脉给药时插入针头的注射塞
Webcol 酒精消毒棉片，无菌，大号，双层Covidien5110在导管插入前准备耳缘静脉

参考文献

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