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行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

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DOI：

10.3791/62266

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2021年7月24日

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, 3Institute of Basic Medical Sciences, Westlake Institute for Advanced Study, 4School of Basic Medical Sciences, Xi'an JiaoTong University, 5Office of Public Affairs, Westlake University, 6School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University

本文内容

摘要

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。

摘要

在清醒且行为自由的动物中以单细胞分辨率成像神经元活动，是系统神经科学中研究神经环路功能的一种极为强大的方法。然而，哺乳动物组织对光的高吸收和散射特性使得活体成像主要局限于大脑表层区域，而海马体等深层脑区则难以通过光学显微镜进行观测。在本视频中，我们展示了定制化成像窗口的制备与植入方法，以实现对固定头部并处于行为状态的小鼠背侧海马CA1区进行长期的in vivo成像。该定制窗口配备有灌注导管，可将病毒载体和药物靶向递送至成像区域。结合该装置与宽场成像技术，我们对行为小鼠中大量神经元群体的活动进行了持续数周的长期记录，使用的是荧光钙指示剂。我们还展示了该装置在单峰放电分辨率的电压成像中的适用性。高性能的遗传编码神经元活动指示剂与科学级CMOS相机使得能够在高时间分辨率下反复观察单个神经元的亚细胞形态细节。我们还讨论了该方法的优势与潜在局限性，以及其与其他成像技术的兼容性。

引言

海马体是负责学习和记忆1以及空间导航2的关键脑区。海马体萎缩与涉及记忆丧失和认知功能下降的神经及精神疾病相关3,4,5。在小鼠中，海马体是研究细胞和网络水平上空间记忆、情境记忆及关联性学习与记忆形成的经典模型4,5。对学习与记忆机制的研究需要在行为动物中对神经元结构与功能进行长期的观测。结合基因编码探针的荧光成像技术6，能够在活体条件下对大量神经元的膜电位动态7,8、钙瞬变9以及结构变化10进行前所未有的记录。然而，小鼠海马体的光学通路被皮层所遮挡，而皮层厚度可超过1 mm。本文介绍了一种定制化成像装置的组装方法及其在小鼠头部的慢性植入技术，以实现对行为小鼠背侧海马体CA1亚区的长期光学通路。成像植入体中集成的灌注套管可将病毒或药物直接递送至视野内的神经元。该制备方法结合宽场显微镜，可实现对行为小鼠中大量神经元的长期反复成像。我们利用该方法通过靶向注射重组腺相关病毒（rAAV）在海马体CA1区表达基因编码的钙和电压指示剂，实现了单细胞分辨率的神经元活动记录。同时，我们在行为动物中对相应神经元亚群进行了高时空分辨率的纵向钙成像。此外，该制备方法兼容多光子显微镜和微型内窥镜技术，进一步拓展了在行为小鼠中于细胞和亚细胞水平研究神经网络的成像工具箱。我们详细描述了该方案的关键步骤及故障排除方法，并讨论了该技术可能存在的陷阱与局限性。

方案

本文所述所有方法均已获得西湖大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 植入物组装

注意：成像植入物的组装在技术上较为简单，仅需使用市售物品（图1，另见 材料表）。头部固定板可在当地的机械加工车间使用不锈钢或钛板制造。我们建议在开始手术前预先准备一批完全组装好的植入装置。此后 体内 实验完成后，植入物可回收并多次重复使用。在某些情况下，可能仅需通过焊接重新连接灌注套管或更换盖玻片即可。

  1. 准备组装和安装成像植入物所需的全部六个关键硬件组件（图1）。

色谱组件：用于实验装置搭建的带标签示意图，展示接头、连接件和隔垫。
图1：用于成像植入物组装与安装的六个关键硬件组件。（A）假性套管。（B）导向套管。（C）成像套管。（D）玻璃盖玻片。（E）头固定板。（F）内套管。比例尺：5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 打开焊接机并加热至所需温度。
    注意：温度取决于所使用的焊锡类型。
  2. 使用细砂纸打磨成像套管的侧面，以去除氧化层，从而增强焊接强度。
  3. 使用辅助夹具调整成像套管和注射套管（插入假芯的引导套管）的位置（图 2A、B）。
  4. 使用带针头的注射器，将少量适当类型的助焊剂涂抹在成像套管与注射套管的连接处，持续 5 秒，然后移除液滴。
    注意：本实验中使用的助焊剂为市售产品，制造商明确说明适用于焊接不锈钢部件，因为成像套管和输注套管均由不锈钢制成。若套管由其他材料制成，使用者应选择适用于该材料的助焊剂。
  5. 熔化焊锡，并将其涂覆于已涂助焊剂的连接部位（图 2）。
    注意：避免使用过多焊锡，否则在手术过程中将需要更大的颅骨开窗面积。

显微注射装置示意图：注射套管、成像套管、角度标注、技术优化。
图 2：注射套管的组装示意图，由插入了假性套管的引导套管与成像套管构成。（A）注射套管与成像套管之间的夹角应约为 45 度。（B）注射套管的尖端应恰好位于成像套管的边缘。（C）用于焊接成像套管和注射套管的焊锡适当大小（红线表示锡滴的轮廓）。（D）在植入体制备过程中应避免使用的焊锡尺寸（红线表示锡滴的轮廓）。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 等待焊锡冷却。通常需要数秒钟。
  2. 通过从两个方向插入假性套管，确认注射套管未被堵塞。
  3. 使用牙签或26 G注射器针头将紫外固化光学胶涂在成像套管的底面。
  4. 使用精细镊子小心地将与成像套管尺寸匹配的盖玻片放置到位。
    注意：必须精确地将盖玻片放置在成像套管上，一旦盖玻片接触光学胶后应尽量避免移动。否则会导致玻璃污染，从而降低成像质量。
  5. 使用标准手持式紫外灯（波长350–400 nm）照射至少一小时，以固化胶水。
    注意：所用胶水必须具有光学透明性，否则会降低成像窗口的质量。
    警告：佩戴防紫外线眼镜、手套和实验服，避免皮肤和眼睛暴露于紫外光下。
  6. 用70%乙醇清洗套管，晾干后存放于无菌容器中，直至手术使用。
    ​注意：必须尽可能保持盖玻片清洁且完好无损。所用光学胶在70%乙醇中具有化学稳定性。

2. 窗口植入

  1. 手术前的准备步骤
    1. 将所有手术器械在高压灭菌器中进行灭菌。
    2. 在两个独立的培养皿中分别准备好1×PBS和70%乙醇。
    3. 可选：在开始手术操作前，使用紫外灯对手术区域消毒至少20分钟。
      ​注：在尽可能无菌的条件下操作，可成功制备长期稳定的（最长可达6个月）玻璃覆盖颅窗。污染通常会导致颅窗透明度下降或严重炎症。
  2. 手术操作
    1. 手术开始前，立即用70%乙醇对手术区域进行消毒。
    2. 称量动物体重，并根据IACUC批准的动物实验方案，皮下注射术前镇痛剂。
    3. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉（诱导浓度4%，维持浓度1.5–2%，气流速率为0.3–0.5 L/min）。采用尾夹和脚趾夹法确认动物已完全镇静。在整个手术过程中监测动物的生命体征，如呼吸频率、SpO2和心率。
    4. 使用剃毛器或脱毛膏去除从颈部后方至眼睛区域的毛发。
    5. 将小鼠固定于立体定位仪上，并置于手术加热垫上（维持37 °C）。使用耳杆固定头部。轻轻推动头部各个方向，确保头部牢固固定。
    6. 涂抹眼膏，防止动物在手术期间眼睛干涩。
    7. 在切口前，使用聚维酮碘对术区消毒，随后用70%乙醇重复三次。
    8. 去除颅骨顶部的皮肤，首先沿头部基底做一条水平切口，然后向头侧方向做两条切口，几乎到达眼睑，再做两条斜向切口，在中线处汇合。
    9. 使用两根无菌棉签将连接组织及颈部后方的肌肉组织向颅骨边缘牵拉。
      注：操作过程中应尽量避免损伤血管（尤其是隐藏在肌肉中的血管）。
    10. 在骨膜表面滴加一滴利多卡因溶液（约0.1 mL），作用2分钟，以避免过度疼痛。可选：为减少去骨后脑组织肿胀，可皮下注射0.1 mL的1%地塞米松。
    11. 用手术刀轻轻刮擦整个暴露的颅骨区域，形成干燥粗糙的表面，以增强胶水和牙科水泥的粘附性，从而实现长期植入。
    12. 将安装在立体定位仪上的针尖置于前囟位置，将三个坐标（AP：前后方向；ML：内外侧方向；DV：背腹方向）均设为0。
    13. 将针尖移至后囟位置，检查AP坐标是否为0，以确认头部位置垂直，同时检查ML坐标是否为0，以确认头部水平。若不符合，调节立体定位仪上的相应旋钮，直至AP和ML坐标均在0.1 mm以内。
    14. 移动针尖以确定开颅位置的对应点，并使用细头记号笔在颅骨上标记其位置。以海马植入为例，有四个点的坐标分别为（AP: -0.68, ML: -2.0）、（AP: -3.68, ML: -2.0）、（AP: -2.18, ML: -0.5）和（AP: -2.18, ML: -3.5）11，此外，注射套管最尾侧点的坐标为（AP: -4.0, ML: -2.0）。
      ​注：本步骤所用记号笔必须在术前经紫外照射灭菌至少一小时。此处所示坐标适用于6–8周龄的C57BL/6J小鼠。不同年龄或品系的小鼠坐标可能有所不同。
    15. 根据四个标记点绘制一个圆形，并在该圆尾侧标出注射套管区域的轮廓（图3）。
  1. 使用气动钻以10,000 rpm的速度轻柔地沿颅骨上标记的轮廓“描画”。
  2. 钻削颅骨直至仅剩一层极薄的骨片，通常在中心区域轻微触碰时即可观察到轻微晃动。
  3. 在颅骨开窗部位中央滴加一滴无菌1x PBS，用极细尖镊子或两根26 G针头从相对两侧轻轻挑起骨瓣。
    注意：PBS有助于移除颅骨碎片，并防止硬脑膜可能出血12。
  4. 滴加PBS后，使用26 G钝头针反复进行轻柔抽吸，以清洁硬脑膜表面。
  5. 通过抽吸或眼科剪轻柔去除硬脑膜。施加轻柔吸力（约-60 kPa）以消融海马上方的皮层及胼胝体。
    注意：皮层通常比胼胝体颜色更黄，而胼胝体通常比海马更白。从上方观察时，胼胝体通常因其神经纤维呈垂直与水平方向走行而易于区分（图3）。

手术伤口愈合过程、组织学显微照片、血管化模式、组织再生。
图3：海马体定位的立体定位坐标及脑组织消融过程。（A）颅骨开窗区域四边的定位坐标。（B）完整的颅骨开窗区域。（C-E）手术过程中获取的代表性图像（左图）及其示意图（右图），显示在皮层消融过程中可见的（A）皮层、（B）胼胝体和（C）海马体神经纤维的不同颜色与走向。比例尺：1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 此时出血会影响开颅术中脑组织的可见度。吸取皮层时，先施加1×PBS，然后轻柔吸引，以清除血液。
    注意：此步骤中持续出血是不可避免的，在一定程度上，持续出血是正常血压的表现。与皮层成像窗植入不同，光学窗下存在血液是可以接受的，因为术后数天内血液将被清除。在皮层消融后应尽快将成像套管插入所形成的空腔中。
  2. 如果开颅范围较大 <比成像套管小0.5 mm时，可在使用SuperBond固定植入物之前，通过额外使用Kwik Sil密封材料在一定程度上补救套管的安装。
  3. 如果开颅范围较小，则 <由于钻孔导致颅骨开窗边缘残留的骨质比颅骨本身更薄，因此当植入套管的直径比颅骨开窗直径大0.5 mm时，可使用精细镊子或眼科剪修整颅骨开窗边缘，在一定程度上补救手术操作。
    注意：超出上述0.5 mm范围的开颅手术无法补救，此类情况应根据动物实验方案执行终止程序。
  1. 轻轻地将植入物插入颅骨切开处。
  2. 用L形针用力按压植入物顶部，使植入物的光学窗口尽可能靠近海马暴露的表面。在植入过程中，反复在植入物周围的颅骨上滴加PBS，并配合抽吸，尽可能清除血液。然后在植入物与颅骨之间涂抹一层薄薄的Kwik Sil，以防止牙科水泥渗入颅骨下方。图4).
    1. 确保植入物的光学窗口紧贴海马体，以避免血液或其他液体在下方积聚。
      注意：关键在于确保成像套管的盖玻片紧贴海马体，在安装和封固过程中可能需要对套管顶部施加轻微压力。只要光学窗口紧贴海马体，成像套管上表面是否与颅骨平行对于最终的光学通路并不重要。
    2. 根据CA1区域上方皮层的平均厚度，使成像套管的上表面高出颅骨表面约0.5 mm，以利于将套管固定于颅骨图4).
  3. Kwik Sil固化后（通常不超过约1分钟），涂抹Super-Bond C&将B均匀地涂布于颅骨表面、Kwik-Sil表面以及植入物的上表面。
  4. 一旦使用 Super-Bond C&B 被固化后，在 Super-Bond C 上方涂抹义齿基托树脂&B，以及手术开始时切口周围的皮肤。
    注意：不同类型的骨水泥可从多家供应商处获得。请遵循相应生产商的使用说明。
  5. 义齿基托树脂固化后，将头部基板置于种植体周围的树脂上，并使其与成像套管同心。在头部基板周围及上方添加更多义齿基托树脂以固定其位置，静置数分钟使其完全固化。
    1. 避免在套管周围堆积过厚的水泥层，以确保物镜能更好地接触成像窗口图4).

立体定位脑成像装置示意图：(A, B) 为示意图，(C) 为活体实验。
图 4：颅窗植入的示意图，(A) 为冠状面，(B) 为矢状面。(a) 头部固定板；(b) 义齿基托树脂；(c) Superbond；(d) Kwik-Sil；(e) 成像套管；(f) 注射套管；(g) 焊锡。(C)：术后安装植入物的小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 稀释义齿基托树脂以降低其黏度，从而使其能够填充难以用涂布器到达的区域。
  1. 在窗口上方轻轻放置一层绝缘橡胶胶带，以防止动物垫料可能造成的污染。
  2. 手术完成后，皮下注射抗炎药物，以预防炎症反应。
  3. 将动物置于温暖的笼子中，直至其从麻醉中恢复。
  4. 术后72小时内通过观察小鼠的一般行为来检查其健康状况。术后每24小时皮下注射抗炎药物和镇痛剂，持续两至三天，以缓解疼痛并减轻炎症反应。
    注意：术后护理中的监测程序、药物及剂量可有其他选择，具体操作请参考IUCAC批准的动物实验方案。
  5. 术后5至7天检查窗口，观察窗口下血管系统。若窗口清晰透明，动物即可进行病毒注射。

3. 病毒注射

注意：病毒注射通常在手术后5-7天进行。在病毒注射前，必须确认成像窗口清晰，能够观察到脑血管结构（图5）。在某些情况下，窗口完全清晰可能需要14-16天，只要未检测到脑部炎症，这种情况也是可接受的。

显微视图，A-B截面；组织分析，用箭头标示结构差异。
图5：光学窗口在病毒注射并添加FastGreen染料前（A）和后（B）的代表性图像。箭头指示相同的血管结构。比例尺：1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在PCR管中，按1:9的比例将快绿染料储备液加入已稀释至所需滴度的病毒溶液中。
    注意：添加快绿染料有助于在注射过程中观察病毒溶液的位置。
  2. 将聚乙烯管连接至注射器，然后使用注射泵用矿物油反向填充管路。
  3. 将内插管连接至管路的另一端，反复推注和回抽矿物油数次，以确保内插管无堵塞。
  4. 使用异氟烷对动物进行麻醉（诱导浓度4%，维持浓度1.5–2%，气流速度0.3–0.5 L/min），将其头部固定于立体定位仪上，并置于加热垫上（维持体温37 °C），涂抹眼膏防止角膜干燥。
  5. 抽取600 nL病毒溶液，移除假插管，将连接注射器的内插管插入导管中，以50 nL/min的速度持续注射10分钟，完成病毒注射。
    注意：使用体视显微镜通过观察窗检查染料是否可见，以确认病毒注射成功（图5）。
  6. 注射完成后，保持内插管连接状态10分钟，使病毒在观察窗下充分扩散。
  7. 轻柔地将内插管从导管中取出，并用假插管封堵。
  8. 将动物置于温暖的饲养笼中，直至其从麻醉中恢复。
    ​注意：通常情况下，小鼠在病毒注射后10–20天即可进行成像。表达水平和表达时间取决于所使用的病毒血清型及驱动基因表达的启动子。

4. 在宽场显微镜下对清醒小鼠进行成像。

注意：制备的头板可为成像植入物提供极佳的稳定性，从而在清醒且行为自如的小鼠中进行纵向成像时，显著减少运动伪影。

  1. 用 4% 异氟烷诱导小鼠数分钟，将其头板固定在头夹上，然后将头夹固定于跑步机上。
    注意：头夹和跑步机是为本研究中使用的头板定制的，相关 CAD 文件请参见支持材料。在头部固定前对小鼠进行诱导为可选步骤，因为也可通过习惯化训练使动物适应该操作。
  2. 将跑步机移至显微镜载物台下方，并将光学窗口置于物镜下方。
  3. 使用低倍物镜寻找最适合功能成像的视野（FOV），然后切换至高数值孔径（NA）物镜，以单细胞分辨率记录神经元活动。
    注意：若注射导管仍妨碍物镜达到工作距离，可使用金属剪刀将注射导管从头板上剪除。

结果

利用基因编码的钙指示剂进行神经元活动的活体成像平均而言， 体内 成像通常在植入后3-4周开始，前提是转基因表达水平已足够。此时，脑水肿和出血通常已完全消退，脑血管可通过光学窗口清晰观察。本研究利用上述制备方法，在自由活动的小鼠中，通过荧光宽场显微镜对背侧海马CA1区的神经元活动进行重复记录。为记录神经元活动，我们采用了一种高亮度的遗传编码钙离子指示剂NCaMP7。13，其钙离子敏感性和时间分辨率与GCaMP6s相似14为了在海马体中表达NCaMP7指示剂，我们使用输注套管注射了rAAV/DJ-CAG-NCaMP7病毒，并在注射后14天开始进行纵向成像。为记录神经元活动，我们采用10倍、数值孔径（NA）0.3的空气物镜和滨松OrcaFusion sCMOS相机，可在约1.5×1.5 mm视场下以最高100 Hz的频率进行成像。绿色荧光由商用470 nm LED光源激发，配合标准GFP滤光片组使用。绿色通道的平均成像深度约为50–120 µm，可主要记录齿状回门区（stratum oriens）和锥体细胞层（stratum pyramidale）的神经元活动。近红外通道的成像深度可达 200 µm 到达海马体的深层区域8每个视野的平均记录时间为6-12分钟，尽管由于NCaMP7具有极高的光稳定性，且未观察到可检测的光毒性，因此可进行更长时间的成像。图6).

神经元活动分析；荧光显微镜，信号追踪，电生理数据。
图6：使用绿色荧光遗传编码钙离子指示剂记录海马神经元中的神经元活动。（A）在宽场荧光显微镜下通过绿色通道成像的选定视野。（B）对应于A图中单个神经元的15个感兴趣区域（ROI），通过整个记录过程的标准差投影进行选取。（C）B图中选定的15个神经元的代表性单次荧光信号轨迹。（D）C图中对应彩色框内两条钙信号轨迹的代表性放大视图。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

为了获得荧光信号轨迹，通过手动分割对应于神经元胞体的感兴趣区域（ROIs），并使用 ImageJ 软件进行分析。在图像分析之前，无需对清醒动物进行常见的录后运动校正处理，因为所获取的数据集未出现运动伪影，这得益于成像植入物的高度稳定性。图6展示了来自一只清醒且行为活跃的小鼠海马区神经元活动的代表性单次试验光学记录。从图6B所示的同一视野（FOV）中手动选取了15个对应于神经元胞体的ROIs，每个ROI内的单次试验荧光信号轨迹如图6C所示。图6D展示了来自两个不同ROI的荧光信号轨迹的两个代表性片段。我们对同一视野（FOV）进行了4次连续的成像，每次间隔3天。在某些视野中，能够识别并成像相同的神经元至少持续两周（本研究未进行更长时间的成像，但此前已有研究利用相同的制备方法实现了长达6个月的小鼠成像7；图7）。在本研究中，我们使用了AAV/DJ-CAG载体，该载体在病毒递送后21天仍能驱动目的基因的强表达（补充图1）。由于荧光背景增强以及表达钙指示剂的新神经元出现，持续表达使得长期识别相同神经元变得复杂。因此，若实验设计中需要对同一群神经元进行纵向成像，则选择适当的AAV血清型和启动子以驱动目的基因表达应是重要的考虑因素之一。成像质量足以分辨邻近的树突，同时可清晰观察到血管结构。

细胞生长显微镜图像、荧光图像、延时成像，第25-34天，FOV1-4追踪。
图7：海马区四个不同视野（FOV）在12天内的成像序列。 动物于第0天植入窗片，并于第7天注射rAAV/DJ-CAG-NCaMP7病毒。箭头指示在视野内追踪的神经元。比例尺：80 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

使用基因编码电压传感器对神经元活动进行活体成像
在本研究中，我们还使用了一种新型的基因编码电压传感器，名为 SomArchon7，可在活动中的动物体内实现单细胞单峰电位成像7,8为了表达SomArchon，我们使用输注套管注射rAAV/DJ-CAG-SomArchon病毒，并在注射数天后对固定头部的行为小鼠进行电压成像。为记录神经元活动，我们采用40倍NA 0.8物镜和滨松OrcaFusion sCMOS相机，使我们能够以150×40的视野进行成像 µm 在高达830 Hz的采样速率下进行视场成像。绿色荧光蛋白（GFP）是SomArchon构建体的一部分，用于在可见光谱范围内便于观察其表达，可通过绿色通道（470/20 nm LED激发，525/50 nm发射）轻松成像，以定位用于电压成像的目标细胞。光学电压记录在近红外通道中进行（637 nm激光激发，功率密度为3.4 W/mm²）。2，发射波长665 nm长通滤光）下，以4 × 4像素合并，采样速率为830 Hz。我们在清醒小鼠中记录了海马神经元的自发性活动，每个动作电位的平均信噪比为7。图8).

显微图像与信号图；神经活动分析；时间分辨信号处理。
图 8：使用近红外荧光基因编码电压指示剂 SomArchon 记录海马神经元中的神经元活动。（A）在宽场荧光显微镜下，近红外通道成像的选定视野。（B）A 中神经元的单次试验荧光轨迹。（C）B 中对应方框内电压轨迹的代表性放大视图。比例尺：25 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学
在完成功能成像研究后，通过死后分析来确认植入物的正确位置、病毒表达区域以及目标蛋白在成像神经元中的定位。为了对病毒表达和植入物位置进行组织学验证，使用荧光宽场显微镜观察经PFA固定的脑组织冠状切片（图9A，C）。采用共聚焦显微镜获取表达钙指示剂以及电压指示剂的单个神经元的高分辨率图像（图9B，D）。使用DAPI染色以显示脑切片的整体形态。此外，还可通过免疫组织化学方法评估因窗口植入和病毒表达所引起的星形胶质细胞增生或胶质增生。我们之前的研究表明，该操作未引起明显的胶质增生7。

脑组织荧光成像、光学窗口应用、细胞细节、显微分析。
图9：光学窗口位置及病毒表达的组织学验证。（A）表达NCaMP的小鼠冠状脑切片的代表性荧光图像，显示光学窗口的位置。比例尺：1 mm。（B）表达NCaMP7指示剂的神经元的代表性共聚焦图像。比例尺：25 µm。（C）表达SomArchon的小鼠冠状脑切片的代表性荧光图像，显示光学窗口的位置。比例尺：1 mm。（D）表达SomArchon指示剂的神经元的代表性共聚焦图像。比例尺：25 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充 图1：相对荧光强度随表达时间的定量分析。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种对行为小鼠海马CA1区进行长期成像的方法。该方法基于植入一种定制的成像窗口，该窗口还可实现将病毒或药物直接递送至目标神经元。本实验方案主要包括四个部分：i）成像植入装置的组装；ii）成像植入装置的安装；iii）通过成像植入装置注射病毒；iv）在行为小鼠中进行功能成像。下文将详细描述并讨论该方案中的关键步骤、常见问题的解决方法、可能的改进以及该方法的局限性。同时，我们还探讨了该方法的意义及其潜在的其他应用。

在所述方案中，有几个关键步骤对于手术成功至关重要：（i）制备高质量的成像植入物；（ii）保持无菌手术环境；（iii）皮层组织的抽吸；（iv）成像植入物的精确定位；（v）病毒注射。如步骤1.6所述，过多的焊锡将需要更大的颅骨开窗，从而增加炎症风险。在将盖玻片固定到成像套管时，使用适量的光学粘合胶也极为重要（如步骤1.11所示），因为胶量不足可能导致脑脊液渗入成像套管，使其变得不透明；而光学粘合剂过量则会降低玻璃窗口的透明度。成像植入物可能的污染可导致光学窗口下结缔组织的活跃增生和/或严重炎症，进而导致实验提前终止。因此，术前成像植入物的组装与准备几乎与手术操作本身同等重要。

手术过程中，通过轻柔抽吸去除颅骨开窗下方的部分皮层，这不可避免地会导致出血。手术部位的血液会显著降低需要切除的脑组织的可见度，从而增加了精确判断组织切除深度的难度。每次抽吸切除下一部分组织前，用PBS仔细冲洗手术区域，有助于更好地控制切除深度。脑组织应始终分步、小量地逐步切除，并在继续抽吸前确认已切除组织的深度。使用更细的钝头针头也可实现对抽吸力度的更精细控制。我们建议使用26 G针头，但直径小于26 G的针头更容易堵塞。此外，通常需要大量实践才能确定每只动物所需的确切抽吸深度，因为小鼠之间的皮层、胼胝体和海马的颜色可能存在差异（图3）。

成像植入物的插入和固定必须非常精确，以确保成像窗口尽可能靠近海马背侧表面。制备的颅骨开窗大小应与植入物紧密匹配，使其能够顺利插入而无明显阻力。同时，颅骨与植入物之间不应有可见间隙，以确保良好密封，避免脑组织暴露。在将植入物固定到颅骨时，应对其顶部施加轻柔而稳定的压力。在植入过程中，成像窗口下出现血液几乎难以避免。如果手术操作得当，窗口将在3至7天内逐渐变得清晰，脑血管结构也将清晰可见。还需确保病毒被准确注射到窗口下方。若表达失败，可多次重复注射病毒。

我们在某些情况下遇到的主要问题是成像窗口的可视性降低。成像质量差可能有以下几个原因：i）持续存在的炎症反应；ii）玻璃表面结缔组织过度生长；iii）窗口与海马体之间存在较大间隙。炎症通常由手术过程中的污染或成像植入物未充分灭菌引起。我们建议在每次手术前后对所有手术器械进行高压灭菌，在手术开始前对术区进行消毒，并在手术过程中穿戴洁净的个人防护装备。成像植入物在组装后应进行清洁、灭菌，并保存在无菌环境中。成像植入物玻璃表面的结缔组织增生可能是由于玻璃表面存在机械性污染，或在皮层切除过程中对脑组织造成过度损伤所致。在组装植入物后，必须确认玻璃表面清洁且光滑。此外，在将成像植入物置入颅骨开窗部位之前，应仔细清除所有受损的脑组织碎片。在某些情况下，玻璃窗口与海马体之间的间隙会导致脑脊液积聚，从而降低成像质量。因此，在植入过程中，必须将植入物完全插入，以确保海马体与玻璃窗口之间实现良好接触。有时，难以明确成像窗口浑浊的具体原因。我们建议进行死后分析，以查明光学窗口下方的实际状况，并据此调整后续手术操作。

该方法存在若干基本和技术上的局限性，在进行体内成像之前和过程中均需予以考虑。其中一个主要局限是皮层切除。手术过程中会移除部分视觉和感觉皮层。尽管难以精确评估皮层切除的影响，因为被移除的脑组织并不直接投射至海马体，但已有多个研究表明，海马体依赖的学习能力或其他相关海马功能并未出现明显损害15,16。还应考虑光学方面的局限性，尤其是在使用高数值孔径（NA）物镜时。例如，在本研究中，我们使用了一根长度为1.75 mm、内径为1.9 mm的套管。该套管的几何结构无法完全保持数值孔径大于约0.5的干物镜或大于约0.6的水浸物镜的全NA，因为它会遮挡部分光线。另一个所有脑成像植入装置共有的局限是，部分脑组织会暴露在外，从而导致热量散失17,18。然而，在成像过程中通过灌注温热缓冲液即可轻松恢复脑组织的生理温度。

所述方法可轻松修改或调整以适用于其他应用。例如，该制备方法可适配用于纹状体成像7。由于纹状体位置略深于海马体，因此在组装成像植入物时应使用更长的成像套管。我们建议使用2.0 mm的成像套管。颅骨开窗的坐标也应相应调整（前后方向：+0.8 mm，内侧-外侧方向：−1.8 mm）。此外，通过灌注套管注射病毒，结合扩散范围受限的AAV血清型，可实现转基因在神经元薄层中的表达19,20。这种方法尤其有利于单光子成像，因为它减少了来自深层组织的离焦荧光，从而提高单细胞分辨率成像效果。此外，灌注套管在功能成像过程中还可用于向视场（FOV）内的神经元直接施加药物或其他化学物质（图5B）。总体而言，灌注套管为成像植入物增加了实用功能，通过靶向性的病毒表达提高了成像质量，并实现了对视场内神经元的药理学刺激。所使用的头固定板可为成像植入物提供极佳的稳定性，即使在跑轮上主动移动的动物中也能最大限度地减少运动伪影。该头固定板体积小、重量轻，对动物造成的不适最小，并且在植入后可保持数月稳定。该成像植入物还兼容多光子成像15,16,21，并可与微内窥镜联用22,23。类似的成像植入物也曾用于对更深部海马结构（包括辐射层、 lacunosum 层和齿状回）进行多光子成像16,24,25,26,27。然而，通过灌注套管利用AAV靶向这些更深部的海马结构可能需要进一步优化AAV血清型和注射体积19。

我们认为，所描述的实验方案将有助于利用简单且经济的一光子成像系统，在自由活动的小鼠海马体中以高时空分辨率研究神经元活动。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢西湖大学分子生物工程团队所有成员提供的帮助和有益的讨论。同时感谢西湖大学的 Jinze Li 和 Jie-Min Jia 在手术过程拍摄方面提供的协助。

本工作获得了西湖大学启动资金、2020年BBRF青年研究者奖以及国家自然科学基金项目32050410298的资助，以上项目均由K.D.P.获得。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盖玻片Deckglä血清72296-03
义齿 基础树脂上海新星中心 dental 材料N/AI型，自固化
假导管RWD生命科学有限公司62102OD 0.30 mm
引导套管RWD生命科学有限公司6200326G
叉头N/AN/A定制
头板N/AN/A定制
成像套管N/AN/A定制规格；外径 3 mm，内径 2.7 mm，高度 1.8 mm，#108 不锈钢
内插管RWD生命科学有限公司62203 0.30*0.14（外径*内径，mm）
Kwik Sil世界精密仪器公司KWIK-SIL
SuperBond C&& BSUN MEDICALN/ASuperBond C&B试剂盒
跑步机套件N/AN/A定制
紫外光固化胶黏剂NORLAND 产品NOA 60

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行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作
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