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方法文章

用于药物发现的人类视网膜类器官毒性筛选

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DOI：

10.3791/62269

⸱

2021年3月4日

 ,  ,  , 
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

本文内容

摘要

本文介绍了一种逐步生成成熟人类视网膜类器官的实验方案，并将其应用于光感受器毒性检测，以筛选针对年龄相关性视网膜变性疾病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）的潜在药物候选分子。

摘要

类器官为研究疾病机制和治疗方法提供了一个极具前景的平台，能够在人类组织的背景下直接开展研究，同时兼具细胞培养的灵活性和高通量优势。成熟的类人视网膜类器官被用于筛选针对年龄相关性视网膜变性疾病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）的潜在药物治疗方法。

我们最近发现，MacTel 可能由一类非典型脂质——脱氧鞘脂（deoxysphingolipids, deoxySLs）水平升高引起。这类脂质对视网膜具有毒性，可能导致 MacTel 患者出现感光细胞丢失。为了筛选能够防止脱氧鞘脂对感光细胞产生毒性的药物，我们利用非 MacTel 来源的诱导多能干细胞（iPSC）系生成了人类视网膜类器官，并将其培养至有丝分裂后阶段，使其发育出视网膜中所有神经谱系来源的细胞，包括功能成熟的感光细胞。随后，将视网膜类器官暴露于一种脱氧鞘脂代谢物中，并通过免疫组织化学方法检测感光细胞层的细胞凋亡情况。利用该毒性模型，我们筛选了可防止脱氧鞘脂诱导的感光细胞死亡的药理化合物。通过靶向候选策略，我们发现非诺贝特（fenofibrate）——一种常用于治疗高胆固醇和高甘油三酯的药物——也可防止脱氧鞘脂在视网膜细胞中引起的毒性作用。

毒性筛选成功鉴定出一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准、可预防感光细胞死亡的药物。由于所采用的疾病模型具有高度相关性，该发现可直接用于后续研究。该平台可轻松改造，用于测试多种代谢应激因素及潜在的药理学干预手段，从而推动未来视网膜疾病治疗方案的发现。

引言

在细胞培养和动物模型中模拟人类疾病，为药理学治疗药物的发现、优化和验证提供了宝贵的工具，推动候选药物向获批疗法的转化。尽管体外实验与非人类的体内模型组合长期以来一直是药物研发流程中的关键组成部分，但它们往往无法准确预测新型候选药物的临床表现1。目前迫切需要发展能够弥合简单的人体细胞单层培养与临床试验之间差距的技术。近年来，自组织的三维组织培养技术——类器官（organoids）取得了显著进展，其对所模拟组织的模拟保真度不断提高，使其成为临床前药物研发流程中极具前景的工具2。

与非人类的体内模型相比，人类细胞培养的一个主要优势在于能够复制人类代谢所特有的复杂性，而这种复杂性即使在人类与小鼠等高等脊椎动物之间也可能存在显著差异3。然而，这种特异性可能因组织复杂性的降低而被削弱；视网膜组织即为一例，其中多种细胞类型高度交织，并在不同细胞亚型之间形成独特的共生性代谢相互作用，这种相互作用无法通过单层细胞培养来重现4。人类类器官结合了复杂人体组织的模拟特性以及细胞培养的可及性和可扩展性，有望克服这些疾病建模平台的局限性。

由干细胞衍生的视网膜类器官在模拟人类神经视网膜这一复杂组织方面已显示出高度的保真性5。这使得视网膜类器官模型成为研究和治疗视网膜疾病的一项颇具前景的技术6,7。迄今为止，视网膜类器官中的疾病建模主要集中在单基因遗传性视网膜疾病上，即利用携带致病性遗传变异的诱导多能干细胞（iPSC）系来生成类器官7。这些突变通常具有高外显率，并表现为发育过程中的表型异常。相比之下，针对衰老相关疾病的建模研究仍较为有限，这类疾病中，遗传突变和环境应激因素作用于已正常发育的组织。衰老相关的神经退行性疾病可能涉及复杂的遗传背景以及环境应激因素的共同作用，而这些因素本身难以通过短期的细胞培养模型进行有效模拟。然而，在许多情况下，这些复杂疾病最终会汇聚于共同的细胞或代谢应激通路，若能在完全发育成熟的人体组织上进行测试，将有助于深入理解衰老相关神经退行性疾病的发病机制8。

晚发性黄斑变性病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）是遗传性复杂的神经退行性疾病的一个典型例子，这类疾病最终汇聚于共同的代谢缺陷。MacTel是一种少见的与年龄相关的视网膜变性疾病，会导致黄斑区光感受器和Müller胶质细胞的丧失，进而引起中心视力进行性下降9,10,11,12,13。在MacTel患者中，尚未明确的、可能为多因素的遗传模式导致循环丝氨酸水平普遍降低，从而引起一类称为脱氧鞘脂（deoxysphingolipids, deoxySL）的神经毒性脂质种类增加14,15。为了证实deoxySL在视网膜中的毒性作用，并验证潜在的药物治疗方法，我们建立了本实验方案，用于在人视网膜类器官中检测光感受器毒性14。

本文概述了一种用于分化人视网膜类器官、建立基于类器官的毒性与挽救检测方法并量化结果的具体方案。我们提供了一个成功案例，其中确定了疑似致病因子脱氧鞘脂（deoxySL）对组织特异性的毒性，并验证了一种安全的通用药物非诺贝特在治疗deoxySL诱导的视网膜毒性中的潜在应用价值。先前的研究表明，非诺贝特可促进deoxySL的降解，并降低患者体内循环的deoxySL水平，但其在减轻deoxySL诱导的视网膜毒性方面的有效性尚未得到验证16,17。尽管本文展示的是一个具体实例，该方案仍可用于评估任意数量的代谢性或环境应激因素以及潜在治疗药物对视网膜组织的影响。

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方案

1. iPSC/ESC 的解冻、传代与扩增

注意：所有细胞培养步骤均需遵循无菌操作规范，以维持细胞培养的无菌环境。

  1. 用基底膜基质培养基包被6孔细胞培养板。
    1. 制备该培养基的1倍浓度溶液时，按照产品说明书操作，或用9 mL DMEM/F12培养基稀释75 µL冷的基质培养基。每孔加入1.5 mL新鲜配制的1倍浓度培养基，37 °C孵育30分钟。
    2. 吸除基底膜基质培养基，每孔用3 mL DMEM/F12培养基冲洗一次。每孔加入2 mL DMEM/F12培养基，37 °C孵育备用。该包被板需在制备当天使用。
  2. 在PBS中配制10 mM的ROCK抑制剂（Y-27632二盐酸盐）储备液，-20 °C保存备用。
  3. 将一管iPSCs/ESCs解冻后接种至DMEM/F12培养基中，400 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于mTeSR培养基中。将一管细胞接种至已包被的6孔板中，每孔加入含10 µM ROCK抑制剂（Y-27632二盐酸盐）的mTeSR培养基，于培养箱中过夜孵育。次日吸除培养基，更换为不含抑制剂的mTeSR培养基。
    ​注意：每日更换培养基，直至传代。
  4. 通过将500 µL的0.5 M EDTA加入500 mL PBS中，配制0.5 mM EDTA的PBS溶液。
  5. 当细胞融合度达到80-90%时进行传代。根据细胞生长速率，按1:3或1:6的比例将细胞分种至各孔。
    1. 去除培养基后，用0.5 mM EDTA的PBS溶液室温孵育5分钟以解离贴壁细胞。孵育结束后吸除EDTA溶液，使用P1000移液器将1 mL mTeSR培养基强力吹打至细胞表面，使细胞脱落。
    2. 重复吸取并强力吹打mTeSR培养基和细胞悬液，最多5次，以完全去除残留的贴壁细胞。将细胞接种至新的经基底膜基质包被的6孔板中，加入mTeSR培养基。继续每日更换培养基，直至细胞再次达到80-100%融合度。
  6. 当细胞扩增至整块6孔板且融合度达到80-100%时，保留其中一孔用于后续分化实验或冻存保种。其余五孔用于启动分化过程，制备拟胚体。

2. 制备类胚体（EBs）

注意：拟胚体（EB）形成与分化培养基的配方源自 Cowan 的实验方案 等5, Ohlemacher 等人18，以及 Zhong 等人19.

  1. 按如下所述配制1× Dispase溶液和神经诱导培养基（NIM）。
    1. 通过将Dispase粉末溶解于DMEM/F12中，配制10 mg/mL的5×储存液。使用0.22 µm滤器进行无菌过滤。将1 mL分装液储存于-20 °C，直至使用。
    2. 用5× Dispase溶液配制DMEM/F12中的2 mg/mL Dispase溶液，每孔1 mL。将溶液在37 °C预热30分钟。
    3. 通过向DMEM/F12 中添加1% N2补充剂、1% MEM非必需氨基酸（NEAA）和2 mg/mL肝素（180 U/mg），配制NIM。NIM可在4 °C保存长达一个月。
  2. 将16 mL mTeSR与NIM按3:1比例混合（12 mL : 4 mL）的溶液恢复至室温并预热。
  3. 去除分化细胞，并加入预热的Dispase溶液。
    1. 从iPSC/ESC细胞培养物中去除正在分化的细胞。在解剖显微镜下，用p10移液枪头刮除不透明的白色克隆。吸除培养孔中的mTeSR培养基，以去除刚刚被刮下的分化细胞团块。
    2. 立即加入预热的Dispase溶液，并在37 °C孵育，直至在显微镜下观察到大多数细胞克隆边缘开始卷起，通常需要4–8分钟。
      ​注意：Dispase中细胞的孵育时间需由各实验室自行确定。不同细胞系之间孵育时间可能不同，接种后培养3天或更长时间的细胞需要更长的孵育时间。生长缓慢的iPSC/ESC达到汇合所需时间超过3天时，会更强地黏附于培养板，导致细胞难以脱离。对于生长缓慢的细胞，建议以1:2比例传代扩增至完整的6孔板，以缩短从接种到汇合的时间。
  4. 吸除溶液，每孔轻柔地重新加入至少2 mL DMEM/F12培养基。将DMEM/F12培养基缓慢沿孔壁加入，注意避免冲散细胞。
    1. 吸除DMEM/F12培养基，然后用力将1 mL新鲜DMEM/F12直接加至细胞上，以使细胞克隆脱离培养板。使用p1000移液器在孔内反复吸取并强力吹打DMEM/F12，最多5次，尽可能使更多的细胞克隆脱落。
      ​注意：正在分化或已分化的iPSC/ESC比未分化的iPSC/ESC更牢固地黏附于培养板。经多次吹打仍无法脱离的细胞应保留在原孔中。过度吹打会导致细胞死亡，并降低拟胚体（EB）生成效率。每个细胞团块通常包含100–400个细胞。
  5. 将悬浮的克隆转移至15 mL锥形离心管中，并用每孔额外1 mL DMEM/F12培养基冲洗各孔，以收集残留的悬浮克隆。
  6. 让悬浮克隆依靠重力自然沉降，时间不超过5分钟。沉降完成后，保留底部1–2 mL上清液，其余上清液吸除。操作时注意避免扰动底部松软的沉淀。
  7. 将沉淀重悬于预热的3:1 mTeSR:NIM培养基中，并转移至超低吸附T75培养瓶。过夜培养以促进拟胚体（EB）形成。此时间点记为分化的第0天。
  8. 逐步更换为NIM培养基，以启动EB向神经前体细胞的分化。
    1. 次日，吸除培养基，并更换为10 mL 1:1 mTeSR:NIM培养基。从悬浮EB培养物中更换培养基时，将培养瓶倾斜，使EB聚集于瓶底角落。吸除上清液时注意避免吸走底部沉淀中的EB。
    2. 再过一天，将培养基更换为10 mL 1:3 mTeSR:NIM培养基。
    3. 再过一天，更换为完全NIM培养基。此后每2天用NIM培养基更换一次，持续至Dispase处理后的第7天。

3. 胚状体铺板及神经视网膜分化诱导

  1. 在 Dispase 处理后一周，将悬浮的 EB 接种至已包被生长因子减少型基底膜基质的 6 孔板中。包被方法参见步骤 1.1。
    1. 吸除 EB 培养基，更换为 12 mL NIM 培养基。
    2. 轻轻振荡含 EB 的培养基以重悬 EB，确保 EB 均匀分布，然后迅速取出 1/6 的培养基（2 mL）加入一个孔中，重复此操作至其余各孔。
    3. 孵育前，轻轻前后摇动再左右摇动培养板，使 EB 均匀分布。若 EB 聚集于孔中央，则无法正常分化。
      ​注意：接种密度对分化至关重要。每孔接种 EB 数量应超过 30 个。若 EB 产量不足，可将 EB 分布至较少数量的孔中。
  2. 每日更换 NIM 培养基，保持每孔培养基体积约为 3 mL。换液时，保留 1 mL 培养基以防止接种的 EB 干燥，然后沿孔壁缓慢加入 2 mL 新鲜培养基，避免冲起细胞。
  3. EB 接种后第九天，开始在两天内逐步将培养基由 NIM 更换为视网膜分化培养基（RDM）。
    1. 配制 RDM：将以下成分混合，48% DMEM/F12（1:1）和 48% DMEM，补充 2% 不含维生素 A 的 B27 添加剂、1% MEM NEAA 和 1% 青霉素-链霉素。使用 0.20 µm 滤器过滤除菌。RDM 可在 4 °C 保存最多一个月。
    2. 第一天更换为 NIM:RDM = 1:1 的混合培养基；第二天更换为纯 RDM。此后每日均使用 RDM 培养细胞。
      注意：在接下来的几周内，接种的 EB 将形成神经视网膜前体细胞，并开始产生肉眼可见的色素化的视网膜色素上皮（RPE）。

4. 制备游离型类器官并维持游离型类器官培养

  1. 在初次 Dispase 处理后的第 28 天（EB 接种后第 21 天），使用无菌手术刀将已接种的 EB 切割成 1–2 mm2 的网格状小块。此操作可将视网膜前体细胞集落分割为较小的组织块，以防止其在后续发育过程中因中心区域营养交换不足而过度增大并发生坏死。
  2. 分离已接种的 EB。
    1. 首先向每孔中额外加入 2 mL RDM 培养基，然后使用 p1000 移液器吸出约 1000 µL 培养液。接着将培养基用力喷射到已接种的 EB 上，喷射时移液器吸头应完全浸没于液体中。
    2. 重复此操作，直至所有细胞从培养板上脱落。喷射过程中应始终保持吸头浸没在液体中，且推动移液器活塞时不要超过第一档，以避免产生气泡。
  3. 将刚脱落的 EB 组织块重悬于一个无菌塑料 125 mL 锥形瓶中，并加入约 40 mL RDM 培养基。将锥形瓶置于标准培养箱内的轨道摇床上，设置摇床转速为 130–140 RPM（速度档位 3）。
    ​注意：在摇床上培养类器官可防止在高浓度培养条件下类器官相互粘连。生物反应器也可实现相同效果，但使用摇床成本更低。
  4. 通过部分换液方式喂养类器官，每周更换约 12 mL RDM 培养基 2–3 次，具体频率取决于培养基变黄的程度。早期类器官所需喂养较少，但随着其生长，需更频繁地更换更多培养基。
  5. 每两周修剪一次类器官，以去除非视网膜来源、过度生长或正在死亡的类器官。此操作可避免浪费培养基，并改善剩余视网膜类器官的健康状况。
    1. 使用 5 mL 移液器将细胞从锥形瓶转移至 6 孔板或 10 cm 培养皿中。保留具有分层神经上皮结构的类器官（图 1A，星号标记）。此类类器官呈透明或白色。
    2. 使用 5 mL 移液器挑出并移除形态异常、过度生长的视网膜类器官以及非视网膜来源的类器官。这些类器官通常呈不透明且偏黄色（图 1A）。同时移除所有不具备分层神经上皮结构的组织。最初的几次修剪较为耗时费力，但随着类器官体积增大且形态趋于均一，后续修剪将变得容易得多（图 1B）。

5. 维持成熟类器官并将其分化为终末分化视网膜组织

  1. 在首次使用Dispase处理形成EB后的第56天（第8周）（即EB从培养瓶中解离后继续培养28天），将类器官培养基更换为RDM+。这将提供额外营养，以促进类器官完全成熟为视网膜组织。
    1. 用PBS配制100 mM牛磺酸溶液，分装后于-20 °C保存备用。
    2. 通过向RDM中添加10% FBS、100 µM 牛磺酸和2 mM商品化谷氨酰胺补充剂，制备RDM+培养基。使用0.20 µm滤器过滤除菌。
    3. 继续每周更换RDM+培养基2-3次。
  2. 在Dispase处理后的第17-18周，使用5 mL移液管将类器官从锥形瓶转移至超低吸附6孔板中。在第一周内，需每天进行修剪并分离相互粘连的类器官，直至类器官不再发生聚集。每孔最佳密度为10-15个类器官。每周更换培养基2-3次。
    注意：若类器官频繁相互粘连，或在换液间隔期间培养基迅速变黄，应减少每孔中的类器官数量。
  3. 预计在第18周时类器官将完全进入终末分化状态5，此时整个类器官中均可见神经视网膜细胞。至第24周时，检查类器官外侧是否形成初步的外节结构。在第26-28周，确认类器官外侧已形成较厚的外节结构（图1C）。当类器官具备明确的外节结构、表明其已达到成熟分化状态后，可在第26周之后开展毒性检测实验。
    注意：仅使用分化良好的视网膜类器官进行毒性检测。对具有清晰外节结构的类器官进行毒性检测有助于准确识别其反应。

6. 脱氧鞘氨醇（deoxySA）与药物处理

注意：此处展示的是在4天时间内使用非诺贝特单次处理以挽救脱氧鞘氨醇（deoxySA）毒性的实验方案（图2）。然而，根据实验需求，可对类器官中添加的脱氧鞘氨醇浓度、脱氧鞘氨醇处理类器官的持续时间以及用于挽救毒性的药物种类进行调整，以检测毒性及毒性挽救效果14。

  1. 用乙醇配制1 mM的脱氧鞘氨醇（deoxySA）储备液，于-20 °C保存1个月。或者，也可使用DMSO配制deoxySA储备液。
  2. 对deoxySA进行系列稀释，以确定用于药物挽救实验的合适毒性浓度。
    ​注意：首先需确定一个能够引起足够细胞死亡、从而可检测到挽救效应的deoxySA浓度。若浓度过高，毒性反应将导致类器官解体，无法观察到挽救效果；若毒性反应过低，则难以观察到显著的挽救效应。deoxySA的毒性反应可能因实验室之间或deoxySA批次不同而有所差异。
    1. 将1 mM deoxySA储备液分别用3 mL RDM+稀释至0.5 µM、1 µM和2 µM。向RDM+中加入3 µL乙醇以制备对照处理组。
    2. 在解剖显微镜下，使用无菌探针挑选出4组类器官，每组至少包含5个类器官。将各组分至超低吸附6孔板的不同孔中。挑选大小和形态相近的类器官。
    3. 尽可能吸除类器官中的RDM+培养基。向每孔类器官中加入含相应浓度deoxySA的RDM+培养基。向第四孔类器官中加入载体对照。
    4. 在含deoxySA 或载体的培养基中培养两天后，更换为新配制的相应deoxySA稀释液RDM+培养基。
    5. 在处理第四天，进入步骤7，对类器官进行处理并检测细胞死亡。确定deoxySA浓度后，继续进行步骤6.3，加入非诺贝特处理。
      注意：所选deoxySA处理组的目标细胞死亡水平为每10,000 µm2出现5–20个TUNEL阳性细胞。在整个处理过程中，类器官不应因探针触碰而发生解体。
  3. 使用选定的毒性剂量deoxySA与非诺贝特（fenofibrate）共同处理类器官。
    1. 用DMSO配制40 mM的非诺贝特储备液，于-20 °C保存，最长可保存1年。
    2. 配制药物处理培养基：在3 mL RDM+中，将1 mM deoxySA储备液稀释至1 µM，并将40 mM非诺贝特储备液稀释至20 µM。
    3. 配制deoxySA处理培养基：在3 mL RDM+中，将1 mM deoxySA储备液稀释至1 µM，并加入1.5 µL DMSO。
    4. 配制对照培养基：在3 mL RDM+中加入3 µL乙醇和1.5 µL DMSO。
    5. 在解剖显微镜下，使用无菌探针挑选三组类器官，每组至少包含5个类器官。将各组分至超低吸附6孔板的不同孔中。
    6. 向类器官中加入已配制的处理液（deoxySA、deoxySA + 非诺贝特，或对照）。两天后，更换为新配制的RDM+培养基，并补充相应的deoxySA / 非诺贝特 / 对照溶液。
    7. 在处理第四天，进入步骤7，对类器官进行处理并检测细胞死亡（图2）。

7. 类器官的包埋与冷冻切片

  1. 通过将1 mL的16% PFA安瓿液加入3 mL PBS中，配制新鲜的4% PFA溶液。
  2. 从类器官中移除RDM+培养基，并用PBS冲洗一次。尽可能彻底去除类器官周围的PBS。向类器官中加入2 mL新配制的4% PFA（溶于PBS），室温孵育15分钟。
  3. 孵育15分钟后，用2 mL PBS将类器官冲洗两次，随后再用PBS洗涤10分钟。
    注意：固定操作应在化学通风橱中进行，PFA溶液及随后两次PBS冲洗液应弃置于通风橱内贴有适当标签的PFA废液容器中。
  4. 吸除所有PBS，然后向固定的类器官中加入含20%蔗糖的PBS溶液。确保类器官完全混入蔗糖溶液中，避免其漂浮在溶液表面的PBS气泡中。将类器官保留在蔗糖溶液中直至其沉降至底部，即室温下约1小时。固定后的类器官可在4 °C条件下于蔗糖溶液中保存过夜。
  5. 将类器官置于冷冻切片模具中的OCT包埋剂中。每种实验条件下的多个类器官可共同包埋于同一模具中。调整类器官方向，确保其最佳视网膜区域可在冷冻切片机中被横切，且所有类器官的中心大致处于同一平面。将包埋好的类器官在-20 °C下冷冻。包埋后的类器官可在-80 °C长期保存数年。
    注意：冷冻后的OCT中类器官难以观察；建议将RPE细胞簇朝向模具中将来面对刀片的一侧，以便于识别类器官位置。
  6. 将类器官切成10–14 µm厚的冷冻切片，并将切片贴附于经多聚-L-赖氨酸处理的载玻片上。切片过程中应反复在显微镜下检查载玻片，以识别包含类器官中心区域的切片。仅收集类器官中部的切片，确保所有视网膜层结构均匀呈现（图2A-C，图3）。切片完成后，载玻片可于-80 °C在玻片盒中长期保存数年。
    注意：位于类器官两端的切片会过度取样最外层的光感受器细胞，不适合用于定量分析。中等大小的类器官通常可获得10–15张中部切片，代表分层视网膜结构的横截面。

8. 凋亡细胞的TUNEL染色

  1. 将冷冻切片在 37 °C 下解冻 30 分钟。立即将切片置于 37 °C 可防止冷凝水形成。纯水浸泡组织样本可能导致组织变形。37 °C 孵育还可增强组织与玻片之间的黏附性。
  2. 使用疏水笔在玻片上围绕组织切片绘制连续的封闭边界。该边界有助于限定区域，确保使用少量溶液即可完成充分的固定和抗体孵育。加入约 100–200 µL 新鲜配制的 4% 多聚甲醛（PFA），覆盖疏水笔划定的区域且不溢出，孵育 20 分钟。操作需在化学通风橱中进行，用毕的 PFA 溶液应弃置于通风橱内贴有明确标签的 PFA 废液容器中。
  3. 用 PBS 冲洗切片一次，随后在室温下用 PBS 洗涤 25 分钟。
  4. 配制 TUNEL 反应混合液。将原位细胞死亡检测试剂盒中的紫色和蓝色小瓶解冻。取出 100 µL 紫色小瓶溶液（可用于阴性对照），将剩余的 450 µL 紫色溶液与 50 µL 蓝色溶液混合。充分混匀后避光保存。每套试剂瓶（共 500 µL）可染色 5–10 张切片。
  5. 对组织切片进行通透处理。
    1. 配制通透液：含 0.1% TritonX-100 和 0.1% 柠檬酸钠的 PBS 溶液。
    2. 吸除样本切片上的 PBS，加入通透液，于冰上或 4 °C 孵育 2 分钟。随后用 PBS 冲洗一次，再用 PBS 洗涤 10 分钟。
  6. 吸除 PBS，并用折叠滤纸的角落尽可能吸干残留液体。根据疏水笔划定区域的大小，加入 50–100 µL 配制好的 TUNEL 反应液。加盖盖玻片，在 37 °C 避光孵育 1 小时。
    注意：后续所有孵育和洗涤步骤均需避光进行，以防止荧光染料漂白。可使用暗盒或将切片用铝箔包裹以避光。
  7. 标记视锥/视杆细胞。用 PBS 冲洗一次，随后在 PBS 中洗涤 20 分钟。吸除 PBS，加入以含 0.1% Tween 和 5% 驴血清的 PBS 缓冲液按 1:500 稀释的一抗 Recoverin 抗体（兔抗 Recoverin）。4 °C 过夜孵育。
  8. 去除一抗后，用 PBS 冲洗一次，再用 PBS 洗涤 20 分钟。加入以含 0.1% Tween 和 5% 驴血清的 PBS 缓冲液按 1:1,000 稀释的二抗（驴抗兔，偶联橙色或红色荧光染料），室温孵育 2 小时。用 PBS 冲洗一次，再用 PBS 洗涤 20 分钟。加入 PBS 中按 1:1,000 稀释的 DAPI，室温孵育 10 分钟。
  9. 用 PBS 冲洗一次，再用 PBS 洗涤 20 分钟。吸除 PBS，加入封片剂，加盖盖玻片，用指甲油封边，置于暗处干燥。切片可在避光容器中于 4 °C 保存最多 1 周。
    注意：为获得最佳成像效果，建议于次日进行图像采集。

9. 器官样体切片成像与死亡率定量分析。

注意：成像需要具备区分三种荧光染料通道能力的共聚焦显微镜。本实验使用绿色（Alexa Fluor 488）、橙色（Alexa Fluor 555）和紫外光（DAPI）通道。可使用任意组合的荧光染料，但需确保发射光谱不会串入其他通道。

  1. 定位用于成像和定量的视网膜切片。在显微镜低倍镜（5x 或 10x）下，利用 Recoverin 染色（标记光感受器细胞的细胞质）和 DAPI 染色（标记所有细胞的细胞核），找到类器官切片中结构完整、形态良好且能代表类器官典型横截面的区域（图 2 和 图 3）。选择一个具有明显外核层、光感受器层厚度至少为数个细胞，并且存在一个独立且不表达 Recoverin 染色的细胞核层的切片（图 2 和 图 3）。
  2. 确定成像范围。将显微镜放大倍数调整至 20x 物镜，调整视野，尽可能使光感受器层占据整个图像区域（图 3）。
  3. 设置 Z 平面。若使用可采集 Z 层切片图像的显微镜，应设定 Z 范围的上下限，以覆盖整个切片的深度。同一实验组中的所有图像应使用相同的 Z 层厚度，以确保各样本检测的组织量一致。若未使用可采集 Z 层图像的显微镜，则将焦点置于切片的中层位置。
  4. 以 Z 层切片模式采集三个荧光通道的图像。三个通道均需成像，以准确识别凋亡细胞。每个类器官采集一个区域的图像。
  5. 将图像数据保存为能保持像素面积比例不变的文件格式。

10. 定量分析死亡细胞

  1. 在 FIJI (Image J) 软件中打开图像堆栈。在 Bio-Formats Import Options 窗口中，确保 "split into separate windows" 部分下的所有选项框均未被选中。在对齐的图像通道之间滚动浏览，对于准确识别细胞至关重要。
  2. 通过点击 Image > Stacks，然后从下拉菜单中选择“Z project”，将 Z 堆栈图像集进行投影合并。这将生成一幅用于定量分析的新图像。如果类器官未以 Z 系列成像，则跳过此步骤。
  3. 选择显示 Recoverin 染色（本示例中为红色）的图像通道。在工具栏中点击多边形选择工具，并在图像中勾勒出感光细胞的连续区域（图 3A）。点击 Analyze > Set Measurements。在弹出的 Set Measurements 窗口中，勾选 Area 旁边的复选框，然后点击 Analyze 并选择 Measure 以测量感光细胞区域的面积（或按快捷键 "m"）用于计数死亡细胞。面积测量值将显示在弹出的测量结果窗口中。
  4. 计数先前选定的感光细胞区域内 TUNEL 阳性细胞核的数量（图 3B,C）。在工具栏中右键点击点选工具，并选择多点工具。仅在 TUNEL 通道中，点击与 DAPI 阳性细胞核及 Recoverin 染色重叠的 TUNEL 阳性信号。在不同通道间切换，以确认阳性细胞。
  5. 将 TUNEL 阳性细胞数量除以所测面积，得到每个类器官中感光细胞死亡的标准化数值（图 2D,E）。

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结果

视网膜类器官由一条非MacTel对照iPSC系生成。类器官在培养至26周后被挑选并分配至不同的实验组。通过给予不同浓度的脱氧鞘氨醇（deoxySA）处理，以确定deoxySA是否对光感受器细胞具有毒性。共测试了0至1 µM的四种deoxySA浓度（图2），处理持续8天，每隔一天更换一次培养基。细胞死亡反应呈deoxySA浓度依赖性，在低至50 nM的deoxySA浓度下即可检测到毒性效应（图2D）。在所测试的最高浓度1 µM deoxySA下，毒性效应显著，同时仍能维持视网膜类器官的整体结构完整性（图2B，D）。而更高浓度（5 µM）的deoxySA则导致类器官在数天内发生解体（数据未显示）。deoxySA剂量反应实验的结果确定了后续毒性研究中的最优deoxySA浓度。1 µM deoxySA剂量可引起显著的细胞死亡，但未出现如5 µM时所观察到的毒性过饱和现象。

为了检...

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讨论

分化方案的差异
自从Yoshiki Sasai团队发明自形成视杯以来20，许多实验室已开发出生成视网膜类器官的方案，这些方案几乎在每一步都可能存在差异5,18,19,21。Capowski等人提供了一份详尽的方案列表22。本文所提供的分化方案是一种简单且干预较少的方法，可为任何尝试分化成熟视网膜类器官的实验室提供良好的起点。鼓励使用者探索并采用本方案的各类改进版本。常见的方案优化步骤包括胚状体（EBs）的生成与早期分化，以及使用BMP4、DKK-1或视黄酸等分化因子以提高效率5,19,

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致谢

由Lowy医学研究所资助。我们感谢Lowy家族对MacTel项目的支持。我们感谢Mari Gantner、Mike Dorrell和Lea Scheppke在学术方面的贡献以及对稿件准备工作的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5M EDTAInvitrogen15575020
125 mL 锥形瓶VWR89095-258
1-脱氧鞘氨醇Avanti860493
B27 添加剂（不含维生素 A）Gibco12587010
Beaver 6900 微型刀片Beaver-VisitecBEAVER6900
D-(+)-蔗糖VWR97061-432
DAPIThermo-fisherD1306
Dispase II，粉末Gibco17105041
DMEM，高糖，含丙酮酸Gibco11995073
DMEM/F12Gibco11330
驴抗兔 IgG，Alexa Fluor Plus 555 标记Thermo-fisherA32794
驴血清SigmaD9663-10ML
FBS，热灭活Corning45001-108
非诺贝特SigmaF6020
GlutaMAXGibco35050061
肝素Stemcell Technologies7980
原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素标记Sigma11684795910
Matrigel，生长因子减少型Corning356230
MEM 非必需氨基酸溶液Gibco11140050
mTeSR 1Stemcell Technologies85850
N2 添加剂Gibco17502048
青霉素-链霉素Gibco15140122
Pierce 16% 甲醛Thermo-fisher28906
兔抗 Recoverin 抗体MilliporeAB5585
柠檬酸钠SigmaW302600
Steriflip 无菌一次性真空滤器MilliporeSigmaSE1M179M6
牛磺酸SigmaT0625
Tissue Plus-O.C.T. 包埋剂Fisher Scientific23-730-571
Tissue-Tek 冷冻模具EMS62534-10
Triton X-100SigmaX100
Tween-20SigmaP1379
超低吸附 6 孔板Corning29443-030
超低吸附 75 cm² U 型培养瓶Corning3814
真空过滤系统VWR10040-436
Vectashield 封片剂Vector LabsH-1000
蜡笔（ImmEdge）Vector LabsH-4000
Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）SigmaY0503

参考文献

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