用于药物发现的人类视网膜类器官毒性筛选

摘要

本文介绍了一种逐步生成成熟人类视网膜类器官的实验方案，并将其应用于光感受器毒性检测，以筛选针对年龄相关性视网膜变性疾病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）的潜在药物候选分子。

摘要

类器官为研究疾病机制和治疗方法提供了一个极具前景的平台，能够在人类组织的背景下直接开展研究，同时兼具细胞培养的灵活性和高通量优势。成熟的类人视网膜类器官被用于筛选针对年龄相关性视网膜变性疾病——2型黄斑毛细血管扩张症（MacTel）的潜在药物治疗方法。

我们最近发现，MacTel 可能由一类非典型脂质——脱氧鞘脂（deoxysphingolipids, deoxySLs）水平升高引起。这类脂质对视网膜具有毒性，可能导致 MacTel 患者出现感光细胞丢失。为了筛选能够防止脱氧鞘脂对感光细胞产生毒性的药物，我们利用非 MacTel 来源的诱导多能干细胞（iPSC）系生成了人类视网膜类器官，并将其培养至有丝分裂后阶段，使其发育出视网膜中所有神经谱系来源的细胞，包括功能成熟的感光细胞。随后，将视网膜类器官暴露于一种脱氧鞘脂代谢物中，并通过免疫组织化学方法检测感光细胞层的细胞凋亡情况。利用该毒性模型，我们筛选了可防止脱氧鞘脂诱导的感光细胞死亡的药理化合物。通过靶向候选策略，我们发现非诺贝特（fenofibrate）——一种常用于治疗高胆固醇和高甘油三酯的药物——也可防止脱氧鞘脂在视网膜细胞中引起的毒性作用。

毒性筛选成功鉴定出一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准、可预防感光细胞死亡的药物。由于所采用的疾病模型具有高度相关性，该发现可直接用于后续研究。该平台可轻松改造，用于测试多种代谢应激因素及潜在的药理学干预手段，从而推动未来视网膜疾病治疗方案的发现。

引言

在细胞培养和动物模型中模拟人类疾病，为药理学治疗药物的发现、优化和验证提供了宝贵的工具，推动候选药物向获批疗法的转化。尽管体外实验与非人类的体内模型组合长期以来一直是药物研发流程中的关键组成部分，但它们往往无法准确预测新型候选药物的临床表现¹。目前迫切需要发展能够弥合简单的人体细胞单层培养与临床试验之间差距的技术。近年来，自组织的三维组织培养技术——类器官（organoids）取得了显著进展，其对所模拟组织的模拟保真度不断提高，使其成为临床前药物研发流程中极具前景的工具²。

与非人类的体内模型相比，人类细胞培养的一个主要优势在于能够复制人类代谢所特有的复杂性，而这种复杂性即使在人类与小鼠等高等脊椎动物之间也可能存在显著差异³。然而，这种特异性可能因组织复杂性的降低而被削弱；视网膜组织即为一例，其中多种细胞类型高度交织，并在不同细胞亚型之间形成独特的共生性代谢相互作用，这种相互作用无法通过单层细胞培养来重现⁴。人类类器官结合了复杂人体组织的模拟特性以及细胞培养的可及性和可扩展性，有望克服这些疾病建模平台的局限性。

由干细胞衍生的视网膜类器官在模拟人类神经视网膜这一复杂组织方面已显示出高度的保真性^5<....

方案

1. iPSC/ESC 的解冻、传代与扩增

注意：所有细胞培养步骤均需遵循无菌操作规范，以维持细胞培养的无菌环境。

1. 用基底膜基质培养基包被6孔细胞培养板。
   1. 制备该培养基的1倍浓度溶液时，按照产品说明书操作，或用9 mL DMEM/F12培养基稀释75 µL冷的基质培养基。每孔加入1.5 mL新鲜配制的1倍浓度培养基，37 °C孵育30分钟。
   2. 吸除基底膜基质培养基，每孔用3 mL DMEM/F12培养基冲洗一次。每孔加入2 mL DMEM/F12培养基，37 °C孵育备用。该包被板需在制备当天使用。
2. 在PBS中配制10 mM的ROCK抑制剂（Y-27632二盐酸盐）储备液，-20 °C保存备用。
3. 将一管iPSCs/ESCs解冻后接种至DMEM/F12培养基中，400 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于mTeSR培养基中。将一管细胞接种至已包被的6孔板中，每孔加入含10 µM ROCK抑制剂（Y-27632二盐酸盐）的mTeSR培养基，于培养箱中过夜孵育。次日吸除培养基，更换为不含抑制剂的mTeSR培养基。
   ​注意：每日更换培养基，直至传代。
4. 通过将500 µL的0.5 M EDTA加入500 mL PBS中，配制0.5 mM EDTA的PBS溶液。

结果

视网膜类器官由一条非MacTel对照iPSC系生成。类器官在培养至26周后被挑选并分配至不同的实验组。通过给予不同浓度的脱氧鞘氨醇（deoxySA）处理，以确定deoxySA是否对光感受器细胞具有毒性。共测试了0至1 µM的四种deoxySA浓度（图2），处理持续8天，每隔一天更换一次培养基。细胞死亡反应呈deoxySA浓度依赖性，在低至50 nM的deoxySA浓度下即可检测到毒性效应（图2D）。在所测试的最高浓度1 µM deoxySA下，毒性效应显著，同时仍能维持视网膜类器官的整体结构完整性（图2B，D）。而更高浓度（5 µM）的deoxySA则导致类器官在数天内发生解体（数据未显示）。deoxySA剂量反应实验的结果确定了后续毒性研究中的最优deoxySA浓度。1 µM deoxySA剂量可引起显著的细胞死亡，但未出现如5 µM时所观察到的毒性过饱和现象。

为了检.......

讨论

分化方案的差异
自从Yoshiki Sasai团队发明自形成视杯以来²⁰，许多实验室已开发出生成视网膜类器官的方案，这些方案几乎在每一步都可能存在差异^5,18,19,21。Capowski等人提供了一份详尽的方案列表²²。本文所提供的分化方案是一种简单且干预较少的方法，可为任何尝试分化成熟视网膜类器官的实验室提供良好的起点。鼓励使用者探索并采用本方案的各类改进版本。常见的方案优化步骤包括胚状体（EBs）的生成与早期分化，以及使用BMP4、DKK-1或视黄酸等分化因子以提高效率^5,19,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125 mL 锥形瓶	VWR	89095-258
1-脱氧鞘氨醇	Avanti	860493
B27 添加剂（不含维生素 A）	Gibco	12587010
Beaver 6900 微型刀片	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-蔗糖	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II，粉末	Gibco	17105041
DMEM，高糖，含丙酮酸	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
驴抗兔 IgG，Alexa Fluor Plus 555 标记	Thermo-fisher	A32794
驴血清	Sigma	D9663-10ML
FBS，热灭活	Corning	45001-108
非诺贝特	Sigma	F6020
GlutaMAX	Gibco	35050061
肝素	Stemcell Technologies	7980
原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素标记	Sigma	11684795910
Matrigel，生长因子减少型	Corning	356230
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 添加剂	Gibco	17502048
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
Pierce 16% 甲醛	Thermo-fisher	28906
兔抗 Recoverin 抗体	Millipore	AB5585
柠檬酸钠	Sigma	W302600
Steriflip 无菌一次性真空滤器	MilliporeSigma	SE1M179M6
牛磺酸	Sigma	T0625
Tissue Plus-O.C.T. 包埋剂	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek 冷冻模具	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
超低吸附 6 孔板	Corning	29443-030
超低吸附 75 cm² U 型培养瓶	Corning	3814
真空过滤系统	VWR	10040-436
Vectashield 封片剂	Vector Labs	H-1000
蜡笔（ImmEdge）	Vector Labs	H-4000
Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）	Sigma	Y0503