我们介绍一种构建简单孢子分布系统的方案，该系统由一个带有约50 µm孔径筛网的接种箱和一个透明塑料培养室组成。该装置可用于将白粉病孢子均匀地接种到植物上，从而能够准确且可重复地评估所研究植物的病害表型。
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方法文章
一种简便且灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥及其他植物的白粉病侵染表型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
减少由真菌病害引起的作物损失，需要深入理解调控植物免疫和真菌致病性的机制，而这又依赖于对植物感染特定真菌病原体后疾病表型的准确判定。然而，对于无法培养的专性活体营养型真菌病原体（如白粉菌），准确的病害表型鉴定难以实现，可能成为研究项目的限速步骤。本文以拟南芥—白粉菌互作为例，建立了一种安全、高效且易于操作的病害表型鉴定系统。该系统主要包括三个部分：（i）一个配有可拆卸盖子的木质接种箱，盖子上安装有孔径约50 µm的不锈钢或尼龙网，用于对一批植物进行真菌孢子接种；（ii）一个带有小型前开口的透明塑料接种室，可在内部进行接种操作的同时最大限度减少孢子逸出；（iii）一种用于均匀有效地分散和分布孢子的孢子脱落与分布方法。本文所述方案包括以低成本制作接种箱和塑料接种室的具体步骤与参数，以及一段视频演示，展示如何使用该系统实现白粉菌孢子的均匀接种，从而提高病害表型鉴定的准确性与可重复性。
引言
白粉病是多种粮食作物和观赏植物中最常见且最重要的病害之一1。白粉病相关研究十分广泛，仅在Web of Science数据库中以“powdery mildew”为关键词进行检索，截至2020年11月就已有超过10,500篇相关出版物。事实上，根据《分子植物病理学》（Molecular Plant Pathology）期刊的评价，白粉菌（以Blumeria graminis为代表）被认为是十大重要真菌病原体之一2。在鉴定参与植物抗病或感病反应的基因，或功能鉴定白粉菌中候选效应子基因时，对病害敏感性进行定量分析是必不可少的步骤。然而，与其他大多数真菌病原体相比，白粉病的表型鉴定更为困难，部分原因在于，与后者不同，白粉菌物种的孢子（根据本实验室经验，如Golovinomyces cichoracearum UCSC1）在经过水悬浮处理后活力会下降3,4。若对测试植物接种特定白粉病原菌时接种量不足或分布不均，可能导致表型分析结果不准确。
已有多种接种方法被报道用于白粉病研究。这些方法包括：（i）将感病叶片上的孢子直接刷到待测植株上5；（ii）将孢子悬浮液喷洒至待测植株
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方案
1. 制作带有可拆卸顶盖和网罩的标准接种箱
- 从商店购买一卷50 µm尼龙膜网或48 µm不锈钢网（推荐使用）。请确保订购足够数量，以便裁剪成多个14英寸×26英寸的片材，用于更换磨损的网片。
- 购买一块1/4英寸×2英尺×4英尺的中密度纤维板或胶合板，并将其切割成两块24-1/2英寸×10英寸和两块12英寸×10英寸的木板，用于制作接种箱。使用8个角夹固定四边。
注意：当面对箱体的宽面时，左侧的12英寸×10英寸侧板为永久固定，右侧的12英寸×10英寸侧板为可拆卸门，由四个磁性扣固定（图1A，B）。 - 在左侧侧板的每个内角上方、距顶部和底部各1英寸处，安装四个2英寸角撑，并标记后钻孔。使用螺丝将左侧短边永久固定到两个长边（前后面板）上。两个长边之间的内侧距离应为12英寸，而非11-1/2英寸。
- 保持角夹就位并对准右侧门的位置，在相应位置标记并钻孔以安装四个磁性扣，用于固定右侧可拆卸门。在门上安装一个旋钮。门的顶部卡在顶盖下方（图1A，B）。
- 为制作带网的可拆卸顶盖，将长条方形木条切割为两组，分别为26英寸和12-3/4英寸。将这四段木条胶合并钉接，使其能够环绕箱体安装——框架的内径应略大于箱体的外径，因为筛网将被固定在此框架上。
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结果
本文介绍一种新型白粉病孢子接种方法，该方法易于制备、操作和调整。图1展示了标准接种箱的组装结构，重点说明了带有50 µm膜网的可拆卸盖子的构造。图2展示了接种室的组装方式。图3图示了使用该系统进行接种过程的关键步骤。图4展示了其他类型的接种箱，可用于接种整盘或少量植株，或接种在MS-琼脂培养基上的离体叶片。最后，图5提供了数据，以展示孢子分布或植株感染表型所反映的接种均匀性。
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讨论
我们的网格盒接种方法相较于其他接种方法具有多项优势。首先，若操作得当，可实现孢子的均匀分布，如图5所示。其次，采用约50 µm的筛网，并通过轻轻摇动感病叶片使孢子脱落，可减少来源于供体植株的蓟马或其他植物病原昆虫对植株的侵染。第三，使用不同尺寸的接种盒在塑料接种室中对植株或离体叶片进行接种（两者均可通过喷洒75%乙醇轻松清洁），可更有效地利用接种物并减少交叉污染。我们发现，在整个接种过程中，几乎没有或仅有极少量真菌孢子从接种室中逸出。
高质量的接种箱是确保均匀接种的关键。我们发现，标准接种箱可用于拟南芥幼苗和成株（图1）、草莓幼苗、苦苣菜以及N. benthamiana（未展示）的接种。若植株高度超过5英寸，可进一步增加接种箱的高度，以确保网罩与下方植株之间有足够的距离（> 5 in），从而实现孢子的均匀分布。此外，塑料室的高度也可相应增加，以便在接种箱顶部操作时有充足的空间进行孢子振落和刷涂。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国家科学基金会（IOS-1901566）对 S. Xiao 的资助。作者感谢 F. Coker 和 C. Hooks 对植物生长设施的维护，以及 Jorge Zamora 在接种箱和接种室制作过程中提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 48 µm 不锈钢格栅网筛；尺寸：24" X 48" | 亚马逊 | NA | 用于制作接种箱的盖子 |
| #6-32 x ¾" 机械螺钉、平垫圈和螺母 | 家得宝 | NA | 用于制作接种室 |
| #6-32 镀锌尼龙锁紧螺母（4 件装） | 家得宝 | NA | 用于制作接种室 |
| #6-32x3/8” Phillips 平头机械螺钉、平垫圈和螺母 | 家得宝 | NA | 用于固定 磁性门扣板 |
| #8-32x1/2" 机械螺钉、平垫圈和螺母 | 家得宝 | NA | 用于固定角撑和门铰链 |
| 0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜保护板； 大小：17 ½" ×20" | 专业塑料 | SACR.250CEF | 用于制作接种室 |
| 0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜覆盖板材；尺寸：18" ×20" | 专业塑料 | SACR.250CEF | 用于制作接种室 |
| 0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜遮蔽板；尺寸：18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | 用于制作接种室 |
| 0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜遮蔽板材；尺寸：20" X 29 ½ " | 专业塑料 | SACR.250CEF | 用于制作接种室 |
| 1-5/8" 柜门磁性扣 白色 | 家得宝 | 型号 #P110-W | 用于制作接种室 |
| 2" 镀锌钢角撑（8 件装） | 家得宝 | 型号 #13611 | 用于制作接种箱 &和 室 |
| 3" 角夹 | Harbor Freight Tools | 货号 63653、1852、60589 | 用于制作接种室 |
| 3/4" 镀锌钢角撑（4 件装） | 家得宝 | 型号 #13542 | 用于制作接种箱 &和室 |
| 4-7/8" 镀锌轻型门拉手 | 家得宝 | 型号 #15184 | 用于制作接种箱 |
| 细扇形搅拌刷 | 米歇尔商店 | M10472846 | 用于接种 |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" 木制方形棒材 | 家得宝 | NA | 用于制作接种箱的盖子 |
| 中密度纤维板（1/4英寸）" x 2' x 4' | 家得宝 | 型号 1508104 | 用于制作接种箱 |
| 圆形玻璃盖玻片，直径500 µm 网格 | ibidi USA Inc. | 10816 | 用于确定 孢子密度 |
参考文献
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology.
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重印与许可
