一种简便且灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥及其他植物的白粉病侵染表型

摘要

我们介绍一种构建简单孢子分布系统的方案，该系统由一个带有约50 µm孔径筛网的接种箱和一个透明塑料培养室组成。该装置可用于将白粉病孢子均匀地接种到植物上，从而能够准确且可重复地评估所研究植物的病害表型。

摘要

减少由真菌病害引起的作物损失，需要深入理解调控植物免疫和真菌致病性的机制，而这又依赖于对植物感染特定真菌病原体后疾病表型的准确判定。然而，对于无法培养的专性活体营养型真菌病原体（如白粉菌），准确的病害表型鉴定难以实现，可能成为研究项目的限速步骤。本文以拟南芥—白粉菌互作为例，建立了一种安全、高效且易于操作的病害表型鉴定系统。该系统主要包括三个部分：（i）一个配有可拆卸盖子的木质接种箱，盖子上安装有孔径约50 µm的不锈钢或尼龙网，用于对一批植物进行真菌孢子接种；（ii）一个带有小型前开口的透明塑料接种室，可在内部进行接种操作的同时最大限度减少孢子逸出；（iii）一种用于均匀有效地分散和分布孢子的孢子脱落与分布方法。本文所述方案包括以低成本制作接种箱和塑料接种室的具体步骤与参数，以及一段视频演示，展示如何使用该系统实现白粉菌孢子的均匀接种，从而提高病害表型鉴定的准确性与可重复性。

引言

白粉病是多种粮食作物和观赏植物中最常见且最重要的病害之一¹。白粉病相关研究十分广泛，仅在Web of Science数据库中以“powdery mildew”为关键词进行检索，截至2020年11月就已有超过10,500篇相关出版物。事实上，根据《分子植物病理学》（Molecular Plant Pathology）期刊的评价，白粉菌（以Blumeria graminis为代表）被认为是十大重要真菌病原体之一²。在鉴定参与植物抗病或感病反应的基因，或功能鉴定白粉菌中候选效应子基因时，对病害敏感性进行定量分析是必不可少的步骤。然而，与其他大多数真菌病原体相比，白粉病的表型鉴定更为困难，部分原因在于，与后者不同，白粉菌物种的孢子（根据本实验室经验，如Golovinomyces cichoracearum UCSC1）在经过水悬浮处理后活力会下降^3,4。若对测试植物接种特定白粉病原菌时接种量不足或分布不均，可能导致表型分析结果不准确。

已有多种接种方法被报道用于白粉病研究。这些方法包括：（i）将感病叶片上的孢子直接刷到待测植株上⁵；（ii）将孢子悬浮液喷洒至待测植株⁶；（iii）利用真空驱动的沉降塔将孢子吹至塔底植株上⁷；以及（iv）结合尼龙网膜和声波振动进行孢子递送⁸。孢子刷涂（或撒粉）法操作简便，但接种不均匀，因此可能不适用于定量评估。孢子喷雾法方便且分布均匀，但如上所述，可能导致孢子萌发率较低⁴。后两种方法（即iii–iv）在实现均匀接种方面有显著改进；然而，它们在单次接种所涉及的植株数量方面调整灵活性较差，设备制备较为复杂，且其使用受限于具备真空源和/或电源的实验室环境。

我们的实验室研究植物与白粉菌互作已超过20年^9,10。在过去的十年中，我们测试了多种接种方法，并近期开发出一种简单而有效的白粉菌接种方法。这种基于筛网的孢子刷涂法可确保接种均匀，操作简便且可扩展，因此任何从事白粉菌研究的实验室都可轻松采用。

方案

1. 制作带有可拆卸顶盖和网罩的标准接种箱

1. 从商店购买一卷50 µm尼龙膜网或48 µm不锈钢网（推荐使用）。请确保订购足够数量，以便裁剪成多个14英寸×26英寸的片材，用于更换磨损的网片。
2. 购买一块1/4英寸×2英尺×4英尺的中密度纤维板或胶合板，并将其切割成两块24-1/2英寸×10英寸和两块12英寸×10英寸的木板，用于制作接种箱。使用8个角夹固定四边。
   注意：当面对箱体的宽面时，左侧的12英寸×10英寸侧板为永久固定，右侧的12英寸×10英寸侧板为可拆卸门，由四个磁性扣固定（图1A，B）。
3. 在左侧侧板的每个内角上方、距顶部和底部各1英寸处，安装四个2英寸角撑，并标记后钻孔。使用螺丝将左侧短边永久固定到两个长边（前后面板）上。两个长边之间的内侧距离应为12英寸，而非11-1/2英寸。
4. 保持角夹就位并对准右侧门的位置，在相应位置标记并钻孔以安装四个磁性扣，用于固定右侧可拆卸门。在门上安装一个旋钮。门的顶部卡在顶盖下方（图1A，B）。
5. 为制作带网的可拆卸顶盖，将长条方形木条切割为两组，分别为26英寸和12-3/4英寸。将这四段木条胶合并钉接，使其能够环绕箱体安装——框架的内径应略大于箱体的外径，因为筛网将被固定在此框架上。
6. 将筛网裁剪至略小于14英寸×26英寸。确保筛网不超出框架边缘，以避免产生锐利边缘。需协助将筛网在框架上拉紧。用夹具将网和框架固定（图1C），并使用合适钉书钉的钉枪将筛网牢固地固定在框架上。
7. 再切割两组较短的方形木条（21英寸和9英寸），并使用螺丝通过这四段较短的方形木条将筛网紧密夹紧在框架周围（图1C，D）。

2. 制作接种室

1. 从合适的商店购买透明亚克力板和五金件。在盒子前侧的亚克力板上切割出一个 7 in × 20 in 的开口窗，如图所示 图2C.
2. 使用8个角夹，按照图示将左侧、右侧、前侧（带窗口）和后侧亚克力板组装成一个箱体 图 2A确保培养室的内径尺寸与顶板的尺寸相同。
   注意：右侧部分仅用于支撑，不会连接到前侧或后侧板上。它比其他板件特意短½英寸。该右侧部分将变为一个 "吸取" "瓣" 由直角固定件固定的门 底部有铰链，顶部有两个磁性扣，如图所示 图2C，D.
3. 使用角撑板将面板固定在一起（图2B,C）。固定支架位置，用记号笔标记，冲中心孔，然后钻孔。
   注意：钻有机玻璃与钻其他材料不同，切勿用力过猛，否则钻头对面的孔边缘可能会开裂。请使用铆钉或螺丝固定，但不要过度拧紧螺丝，否则有机玻璃可能随时间推移而开裂。
4. 将外壳翻转至背面，取下四个角上的夹具，将顶板就位。标记并钻孔。
5. 安装由¾英寸角撑制成的直角铰链，使用尼龙锁紧螺母作为铰链轴。不要拧紧，需留出间隙，以便门可在该铰链上旋转。
6. 标记、冲孔、钻孔，并使用 #6-32x3/4 螺钉安装两个磁性门吸" 盘头螺钉。然后使用 #6-32x3/8 螺钉安装扣板" 平头螺钉，参见 图 2C,D.

3. 在育苗盘中接种植物

1. 准备新鲜的白粉菌孢子作为接种物（例如， 拟南芥 白粉病 Golovinomyces cichoracearum UCSC1）。培养纯净 拟南芥 免疫缺陷 pad4-1 突变植株 ¹¹ 在生长室中（22 °C，相对湿度65%，培养6-8周），接种一个或半板 pad4-1 植物以积累足够的新鲜白粉菌孢子（图3A).
2. 在标准的11英寸×21英寸×2.5英寸育苗盘中种植用于确定侵染表型的植株。
   注意： 拟南芥 在短日照条件（8小时光照，16小时黑暗；22 °C）下生长6至8周的植物适用于白粉菌感染试验。
3. 当接种后8-10天（dpi）的感病植株上获得新鲜的白粉病孢子时，将一盘用于感染测试的植株移入接种室内的接种箱中图1B，2C).
4. 剪取15-20根重度感染的 拟南芥 叶片（或4-6个感病莲座叶，具体数量取决于叶片/莲座叶大小及接种程度），如有冷凝水，需将叶片晾干。
5. 用一只手使用长镊子夹取1-2片叶片或一个莲座状叶丛，并将叶片倒置。然后，将双手伸入接种室的开口中，缓慢地将叶片或莲座状叶丛移至接种箱内固定在网架上的位置，同时用剪刀轻轻敲击镊子的手柄，使叶片脱落图3B）。重复此步骤，直至使用完所有叶片或莲座叶。
   注意：成熟的孢子会很容易从感病叶片的分生孢子梗上脱落。尽量使孢子均匀地散落在筛网上。
6. 使用一到两把精细的扇形搅拌刷，轻轻将孢子刷过筛网（图3C）。确保以不同方向对网筛的整个表面刷涂四次或以上，以使孢子最大程度地均匀分布在接种盒底部的植株上（图3D用刷子轻轻拍打筛网数次，以震落粘附在筛网上的孢子。
7. 让孢子沉降半分钟，然后将装有接种植株的育苗盘从接种箱中取出。用塑料罩盖住育苗盘，并将其置于生长室中（22 °C，65% 相对湿度）。可在接种后5天或8至12天进行病害表型分析。 ¹².

4. 使用较小的接种盒对植物进行接种

注意：当接种植物数量较少时，仍可使用标准接种箱。请确保将植物放置在箱体中央。在覆盖植物的网罩区域轻敲并刷下孢子，以保证所有植物均被接种，同时节约接种物。或者（更推荐的方法）可使用较小的接种箱（如下所述）。

1. 将纸板箱改装成接种箱。只需移除箱子的顶部和底部，必要时用胶带固定箱角以加固，并通过粘贴或订书钉在顶部安装适当大小的50 µm筛网（图 4A，B）。
2. 将装有植物的托盘移入接种室，再将较小的接种箱盖在托盘上，以覆盖植物。
3. 按照上述方法抖落并刷取孢子。

5. 在培养皿中接种离体叶片

注意：在以下情况下，可使用离体叶片在 MS-琼脂平板上进行接种：(i) 新鲜的白粉菌孢子数量非常有限；和/或 (ii) 需在保持植株洁净的同时，评估病害表型和/或感染细胞中蛋白质的亚细胞定位。

1. 制作一个仅比培养皿稍大的微型接种箱。
2. 准备½强度的Murashige和Skoog（MS）培养基琼脂（1.5%）平板。如需减少霉菌污染，可加入噻苯咪唑（40 mg/L）。将平板置于4 °C冰箱中保存，待用。
3. 从每株待测植物的叶柄基部切取一至两片完全展开的叶片。将离体叶片的叶柄以约30°的角度插入琼脂培养基中。
   注意：每个平板可容纳20–40片叶片，具体数量取决于叶片和所用平板的大小（图4C）。
4. 在接种箱内按照上述方法对叶片进行接种。将带盖的平板转移至生长培养箱中。
5. 切取一小段叶片，在特定时间点观察蛋白质的亚细胞定位。
6. 为评估侵染表型，于接种后第4或第5天将叶片转移至新的无菌MS琼脂平板上。在将叶片插入新鲜琼脂培养基前，需切除叶柄基部。于接种后第8或第9天评估病害表型。

结果

本文介绍了一种新的白粉病孢子接种方法，该方法易于制备、操作和调整。图1展示了标准接种箱的组装结构，重点说明了带有50 µm膜网的可拆卸盖子的构造。图2展示了接种室的组装方式。图3图示了使用该系统进行接种过程的关键步骤。图4展示了其他类型的接种箱，可用于接种整盘或少量植株，或接种在MS-琼脂培养基上的离体叶片。最后，图5提供了数据，以展示孢子分布或植株感染表型所反映的接种均匀性。

讨论

我们的网格盒接种方法相较于其他接种方法具有多项优势。首先，若操作得当，可实现孢子的均匀分布，如图5所示。其次，采用约50 µm的筛网，并通过轻轻摇动感病叶片使孢子脱落，可减少来源于供体植株的蓟马或其他植物病原昆虫对植株的侵染。第三，使用不同尺寸的接种盒在塑料接种室中对植株或离体叶片进行接种（两者均可通过喷洒75%乙醇轻松清洁），可更有效地利用接种物并减少交叉污染。我们发现，在整个接种过程中，几乎没有或仅有极少量真菌孢子从接种室中逸出。

高质量的接种箱是确保均匀接种的关键。我们发现，标准接种箱可用于拟南芥幼苗和成株（图1）、草莓幼苗、苦苣菜以及N. benthamiana（未展示）的接种。若植株高度超过5英寸，可进一步增加接种箱的高度，以确保网罩与下方植株之间有足够的距离（> 5 in），从而实现孢子的均匀分布。此外，塑料室的高度也可相应增加，以便在接种箱顶部操作时有充足的空间进行孢子振落和刷涂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48 µm 不锈钢格栅网筛；尺寸：24" X 48"	亚马逊	NA	用于制作接种箱的盖子
#6-32 x ¾" 机械螺钉、平垫圈和螺母	家得宝	NA	用于制作接种室
#6-32 镀锌尼龙锁紧螺母（4 件装）	家得宝	NA	用于制作接种室
#6-32x3/8” Phillips 平头机械螺钉、平垫圈和螺母	家得宝	NA	用于固定  磁性门扣板
#8-32x1/2" 机械螺钉、平垫圈和螺母	家得宝	NA	用于固定角撑和门铰链
0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜保护板；  大小：17 ½" ×20"	专业塑料	SACR.250CEF	用于制作接种室
0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜覆盖板材；尺寸：18" ×20"	专业塑料	SACR.250CEF	用于制作接种室
0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜遮蔽板；尺寸：18" X 30"	Professional Plastics	SACR.250CEF	用于制作接种室
0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜遮蔽板材；尺寸：20" X 29 ½ "	专业塑料	SACR.250CEF	用于制作接种室
1-5/8" 柜门磁性扣 白色	家得宝	型号 #P110-W	用于制作接种室
2" 镀锌钢角撑（8 件装）	家得宝	型号 #13611	用于制作接种箱 &和 室
3" 角夹	Harbor Freight Tools	货号 63653、1852、60589	用于制作接种室
3/4"  镀锌钢角撑（4 件装）	家得宝	型号 #13542	用于制作接种箱 &和室
4-7/8" 镀锌轻型门拉手	家得宝	型号 #15184	用于制作接种箱
细扇形搅拌刷	米歇尔商店	M10472846	用于接种
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" 木制方形棒材	家得宝	NA	用于制作接种箱的盖子
中密度纤维板（1/4英寸）" x 2' x 4'	家得宝	型号 1508104	用于制作接种箱
圆形玻璃盖玻片，直径500 µm 网格	ibidi USA Inc.	10816	用于确定  孢子密度