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方法文章

使用放射性标记的 L-[3H]-谷氨酸在啮齿类动物切除的海马急性横切片中测量谷氨酸摄取

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DOI：

10.3791/62292

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2021年10月2日

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

本文内容

摘要

本文介绍了一种使用组织切片机从大鼠和小鼠获取离体急性海马横切片的可靠且简便的方法。从切除的海马获得的切片可用于功能性的谷氨酸摄取分析，以研究谷氨酸能系统的稳态。

摘要

通过高亲和力的 Na+依赖性转运体将谷氨酸从细胞外间隙清除，对于维持大脑固有的连接机制正常运作和稳态至关重要。海马是调控高级认知功能的独特脑结构，也是多种神经系统疾病研究的重点对象。在啮齿类动物模型中研究生理与病理机制时，急性海马脑片（AHS）制备技术具有重要价值。AHS 的优势在于能够提供可靠的细胞功能信息，因为其保留了原有的细胞构筑和突触环路。尽管 AHS 制备在神经化学实验室中广泛应用，但文献中仍可见到一些方法学上的差异。鉴于不同的脑片制备方案可能影响所分析的海马区域，本方案提出了一种从切除的海马组织中获取横切 AHS 的标准化技术。该操作简便的方案适用于小鼠和大鼠的实验模型，可用于在不同遗传背景（例如转基因操作）或体内干预后（例如药理学处理或适用于临床疾病研究的啮齿类模型）对背侧、中间和腹侧海马区的神经化学动态进行多种离体研究。在从小鼠或大鼠脑中分离出海马组织后，沿隔颞轴制备厚度为 300 µm 的横切脑片。这些 AHS 包含海马的不同区域，并可用于独立的神经化学分析（例如：利用相应底物检测神经递质转运体）。由于海马富含兴奋性突触，且谷氨酸是大脑中最重要的神经递质，因此谷氨酸能系统成为体内观察现象的理想研究靶点。为此，本方案详细描述了使用 L-[3H]-谷氨酸在离体 AHS 中检测谷氨酸摄取的具体步骤。利用该方案研究海马功能，有助于更深入地理解谷氨酸代谢在神经保护或神经毒性机制中的作用。

引言

海马体是位于大脑半球内侧颞叶深处的一个脑结构，与高级认知功能密切相关，是中枢神经系统（CNS）中研究最为广泛的结构之一。海马体的功能与陈述性记忆和空间记忆密切相关，同时也在情绪行为以及下丘脑功能的调节中发挥重要作用1,2,3,4。自从确认该区域是记忆形成与存储关键部位以来，研究领域便开始深入探索海马体结构。因此，用于模拟与海马体功能相关的人类脑部疾病的动物模型，如阿尔茨海默病、癫痫、重度抑郁症和应激等，其应用持续增长。

在啮齿类动物中，海马体是一个弯曲的结构，从靠近内侧隔区的位置开始，延伸至腹侧颞皮层。沿其纵轴方向，海马体可分为三个不同区域，每个区域均与特定的神经环路相关1。上部为背侧/隔侧海马体，下部为腹侧/颞侧海马体，二者之间的区域则称为中间海马体。已有大量文献报道了各区域在细胞投射方面的差异，以及各自所参与的特定认知功能5,6。就其内部结构而言，海马体区域可根据功能区进行划分。阿蒙角（Cornu ammonis, CA）区分为CA1、CA2和CA3亚区，位于海马体上部，处于齿状回（DG）和下托（subiculum）的上方，而齿状回与下托是海马体最内侧的部分（图1）。这些区域中的突触会持续发生重组，在整个生命过程中表现出神经发生和可塑性过程3。已有大量研究表明，对海马体进行不同的实验性干预会导致认知功能障碍7。在评估生化与分子水平改变方面，利用急性脑切片的技术是深入理解海马体不同功能特征的有力工具。

由于其精确性和可重复性，许多研究神经传递相关现象（如酶活性、摄取或释放）的实验采用了利用组织切片机从切除的海马组织制备的横切面人工海马切片（AHS）8,9,10,11,12。这种切片技术结合摄取能力评估，适用于需要保持海马组织中转运体活性的复杂神经化学实验。为此，使用组织切片机更为理想，因其操作速度较振动切片机更快，能够及时获得适合实验使用的、具有足够精度的AHS。

大脑中的兴奋性神经传递由谷氨酸介导，谷氨酸是最丰富的神经递质，在海马中也是如此，海马在很大程度上依赖于谷氨酸信号传导13,14。这种神经递质在细胞外环境中的浓度受到严格调控。然而，在细胞内囊泡中，其浓度可高达 100 mM15。一旦释放到突触间隙，谷氨酸不会被代谢，必须被清除以避免兴奋性毒性，这种毒性通常由谷氨酸过载引发14,16。将毒性与正常信号传导区分开的唯一机制是依赖钠离子的转运，该过程主要通过胶质细胞质膜上的蛋白质活性实现14,17,18,19。这些转运蛋白 [GLAST (EAAT1) 和 GLT-1(EAAT2)] 严格调控细胞外谷氨酸水平，并可受到多种因素的调节，包括 DNA 转录、mRNA 剪接与降解、蛋白质合成与定位、氨基酸转运活性以及离子通道活性20,21,22,23。因此，其活性可通过放射性标记底物（如谷氨酸）的转运来测定。

使用放射性标记底物是量化转运蛋白活性的优选方法，因为它能够追踪跨细胞膜运输等动态机制。除了具有高灵敏度和特异性外，放射性示踪实验的优势还包括操作简便且成本较低，相较于质谱分析等竞争技术尤为突出24。此外，由于仅需使用少量示踪剂，不会改变底物的生理浓度，从而更真实地反映实际的代谢活性状态。

离体实验方法的可及性对于支持基础研究、鉴定新的分子靶点以及药物发现活动至关重要。鉴于谷氨酸摄取在谷氨酸系统稳态中的重要作用，以及海马中谷氨酸能突触的高度优势，本实验方案展示了一种快速且易于重复的方法，利用切除的海马组织制备的横切面急性脑片（AHS）来评估谷氨酸摄取活性。该检测方法采用放射性标记的L-[3H]-谷氨酸，可实现定量比较并清晰呈现结果，并可根据需要进行调整，适用于特定或定制底物，在广泛的反应 条件25下使用。

急性脑切片具有多种优势，已被用于支持药理学和遗传学操作下功能变化的研究26,27,28。其应用具有以下优点：（i）保留了神经化学功能及细胞间的相互作用；（ii）可进行多种药理学和遗传学干预，以研究神经元和胶质细胞功能相关的信号通路；（iii）能够精确控制细胞外环境；（iv）可良好地接近海马体的不同区域（如CA1、CA3或DG），这些区域根据切片方法的不同可在同一脑片中得以保留。鉴于不同的切片制备方案可能暴露不同的海马区域，本方案提出一种从切除的海马体获取横断面急性海马切片（AHS）的标准技术。该操作简便的方案可用于啮齿类动物模型，并可支持多种离体研究方法，用于探究不同遗传背景或体内干预后的神经化学动态变化29,30（图2）。

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方案

所有操作均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行，并经当地伦理委员会批准（项目批准号 # 33732/CEUA-UFRGS）。实验过程中尽一切努力减少动物的不适并减少所用动物数量。

1. 配制Hank's平衡盐溶液（HBSS）

  1. 在1 L烧杯中，加入约0.5 L无菌水或双蒸水，并在磁力搅拌器上开始剧烈搅拌。依次加入以下HBSS组分（单位为mM）：137 NaCl、0.63 Na2HPO4、 4.17 NaHCO3、5.36 KCl、0.44 KH2PO4、0.41 MgSO4、0.49 MgCl2、 5.55 D-葡萄糖（见表1）。
  2. 在加入1.26 mM CaCl2之前，先用NaOH或HCl将pH调节至7.4，以避免沉淀产生。该盐应极缓慢地加入，并持续搅拌。最后用无菌水或双蒸水定容至1 L。该缓冲液将用于实验过程中清洗组织以及维持AHS的活性状态，可在维持生理pH和渗透压的同时提供无机离子。
    注：为避免沉淀，二价阳离子的添加应在pH滴定完成后进行。
  3. 将HBSS分为两份：一份置于37 °C水浴中保温，用于摄取实验过程；另一份保持冰浴低温（4 °C），用于实验前后清洗步骤。
    ​注：可预先配制各盐的母液，冻存备用，置于-20 °C冰箱中，并在数周内使用完毕。

2. 配制无钠 HBSS

  1. 在配制无钠HBSS的各组分之前，需预先配制另外两种溶液：Glucamine-HCl（137 mM）和Glucamine-HEPES（4.17 mM）。将NMDG碱基与HCl按等摩尔浓度混合，得到Glucamine-HCl溶液。同样地，使用2.0 M HEPES游离酸进行相同操作，得到NMDG-HEPES溶液（见表2）。
  2. 在0.5 L烧杯中加入约0.2 L无菌水或双蒸水，并在磁力搅拌器上剧烈搅拌。依次加入以下缓冲液组分（单位为mM）：137 Glucamine-HCl、4.17 Glucamine-HEPES、5.36 KCl、0.44 KH2PO4、1.26 MgSO4、0.41 MgCl2 和 5.55 D-葡萄糖（见表2）。
  3. 用KOH或HCl将pH值调节至7.4，并持续搅拌。在搅拌条件下极其缓慢地加入1.26 mM CaCl2。用无菌水或双蒸水将溶液体积定容至0.3 L。
    注意：该缓冲液用于测定非钠依赖性谷氨酸摄取，从而评估被动/非特异性谷氨酸摄取。实验后，将该参数从总谷氨酸摄取量中减去，以计算钠依赖性摄取量。
  4. 配制完成后，该缓冲液可储存于-20 °C冰箱中，供后续实验使用。NMDG溶液同样可按此方式保存。
  5. 实验过程中，务必始终保持无钠HBSS处于冰上低温状态。

3. 大鼠海马体解剖材料的准备

  1. 在实验开始前，将解剖区域布置在水槽旁边。将专用于大鼠的断头器（小鼠可使用锋利的剪刀）放置于水槽内，以保持实验台面清洁。
  2. 将用于脑组织取出和海马体分离的手术器械及其他材料按使用顺序排列，并尽量放置在使用位置附近（参见 材料表）。将培养皿放入一个 冰桶。同时，在附近准备一个塑料袋，用于处理动物尸体。
  3. 按推荐浓度配制两种HBSS溶液以供使用。无钠HBSS可在实验前冻存并解冻。
    1. 将含钠的HBSS按先前建议分为两份：一份加热至37 °C，另一份保持在4 °C用于解剖。解冻无钠HBSS并置于4 °C保存。
  4. 使用3%异氟烷诱导麻醉31实验开始前，务必确认角膜反射消失以及后肢无伤害性刺激反应。
    ​注意：应谨慎选择合适的麻醉药物，因其不应干扰任何待研究的参数。本方案推荐使用吸入性麻醉剂（例如异氟烷）。32.

4. 处死大鼠

  1. 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第8023号，1978年修订版）批准的方法实施安乐死。
  2. 使用断头器，在第一颈椎前方立即对大鼠进行断头操作。
  3. 将头部置于用冷生理盐水浸湿的干净纸巾上。使用S号手术剪彻底去除头皮及皮下肌肉，以充分暴露颅骨顶部的骨缝。操作时应谨慎开始，从枕骨附近起始，向鼻骨方向向后分离。
    ​注意：若实验动物为小鼠，应使用锋利的剪刀进行断头。务必在颅骨后方剪切，以避免带入多余组织。

5. 大鼠脑组织的取出

  1. 尽快进行脑组织取出操作。使用合适的骨剪，在大鼠颅骨的两个眼眶之间进行单次切割，使两个孔洞相连。随后，将S号手术剪的一侧尖端插入枕骨大孔，并向侧方沿颅骨进行一次切割。另一侧重复相同操作。
  2. 从枕骨板开始，沿顶骨的矢状缝，一直向前至额骨并向鼻部方向剪开颅骨骨板。务必牢固固定啮齿类动物的头部，并确保施加的压力方向远离脑组织，以避免损伤下方的组织。
    注意：必须将压力方向远离脑组织，以防止损伤下方组织。在幼年大鼠和小鼠中，可使用 小型手术剪直接剪开颅骨。
  3. 使用解剖刀或镊子，轻柔地从两侧半球移除枕骨和顶骨骨板。仔细检查是否有硬脑膜附着于颅骨并横跨脑表面。
  4. 立即使用细双头解剖刀取出脑组织，并将其完整地置于铺有滤纸的冰冷培养皿中。用塑料巴斯德吸管滴加冰冷的生理盐水润湿脑组织。随后立即按照下述方法开始分离两侧脑半球的海马体。
  5. 使用#11号手术刀片小心切除整个脑组织上的小脑。为完全分离大脑半球，需沿大脑半球间裂全程切开。使用塑料巴斯德吸管频繁滴加冰冷的HBSS缓冲液，以保持组织湿润并维持其活性。
  6. 分别取每个脑半球，使用虹膜剪将脑干和中脑从覆盖的皮层组织上剪除。使用手术剪小心剪开脑干/中脑/丘脑区域，同时用细毛刷向下推压并牵拉这些脑结构。在其下方即可观察到海马体（内侧表面）和侧脑室。此时，带有海马体的皮层组织应已与脑干完全分离。

6. 大鼠海马体的解剖

  1. 为切除海马体，将一侧脑半球置于冠状面，顶叶皮层朝下。此时可观察到海马体底部形成的浅层抛物线状白色伞纤维。
  2. 用非优势手非常小心地用细镊子固定脑组织，同时用优势手将另一把镊子置于海马体尾端下方。
  3. 固定内侧白质束，将镊子完全插入海马体下方，轻柔地将其与脑其余部分分离。在稍向前外侧移动第二把镊子的同时施加压力。若操作正确，海马体会落入滤纸上。
  4. 完成海马体解剖时，使用同一把镊子去除多余组织（通常包括残留的皮层、血管和白质）。对另一侧脑半球重复相同操作步骤。
  5. 两侧海马体切除后，将其转移至盛有置于冰桶上的HBSS的培养皿中，并转移至组织切片机刀片上方的切割区域。若研究需要分别分析背侧和腹侧区域，务必正确识别背侧与腹侧部位。
    注意：在解剖过程中始终区分海马体的腹侧和背侧部分非常重要。正确操作时，前端应朝上33。海马体此部分比后端略薄。

7. 切片制备

注意：在准备手术器械（第2阶段）的同时，应预先准备好组织切片机，以便从切除的海马体获取横切面切片。

  1. 使用组织切片机前，先设置好参数。切片机可切割厚度为 100 至 400 µm 的切片，建议设置为 300 µm。此外，推荐切割频率为每分钟 60–80 次，以在切片过程中维持组织完整性。
  2. 完成第 2 阶段所有操作后，当海马体已从脑组织中分离并放置于置于光滑聚丙烯支撑板上的、用冷生理盐水润湿的滤纸上时，应在进行切片前将每个海马体在滤纸上摆放整齐。
  3. 每次将一个海马体放置于组织切片机的圆形不锈钢切割台，使其垂直于切割刀片，以便沿隔-颞轴获得横切面海马切片。在启动切片过程前，用异丙醇轻轻润湿刀片，以防止组织黏附在刀片上，从而实现更顺畅、精确的切片。
  4. 开启设备后，切片臂上的刀片将上下往复运动，按设定厚度切割组织。该过程较快，通常在一分钟内即可完成切片。若多个海马体在切割台上保持适当间距，可同时进行多个样本的切片。
  5. 使用双头刮铲小心地从组织切片机中取出每个切好的样本，并将其浸入盛有冰冻生理盐水的培养皿中。用两把细毛刷轻轻夹住海马体，将切片逐一分开。操作过程中需注意保持切片完整性。
    1. 本实验需设置三组重复，因此从每个样本中选取 6 片切片：3 片用于总谷氨酸摄取检测，3 片用于非特异性摄取检测。
  6. 用毛刷将每一片切片从培养皿中轻轻转移至 24 孔板中，孔板内分别含有：(i) 1 mL HBSS 溶液；(ii) 1 mL 无钠 HBSS 溶液。根据相应的实验分组标记孔板，并确保每组至少设置三重复。
    注意：由于时间限制，若实验设置三重复，则每次最多只能处理 6 个动物/组（每个动物取一个海马体，进行 5 分钟摄取实验）。这意味着 L-[3H]-谷氨酸需每隔 15 秒加入一次，直至所有切片完成孵育。为终止反应，应按照相同时间间隔操作，以确保所有样本均经历 5 分钟的孵育期。

8. 谷氨酸摄取实验

  1. 在切片于相应缓冲液（HBSS 或无钠 HBSS）中稳定期间，用无菌水稀释 L-[3H]-谷氨酸，配制放射性溶液，终浓度为 4.5 μCi/mL，总体积应满足每片 20 μL 并留有余量，以避免批次处理结束时放射性溶液不足，因为需要据此量化每个切片初始所接受的每分钟衰变数（DPM）。
    注意： 由于 L-[3H]-谷氨酸摄取实验的总孵育时间（5 分钟）以及逐孔加样所需时间（每孔加入 20 µL 等分试样，即 0.33 μCi），建议每块 24 孔板配制 500 μL 浓度为 4.5 μCi/mL 的 L-[3H]-谷氨酸溶液，具体操作如下。L-[3H]-谷氨酸原液浓度通常为 1.0 mCi/mL，因此需进行 1:200 稀释后用于切片实验。
  2. 在 HBSS 中预孵育 15 分钟后，用巴斯德吸管完全移除缓冲液，并向切片中加入 280 μL 下列溶液之一：(i) 常规 HBSS（37 °C）用于总摄取；或 (ii) 无钠 HBSS（4 °C）用于非特异性摄取。需注意，总摄取实验必须在 37 °C 加热板上进行，而非特异性摄取则需在冰上操作。
  3. 准备一个计时器，在向第一个含切片的孔中加入 20 μL 放射性溶液时开始计时。根据板中切片数量等待 15–20 秒后，依次向下一个孔加入放射性溶液，直至所有含切片的孔加样完毕。分配 20 μL 溶液至各孔时，始终确保总孵育时间为 5 分钟。
  4. 当板中所有含切片的孔均完成加样后，等待第一个切片达到 5 分钟的 L-[3H]-谷氨酸孵育时间，随即立即将孵育液转移至适当的放射性废液瓶中。
  5. 移除孵育液后，立即快速加入 300 μL 冰冷的 HBSS，轻轻吸出。每个孔重复此洗涤步骤两次，共完成三次洗涤。务必使用无钠 HBSS 洗涤用于非特异性摄取测定的切片。完成板内所有切片的洗涤后，向每孔加入 300 μL 0.5 M NaOH，并用封口膜密封，4 °C 过夜保存。

9. 计数放射性L-[3H]-谷氨酸

  1. 次日，根据实验中切片的数量标记相应数量的离心管，并将每个孔中的内容物收集至各管中。确保组织切片完全溶解于裂解液中。如有必要，使用连接1 mL注射器的26号针头对样品进行匀浆处理。
  2. 向每管中加入1.2 mL闪烁液，使终体积约为1.5 mL，在涡旋振荡器上充分混匀所有样品，随后在闪烁计数仪中每管计数60秒。
    ​注意：确保检测参数设置为氚（tritium），结果以DPM表示。

10. 计算

  1. 将闪烁计数器测得的结果转换为截留在切片内的试剂所发出的放射活性，该值代表被摄取的谷氨酸量。用常规HBSS测得的结果减去非特异性摄取值。1 μCi 相当于 2.22×106 DPM。
  2. 根据已知的 μCi 数量以及 [3H]L-谷氨酸的原始浓度（通常在试剂瓶或数据表中提供），计算每一片组织捕获的 L-[3H]-谷氨酸量。

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结果

谷氨酸摄取是控制大脑神经传递的最重要机制之一。其中，海马体在谷氨酸信号传导中尤为关键，是连接记忆、认知和情绪的重要中枢。根据实验方案，采用成年雄性Wistar大鼠以获得代表性结果。使用3%异氟烷对动物进行麻醉，直至失去意识。解剖取出脑组织后，将海马体垂直置于切片台上进行切割。以每分钟60片的速度制备出厚度为300 µm的脑片，并收集至含有冰冻生理盐水的培养皿中。将脑片分别转移至24孔板的各个孔中，随后在无钠或正常HBSS缓冲液中，分别于4 °C或37 °C条件下孵育5分钟（除非另有说明），进行L-[3H]-谷氨酸摄取实验。

在4 °C的裂解液中孵育过夜后，将样品与闪烁液混合，并在闪烁计数器中计数60秒。结果以DPM表示，用常规HBSS测得的值减去无钠HBSS条件下测得的摄取值。1 DPM相当于0.000000000450或4.5 × 10-10居里（Ci）。通过已知L-[3H]-谷氨酸的比放射性，可建立DPM结果与每个样品所摄取L-[3H]-谷氨酸量之间的换算关系。

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讨论

本方案展示了一种利用海马脑片进行谷氨酸摄取评估的简便方法。结果表明，海马脑片（AHS）通常可摄取约60 fmol的放射性标记L-[3H]-谷氨酸；脑片厚度（蛋白含量）对L-[3H]-谷氨酸的摄取无显著影响（数据未显示）；当取自未经处理的成年雄性Wistar大鼠时，海马的背侧、中间和腹侧区域表现出相似的摄取能力（图3A）。此外，在时间进程实验中证实，5分钟孵育时间内，L-[3H]-谷氨酸转运系统尚未达到饱和（图3B）；而在摄取液中添加未标记的谷氨酸后，AHS对L-[3H]-谷氨酸的摄取显著减少，表现为DPM指数大幅下降（图3G）。同时发现，另一种放射性标记的兴奋性神经递质D-[3H]-天冬氨酸也可被类似地摄取，其摄取模式与L-[3H]-谷氨酸相似（图3F）。最后，通过将DH...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者获得巴西兴奋毒性与神经保护科学与技术国家研究所 [465671/2014-4]、CNPq [438500/2018-0] 和 [152189/2020-3]、FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5]、CAPES [88881.141186/2017-01]、CNPq [460172/2014-0]、PRONEX、FAPERGS/CNPq [16/2551-0000475-7] 以及 FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017] 的资金支持

UFOP - 项目类型："PROPP 19/2020 科研论文发表资助公告 - 2020"，项目编号：23109.000929/2020-88

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#11 手术刀片Swann-Morton525
100 mm 玻璃培养皿常见供应商
110 mm 直径 Whatman 滤纸Sigma AldrichWHA1001110
42.5 mm 直径 Whatman 滤纸Sigma AldrichWHA1001042
24 孔细胞培养板Falcon353047
烧杯常见供应商
组织切片机刀片Wilkinson3241
骨剪Erwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-天冬氨酸PerkinElmerNET581001MC11.3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-葡萄糖Sigma AldrichG8270
N-甲基-D-葡萄糖胺Sigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.超低水平 #425-020
虹膜剪Erwin Guth8,00,040
异氟烷Cristalia（São Paulo, 巴西）4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-谷氨酸PerkinElmerNET490005MC49.7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
塑料巴斯德吸管常见供应商
闪烁液PerkinElmer1200.437（1 × 5 升）Optiphase HiSafe 3
小型手术剪Erwin Guth8,00,040
小型镊子Erwin Guth6,00,131
切片机备用切片盘常见供应商
标准剪刀Erwin Guth8,00,010
细毛刷（0 号或 2 号）常见供应商
双头薄型刮勺Erwin Guth470.260E
组织切片机Ted Pella, Inc.10180

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