方法文章

急性小鼠胰腺组织切片中钙动力学的共聚焦激光扫描显微成像

DOI：

10.3791/62293

⸱

2021年4月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了急性胰腺组织切片的制备方法及其在共聚焦激光扫描显微镜中的应用，用于在长时间内以高时空分辨率同时研究大量活细胞中的钙动力学。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

急性小鼠胰腺组织切片是一种独特的原位制备方法，能够保持细胞间通讯和组织结构的完整性，相较于典型的体外研究中所描述的分离胰岛、腺泡、导管或分散细胞，其制备过程引起的变化显著更少。通过将急性胰腺组织切片与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）中的活细胞钙成像技术相结合，可同时在大量内分泌和外分泌细胞中以单细胞甚至亚细胞分辨率研究钙信号。该方法具有高灵敏度，能够检测到细微变化，可用于研究细胞间的钙波传播、功能连接性，以及细胞生理反应对其在胰岛内定位及与其他细胞旁分泌关系的依赖性。最后，从动物福利的角度来看，同时记录大量细胞信号可减少实验所需的动物数量，有助于实现“3R”原则——即替代（replacement）、减少（reduction）和优化（refinement）。

引言

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哺乳动物的胰腺是一个大型的外分泌和内分泌腺体。外分泌部分占胰腺总体积的96-99%，由腺泡和导管组成。内分泌部分则由大量胰岛（即朗格汉斯岛）构成，占胰腺总体积的剩余1-4%1。外分泌部分分泌主要的消化酶，用于分解食物中的富能多聚物，同时还分泌富含碳酸氢盐的液体，与其他胃肠道分泌物共同作用，为酶的活性提供适宜环境。内分泌部分分泌激素，调节餐后富能营养物质的分布与储存，以及两餐之间的释放。尽管出生时外分泌组织相对不发达，而内分泌组织相对成熟，但在断奶后，前者会迅速超过后者2,3,4。早期对胰腺功能的研究标志着现代生理学的诞生，该领域每一次重要的方法学进步都伴随着重大的科学突破5。由于胰腺结构复杂，对其进行研究在技术上具有挑战性；然而，鉴于胰腺癌、胰腺炎和糖尿病等疾病对公共健康构成重大威胁，且亟需新的治疗策略，这一研究领域也具有极强的推动力。

分离的胰岛6、腺泡7,8和导管片段已被开发并作为金标准方法使用数十年，因其相较于细胞系以及原代分散的内分泌细胞、腺泡细胞和导管细胞具有优势9,10。尽管分离的细胞群体功能显著改善，但这些方法仍涉及显著的机械和酶消化应激，使细胞脱离周围组织，因而缺乏旁分泌相互作用和机械支持，更重要的是，会引发正常生理状态的显著改变11,12,13。急性小鼠胰腺组织切片于2001年被开发出来，旨在建立一种类似于脑、垂体和肾上腺切片的实验平台，以保留细胞间接触、旁分泌相互作用、间充质及组织结构，同时克服当时胰岛研究金标准方法——分离胰岛——的一些最重要缺陷12,14。这些缺陷包括最外层结构的损伤、胰岛核心区域难以接近，以及需要进行培养，而培养可能对细胞身份和生理状态产生重要影响12,15。此外，组织切片方法使得在胰岛结构严重紊乱、无法通过传统方法分离胰岛或胰岛得率极低的动物模型上开展研究成为可能16,17,18,19,20,21。

此外，由于组织切片能够更全面地观察整个组织，并且适用于研究区域差异，因此在研究糖尿病和胰腺炎发展过程中的形态学变化时尤为适用。重要的是，尽管早期研究主要关注内分泌部分，但组织切片方法本身也能够用于研究外分泌成分9,22,23。在其被提出后的第一个十年中，该方法被用于对β14,24,25,26,27,28,29细胞和α30,31细胞进行电生理学研究，以及对胰腺的形态和功能成熟过程进行分析2,3。十年后的2013年，该方法成功应用于通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对胰岛细胞进行活细胞钙成像，以表征其对葡萄糖的响应32、功能连接模式33，并通过结合荧光钙染料与膜电位染料来研究膜电位与细胞内钙之间的关系34。同年晚些时候，该方法还被用于评估腺泡细胞中的钙 动态变化22,35。在随后的几年中，胰腺组织切片已被应用于多项不同研究，并成功拓展至猪和人组织9,36,37,38,39,40,41。然而总体而言，小鼠胰腺组织切片（尤其是胰岛内）的钙成像研究目前仍主要由该研究团队完成。造成这一现状的主要原因之一，可能在于组织切片制备技术难度较高、需要配备共聚焦显微镜，以及数据分析相对复杂。本文的主要目的是使这一强大方法能够被更多潜在使用者所掌握和应用。

目前已有一些出色的方法学文章，详细论述了组织切片的制备以及利用切片进行结构和分泌研究的方法，但这些文章并未涉及共聚焦钙成像9,42,43。因此，本文重点介绍切片制备过程中的一些额外技巧与注意事项、成功染料负载、图像采集的关键步骤，以及基本钙信号数据分析的主要流程。因此，本研究应被视为对上述方法的补充，而非替代。同样，小鼠胰腺组织切片中的钙成像应被视为一种用于回答特定科学问题的实验手段，因而与其他胰腺生理学中的钙成像方法（如分离的导管或腺泡、分离的胰岛、类器官、移植至眼前房的胰岛以及在体记录）互为补充，而非绝对替代11,44,45,46,47,48。小鼠胰腺组织切片钙成像的潜力，或许最能通过近期在胰岛间质细胞（如周细胞49和巨噬细胞50）以及导管细胞23中成功记录到的钙动力学研究得以体现。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：所有实验均严格遵循机构关于实验动物护理和使用的指导方针进行。本方案已获得斯洛文尼亚共和国食品安全、兽医和植物保护管理局批准（许可证编号：34401-35-2018/2）。

1. 胰腺组织切片的制备

注意：使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行钙成像实验时，急性小鼠胰腺组织切片的制备需要多种仪器、不同溶液，并需按一系列关键步骤操作，这些步骤在图1中以示意图形式展示，并在下文详细描述。

胰腺研究流程图；注射、提取、切片、钙成像、记录、染料检测、分析。
图1：实验流程图。 胰腺组织切片制备全过程的示意图，起始于将琼脂糖注入胆总管，随后取出胰腺并进行切片。制备好的切片可用于通过活/死细胞检测试剂盒评估组织活性，或用钙离子传感器染色。染色后即可用于成像。成像过程中获得的记录数据将用于后续数据分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 溶液的制备
    注意：所有溶液应提前配制，可在 4–8 °C 冰箱中保存长达一个月。用于组织切片的制备与储存，需要约 0.5 L 含 6 mM 葡萄糖的细胞外液（ECS）以及约 0.3 L 的 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液。若使用灌流系统进行一天的钙成像实验，灌流速率为 1–2 mL/min，则大约需要 0.5 L 的 ECS。
    1. 含 6 mM 葡萄糖的细胞外液
      1. 配制 1 L ECS，其中包含 125 mM NaCl、26 mM NaHCO3、6 mM 葡萄糖、6 mM 乳酸、3 mM 肌醇、2.5 mM KCl、2 mM 丙酮酸钠、2 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4 和 1 mM MgCl2，以及 0.5 mM 抗坏血酸。充分混匀直至所有成分完全溶解。取 50 μL ECS 加入 0.5 mL 微量离心管中，按照制造商说明将其置于渗透压计上，检测渗透压。
        注意：渗透压应在 300–320 mOsm 范围内。为刺激β细胞，应使用葡萄糖浓度更高的溶液。为确保切片和实验过程中生理 pH 值维持在 7.4，需在常压下持续用碳合气（即 95% O2 和 5% CO2 的混合气体）对 ECS 进行鼓泡。可通过将一段 5 mm 硅胶管一端连接至碳合气气源（如加压气瓶），另一端直接插入盛有 ECS 的瓶中，构建一个简单的鼓泡系统。
      2. 或者，可配制 10 倍浓缩储备液，其中包含 1250 mM NaCl、260 mM NaHCO3、30 mM 肌醇、25 mM KCl、20 mM 丙酮酸钠、12.5 mM NaH2PO4 和 5 mM 抗坏血酸。当需要含 6 mM 葡萄糖的 ECS 时，取 100 mL 储备液，加入 2 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgCl2、0.455 mL 13.2 M 乳酸和 1.08 g 葡萄糖，再用双蒸水定容至 1 L。如需其他葡萄糖浓度，可调整葡萄糖的用量。
    2. 含 6 mM 葡萄糖的 HEPES 缓冲液
      1. 配制 0.5 L HEPES 缓冲液（HBS），其中包含 150 mM NaCl、10 mM HEPES、6 mM 葡萄糖、5 mM KCl、2 mM CaCl2 和 1 mM MgCl2；用 1 M NaOH 滴定至 pH = 7.4。
        注意：若无碳合气，该缓冲液可用于替代 ECS 完成所有步骤。
    3. 琼脂糖（1.9% w/w）
      1. 将水浴预热至 40 °C。
      2. 在锥形瓶中加入 0.475 g 低熔点琼脂糖和 25 mL 含 6 mM 葡萄糖的 ECS，放入微波炉中以最大功率加热数秒，直至开始沸腾。取出锥形瓶并轻轻旋转数次，直至琼脂糖完全溶解。将装有液态琼脂糖的锥形瓶转移至预热至 40 °C 的水浴中，使其冷却至所需温度并保持液态直至注射使用。用铅制稳定环固定锥形瓶。
        注意：琼脂糖可提前配制并保存于冰箱中。使用前，在微波炉中加热至完全液化，再将锥形瓶转移至预热至 40 °C 的水浴中。琼脂糖最多可重复使用 5 次。若超过 5 次，琼脂糖将变得致密，更难注射。
  2. 胰腺注射琼脂糖
    注意：第 1.2 和 1.3 节描述了可用于多种实验目的的组织切片制备方法，包括钙成像、电生理学、免疫组织化学、分泌研究以及结构/微解剖学研究。
    1. 从步骤 1.1.3.2 中水浴内的锥形瓶中吸取液态琼脂糖，注入 5 mL 注射器，排除所有气泡，并安装 30 G 针头。用针帽保护针头，将装满琼脂糖的注射器放回水浴中，针头朝下，确保整个琼脂糖体积均浸没于水面以下。用铅制稳定环固定注射器，使其紧贴水浴壁。
      注意：操作时注意不要将琼脂糖推入针头，否则会迅速凝固并堵塞针头。若室温较低，或操作者经验不足，可将水浴温度升至 42 °C，以延长注射时间。
    2. 在冰桶中装满冰块，并将盛有 ECS 的瓶子放入其中。在常压和室温下，以 1.5 mL/min 的流速持续向 ECS 中鼓入碳合气，以确保充分氧合并维持 pH 值为 7.4。
    3. 通过给予高浓度 CO2 并随后进行颈椎脱位的方式处死小鼠。应尽一切努力减少动物痛苦。
    4. 在体视显微镜下进行开腹手术以暴露腹腔（图 2A）。轻轻将肠道翻至小鼠左侧（以小鼠解剖学视角为准），暴露胆总管。用镊子轻轻提起十二指肠部分，找到主十二指肠乳头（Vater 乳头）。使用止血钳在十二指肠乳头处夹闭胆总管（图 2B、C），防止琼脂糖从导管泄漏至十二指肠。
      注意：为防止琼脂糖泄漏至十二指肠及胃肠道上下段，应将止血钳放置得当，使其同时夹闭乳头近端和远端的十二指肠。建议使用弯头止血钳完成此操作。
    5. 使用小型锐利镊子伸至胆总管下方，撕裂连接导管与胰腺组织的膜。为获得更好的视觉控制和更易注射，应尽可能清除导管周围的脂肪和结缔组织。
    6. 将导管垂直置于大型镊子上（图 2D），并将预先准备好的液态琼脂糖注入胆总管近端部分（图 2D）。由于琼脂糖黏稠，需用力挤压注射器。持续灌注直至胰腺呈现白色且轻微膨胀，或至少持续 20–30 秒。
      注意：这是切片制备中最关键的步骤。若胰腺导管树存在弯曲，可轻轻抬高或拉离胰腺以展平导管。不应根据注射器中注入的体积来判断何时停止注射，因为在注射点的回流以及向十二指肠的前向泄漏通常远大于实际进入胰腺导管树的体积。重要的是，成功的注射可能在注射器体积上几乎无明显变化。
    7. 移除注射器，缓慢将约 20 mL 0–4 °C 的冰冻 ECS（已鼓泡）从瓶中倒入胰腺表面，以冷却组织并使琼脂糖硬化。
    8. 使用镊子和锋利的剪刀小心取出胰腺。将取出的胰腺放入盛有约 40 mL 冰冻 ECS 的 100 mm 培养皿中，轻轻晃动以清洗组织。随后将胰腺转移至另一盛有约 40 mL 冰冻 ECS 的新鲜 100 mm 培养皿中。
    9. 从注射良好的胰腺区域（呈白色，图 3A）中，使用镊子和剪刀切取最多 6 块大小为 0.1–0.2 cm3 的组织块，并清除所有结缔组织和脂肪组织。
    10. 在 35 mm 无粘底培养皿中加入约 5 mL 40 °C 的液态琼脂糖，将组织块转移至其中，并立即将培养皿置于冰上，使其冷却并固化琼脂糖。
      ​注意：胰腺组织块在琼脂糖中的固定方式将决定其在切片过程中的切割方向。经验丰富的实验人员可在琼脂糖置于冰上后、尚未完全固化前的短暂时间内，精细调整组织块的位置。
    11. 待含组织块的琼脂糖完全固化后，将培养皿倒扣在平坦光滑的表面（如 100 mm 培养皿盖）上，用剃刀片的一半沿培养皿侧壁与琼脂糖之间的边缘轻轻切割，分离琼脂糖。再用剃刀片将每个含一块组织的琼脂糖切成独立的立方体，注意确保每块组织周围均被琼脂糖包裹。使用氰基丙烯酸酯胶水将琼脂糖块粘附于振动切片机的样品板上（图 3B）。

显示胆管解剖结构及导管插入的鼠类解剖示意图，标注了胆总管。
图 2：向胆总管注射琼脂糖。（A）打开腹腔，暴露腹膜腔内的器官。（B）图 A 中矩形框选区域的放大图。十二指肠上的白色斑点（箭头所示）表示法特壶腹。兰格汉斯胰岛由箭头标示。（C）使用弯头止血钳夹住法特壶腹，并轻微提起以暴露胆总管（箭头所示），并轻柔拉伸。（D）对胆总管进行插管，并使用5 mL注射器和30 G针头注入1.9%琼脂糖溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 切片
    1. 将振动切片机的切片室中加入约0.15 L冰冻ECS溶液，并持续通入碳氧混合气体（carbogen）。将切片室周围放置冰块，并向切片室中加入2块由含6 mM葡萄糖的ECS制成的冰块（每块约10 mL）。将切片用的刀片安装至振动切片机上，并将含有琼脂糖块的样品板拧紧固定至指定位置。
    2. 设置切片机以0.05至1 mm/s的速度和70 Hz的频率，将琼脂糖块切成厚度为140 µm、面积为20–100 mm2的切片。具体切片参数请参照仪器制造商的说明。
    3. 每次切片后立即暂停切片机，用细毛刷轻轻收集切片，并将其转移至盛有40 mL含6 mM葡萄糖的HEPES缓冲液的100 mm培养皿中，于室温下保存（图3C）。
      注意：切片可在室温下的HEPES缓冲液中保存至少12小时，缓冲液应每隔2小时更换一次。

脂肪组织注射过程；组织学分析；显微镜图像；组织切片方法。
图3：胰腺组织的制备与切片。（A）琼脂糖注射后提取的小鼠胰腺。左侧的白色组织表示注射充分的部分（十二指肠部），而右侧较红的部分显示注射不足的区域（脾部）。（B）将包埋在琼脂糖中的两块胰腺组织进行振动切片。（C）急性胰腺组织切片，箭头所示为朗格汉斯岛。比例尺 = 3000 µm。（D）光学显微镜下的急性胰腺组织切片，箭头指示朗格汉斯岛，星号表示胰管。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 使用LIVE/DEAD细胞活力/细胞毒性检测试剂盒对哺乳动物细胞进行活/死检测

注意：对于某些实验，可通过活/死细胞检测法检测切片中细胞的活力（图4），方法如下。

  1. 按照试剂盒说明书操作，解冻 LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒中的试剂，并在使用前新鲜配制钙黄绿素 AM 工作液。配制后的溶液需在一天内使用完毕。
  2. 在 15 mL 离心管中，加入 5 µL 的 4 mM 钙黄绿素 AM（组分 A）、20 µL 的 2 mM 碘化乙啶同二聚体-1（EthD-1，组分 B）以及 10 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），配制成终浓度约为 2 µM 钙黄绿素 AM 和 4 µM EthD-1 的工作液。充分涡旋混匀。
  3. 使用细毛刷轻轻将组织切片转移至含有新鲜 HEPES 缓冲液的 3 mL 培养皿中，以稀释血清酯酶活性。移除 HEPES 缓冲液后，加入 100–200 µL（必要时可增加体积）步骤 2.2 中配制的工作液覆盖组织切片。
  4. 将切片置于密闭培养皿中，在室温下孵育 30–45 分钟。根据制造商推荐的激发/发射滤光片条件对组织切片进行成像。

3. 钙离子染料负载

注意：在荧光染料的整个配制和加载过程中，以及在处理染色的组织切片时，均应避免染料暴露于光照下。可使用锡箔包裹含有钙离子荧光染料的离心管或培养皿。

  1. 染料配制
    1. 在15 mL螺口管中，将一管细胞通透性Ca2+指示染料（激发/发射波长495/523 nm；参见材料表）的内容物（50 µg）、7.5 µL二甲基亚砜（DMSO）和2.5 µL泊洛沙姆（20% DMSO溶液；材料表）溶解于6.667 mL含6 mM葡萄糖的HBS中。
      注意：该终溶液含有6 µM Ca2+指示染料、0.11% DMSO和0.037%泊洛沙姆。
    2. 用移液器在螺口管中反复吹吸溶液20秒；将管子浸入超声波清洗仪中30秒，并涡旋振荡30秒以促进溶解。将步骤3.1.1制备的Ca2+指示染料终溶液每份3.333 mL分装至5 mL培养皿中。
  2. 染料负载
    1. 使用细软毛画笔轻轻提起置于含HBS的60 mL培养皿中的已制备组织切片，转移至盛有染料溶液的5 mL培养皿中。每个培养皿中孵育最多10片组织切片。
    2. 将载有切片的培养皿置于设定为每分钟40转轨道振荡的室温轨道摇床上，于室温下在染料溶液中孵育50分钟，孵育过程中暴露于空气中，但需用锡箔覆盖培养皿以避光。
  3. 切片保存
    1. 使用精细柔软的画笔轻轻将染色后的组织切片从5 mL培养皿转移至盛有无染料HBS的60 mL培养皿中。每个培养皿最多保存20片切片。
      注意：此时可使用组织切片进行成像。组织切片可在数小时内保持Ca2+指示染料的荧光信号。通过将培养皿置于隔热容器中并周围放置冰块，可提高切片存活率和染料保留效果，尤其适用于染料负载切片的运输。此外，应每隔2小时更换一次HBS。

4. 钙成像

  1. 共聚焦显微镜的设置
    1. 根据研究目的选择合适的物镜放大倍数。若需同时观察整个胰岛、多个腺泡或较大的导管，可选用20倍或25倍物镜（数值孔径[NA]为0.77–1.00）；若研究细胞内动态过程，则应选择更高放大倍数的物镜。
    2. 选择适合时间序列成像的采集模式（例如时间序列，xyt或类似模式），并将针孔大小设置为100–200 µm。
    3. 设置绿色荧光染料的光路：激发波长为488 nm，发射光收集范围为500–700 nm。建议优先选用量子效率较高的探测器（如磷化镓砷），而非光电倍增管探测器。
  2. 记录室与灌流系统的设置
    1. 将记录室安装在显微镜的温控载物台上，并连接灌流系统（可采用重力驱动或蠕动泵驱动系统，体积为1 mL）。将灌流液的入口和出口置于记录室相对两端，以避免灌流液在腔室内迂回流动，并将流入与流出速度设定为相同值（1–2 mL/min）。避免灌流液中液面高度漂移或产生液滴。
    2. 将灌流系统的温度控制设置为37 °C。先用非刺激性溶液启动灌流，并准备好刺激性溶液。通过电动阀门切换或手动更换供给灌流系统的溶液来实现溶液更换。
  3. 记录钙离子动态变化
    1. 将单个组织切片转移至记录室中。使用带有拉紧尼龙网的U形铂金重物固定组织切片，注意避免尼龙丝覆盖到目标观察结构上。
    2. 使用明场模式定位胰岛/腺泡/导管。进行实时成像以将目标结构调整至视野中央，并设置成像参数。通过调节激光功率、探测器增益以及线平均/像素合并等参数优化信噪比，在保证细胞可见的前提下尽量降低激光功率。
    3. 将成像焦平面调整至切面下方约15 µm处（图5），以避免记录到切面处可能受损的细胞信号。
    4. 开始图像采集。初始阶段将采样频率设为1–2 Hz以检测单个振荡事件；对于细胞内Ca2+（[Ca2+]IC）活动的记录，应使用具备快速线平均（8–20）能力的共振扫描器，以更高的采集速率（>10 Hz）进行。在连续点扫描之间留出一定间隔（例如总采样时间的30%），以防止光毒性。在时间序列采集前，先获取一幅高分辨率图像（例如1024 × 1024像素，线平均>50）（见第5节）。
      注：1–2 Hz的采样频率低于大多数细胞信号采集的奈奎斯特标准，因此信号波形默认情况下将处于欠采样状态。
    5. 如有可用，可参考成像软件中的在线图表，实时监测样本反应、过度照明、荧光漂白及机械漂移情况。若采集过程中漂白速率过高，应立即停止记录，降低激光功率并提高探测器增益以维持信噪比。若出现机械漂移，需检查管路/电缆与显微镜载物台之间的张力，以及记录室是否存在液体泄漏或体积变化。可选择在采集过程中手动校正漂移，但需注意其效果本质上有限。
      注：在接近阈值浓度时，内分泌细胞表现出高度异质性。为检测单个细胞激活与去激活延迟的时间范围，需要足够长的刺激持续时间。这对于准确识别强刺激方案后出现的“关闭”响应尤为重要。
    6. 利用钙成像技术功能性区分内分泌细胞与外分泌细胞（图6）。为记录激活与去激活过程中的瞬时活动，在施加刺激时不应中断图像采集。
    7. 实验结束后及时保存数据（建议启用自动保存功能）。关闭激光前应留出冷却时间，以免在关机过程中损坏激光器。

5. 数据分析

  1. 通过回放延时视频，对记录质量进行目视定性检查。检查细胞是否从视野或光学焦平面发生漂移。若在光学焦平面内出现漂移，请使用 ImageJ 中的漂移校正插件进行校正。
  2. 使用显微镜软件或第三方软件选择感兴趣区域（ROIs）。以高分辨率图像、最大投影或帧平均图像作为参考，用于选择 ROIs。回放延时成像序列，以观察在参考图像中不可见的响应细胞。调整 ROIs 的位置，确保每个 ROI 所选区域不与邻近细胞重叠，以避免 ROI 之间的信号串扰。
  3. 将时间序列数据导出为每帧的 ROI 平均值，并导出 ROI 坐标。
  4. 通过结合指数拟合与线性拟合的方法对时间序列数据进行漂白校正（图7A），如以下公式所示：
    信号处理分析图中的互相关函数公式。 (1)
    其中 x(t) 表示时间点 t 处的荧光信号；xcorr(t) 表示对应时间点的校正后信号；a、b 和 c 为拟合参数，通过最小二乘法计算 xcorr(t) 与 x(t) 之间的误差平方和得到。
  5. 分析响应的激活相与去激活相（图7B）。计算时间序列数据的一阶导数，并确定导数的峰值和谷值，分别对应激活和去激活时刻。或者，可手动选择时相性上升的起始点。保存并导出激活/去激活时间及对应的细胞坐标。
  6. 分析平台期（图7C）。通过设定原始数据的阈值，或对时间序列数据的一阶导数设定阈值，检测单个振荡事件。将单个振荡的起始和结束时间定义为达到其半幅值所对应的时间点。
    1. 计算每个细胞单个振荡的持续时间和频率。通过计算峰间间隔的倒数来获得频率（适用于规律性活动模式）。或者，将振荡次数除以记录的时间间隔（适用于不规则活动模式）。
    2. 计算活跃时间。将活跃时间表示为各振荡持续时间的总和，并将该值除以记录的时间间隔。或者，将单个振荡的频率与其持续时间相乘。
      注：将持续时间总和除以时间间隔可提供稳健的结果，但由于每个细胞仅获得一个数据点，统计分辨能力较低。将频率与持续时间相乘可实现振荡到振荡的时间分辨率。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将琼脂糖溶液注入胰管是制备胰腺组织切片最关键的步骤。成功的注射可通过胰腺组织变白来识别，如图3A左侧所示，而注射不完全的胰腺部分则如图3A右侧所示。胰岛（Langerhans islets）可通过肉眼或体视显微镜观察识别，这有助于切割胰腺的适当部位，用于后续包埋于琼脂糖块中（图3B）。在新鲜切割的小鼠胰腺组织切片中，胰岛在体视显微镜下可被清晰地识别为白色斑点（图3C），或在光学显微镜下表现为棕褐色结构（图3D），与周围的外分泌组织和间充质明显区分。胰腺组织切片在切割后至少12小时内可用于多种类型的实验。除在体视显微镜和光学显微镜下进行宏观形态学评估外，还可通过钙成像过程中细胞的功能性反应来评估胰腺组织切片的活性（图4）。

荧光显微镜图像，绿色-红色细胞分布，用于空间分析的z轴定位。
图4：组织切片内细胞的存活率。 细胞存活率通过活/死细胞染色法（Live/Dead assay）测定。活细胞被Calcein AM染色（显示为绿色），而死细胞被乙啶同源二聚体-1（ethidium homodimer-1）染色（显示为红色）。黄色线条表示底部和右侧所示Z层叠图像X-Y截面的位置。Z层叠图像的总深度为88 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

在钙成像实验中，荧光钙指示剂需要穿透数层细胞。图5A展示了细胞可渗透性Ca2+指示剂染料成功加载至胰腺组织切片的结果，其中可识别出单个胰岛细胞和腺泡细胞。相比之下，图5B-D中的切片并不理想，原因分别为染料渗透失败（图5B）、缺乏胰岛细胞（图5C）以及组织表面存在大量坏死区域（图5D）。此类切片可弃用，或检查是否存在被切割或染色更佳的其他胰岛（参见表1以获取故障排除建议），也可用于记录外分泌细胞的反应。

荧光显微镜图像；有机化合物定位；颜色比例尺；细胞分析。
图5：可用与不可用样本制备的示例。（A）胰腺组织切片成功制备的示例，其中朗格汉斯岛细胞染色清晰，导管细胞及周围腺泡组织结构完整。（B）染色效果较差的组织切片示例。（C）朗格汉斯岛存在结构中断的示例。（D）朗格汉斯岛中含有大量死亡细胞和碎片的示例。右侧的“亮过度、亮不足”查找表将0强度显示为绿色，饱和强度显示为蓝色。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

使用细胞通透性Ca2+指示剂染料进行钙成像的代表性结果如图6所示。图6A展示了一张胰腺组织切片的高分辨率图像，其中包含朗格汉斯胰岛、腺泡组织和胰管。为了更清晰地区分，图6A中胰腺组织切片的内分泌部、外分泌部和导管部分别在图6B中用不同颜色标出。通过使用适当的刺激，可对不同类型的胰岛细胞或胰岛细胞与非胰岛细胞进行功能性区分51。β细胞通常在葡萄糖方波刺激下表现出[Ca2+]IC的瞬时升高，随后是在持续平台期基础上的快速钙振荡（图6C，上图）。

由于所有β细胞通过功能性的合胞体相互耦合，这些振荡也通过细胞内钙离子浓度[Ca2+]IC波的传播在不同细胞间高度同步32,34,52,53,54（图7C）。周期为5–15分钟的较慢[Ca2+]IC振荡可能构成快速振荡的基础，甚至可能是主要的响应类型55,56。相同的简单实验方案可能揭示其他类型的响应，尤其是在胰岛边缘区域（图6C，下图）。由于这些细胞与β细胞不同步，且在低葡萄糖条件下即表现出更快、更不规则的振荡，或表现为活性下降，此类响应强烈提示为非β细胞21,32,57,58。然而，对其功能的明确鉴定需要更复杂的实验方案，包括额外的刺激步骤或其他替代方法，相关内容将在下文讨论。腺泡细胞和导管细胞的典型响应分别见于图6D和图6E。有关腺泡细胞和导管细胞的更多细节，请参阅相关文献22,23,35。

胰岛及腺泡细胞和导管细胞的显微镜图像；电活动图显示。
图6：不同类型胰腺细胞中钙动力学的代表性结果。（A）包含周围组织的胰岛高分辨率图像。比例尺 = 100 µm。（B）胰腺组织不同部分的界定，其中腺泡组织显示为黄色，胰岛显示为红色，导管树的一段显示为蓝色。比例尺 = 100 µm。（C）在12 mM葡萄糖刺激下β细胞和假定非β细胞中典型的钙动力学轨迹；非刺激条件使用3 mM葡萄糖。更特异性区分非β细胞的实验方案在讨论部分中描述。（D）腺泡细胞在25 nM乙酰胆碱刺激下的典型钙动力学轨迹。（E）导管细胞在1 mM鹅脱氧胆酸刺激下的典型钙动力学轨迹。请点击此处查看该图的放大版本。

钙成像成功完成后，数据首先被导出，并通过指数和线性拟合组合对光漂白进行校正，具体方法如方案部分所述。漂白校正前后的时间序列如图7A所示。随后，可对响应的激活相、去激活相以及平台相中的多个参数进行分析。刺激后[Ca2+]IC上升起始的延迟可通过图7B中的 delayA 表示，并可测量单个细胞间延迟的异质性（delayA1）。相同的参数（delayD 和 delayD1）可用于描述去激活相。在初始瞬时[Ca2+]IC升高之后，胰岛中大多数胰腺β细胞的平台相表现为相对规律的高频[Ca2+]IC振荡。该平台相可通过分析经典的功能参数来描述。[Ca2+]IC振荡的持续时间、频率以及活跃时间百分比的示意图如图7C所示。在采集速率高于10 Hz的钙成像中，还可清晰识别出在胰岛中反复传播的钙波（图7C）。

电生理学图谱；显示神经元活动中的刺激反应和延迟模式的图表。
图 7：时间序列数据分析。（A）对光漂白的时间序列数据进行校正。（B）分析在12 mM葡萄糖刺激后激活的延迟时间，以及刺激停止后去激活的延迟时间。刺激持续时间由图中浅灰色阴影条表示。（C）平台期多个参数的分析：I）在半峰高处确定的振荡持续时间，II）通过振荡间间隔确定的振荡频率，III）振荡频率与持续时间的乘积所表示的活跃时间。I-IV）在跨越朗格汉斯胰岛传播的任一振荡波中，各细胞达到振荡半峰高所需时间的延迟（Δt）所确定的振荡间延迟。请点击此处查看该图的放大版本。

表1. 请点击此处下载此表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胰腺组织切片法是一种快速的实验方法，可在更保守的原位制备条件下研究胰腺内分泌部和外分泌部的形态学与生理学特性。许多优势已在引言部分指出。值得强调的是，通常情况下（不仅限于钙成像实验），采用组织切片方法研究胰腺生理学可节省时间，因为分离后无需恢复期。尽管并非所有类型的实验以及来自不同物种的胰岛分离都绝对需要这一恢复期，但通常采用该步骤以提高纯度、恢复活性与功能，有时还用于收集多个供体的胰岛59,60,61,62,63,64。然而，在钙成像研究中，已发现β细胞的反应依赖于培养时间和培养条件，这是使用分离胰岛时应考虑的重要变异来源15,65。如果将来组织切片的长期培养成为广泛应用的选择，则同样需要考虑这一问题22,36。组织切片法还具有高产量的优点，因此有可能减少动物使用数量，减轻动物痛苦，并提高统计效能。此外，由于可从单个动物制备多个切片，且切片可长期存活，因此将同一动物甚至同一个胰岛同时用于实验组和对照组成为可能。

由于胰腺组织切片保留了原有的结构和细胞间通讯，并且适用于多种结构分析、电生理、成像方法以及激素分泌检测，因此该方法特别适用于研究依赖于单个细胞之间未受干扰相互作用的胰腺功能，例如对促分泌剂的敏感性、不同类型细胞之间的旁分泌和免疫相互作用、电活动模式、钙动力学特性以及多种激素的分泌。对于钙成像而言，使用组织切片的主要优势在于能够暴露胰岛核心区域，并有可能以高分辨率同时获取多种不同类型细胞的信号。根据实验需求和动物年龄，可调整切片厚度，也可对切片进行转染处理，或使用表达遗传编码报告分子的转基因动物获取切片。如下文将详细说明，后两种方法还可实现对非β细胞的特异性功能识别及其反应特征的表征31,66。此外，还可针对器官中解剖位置明确区域的胰岛进行研究，以探索其在反应性或疾病易感性方面的差异。尽管组织切片无需恢复性孵育阶段，但可方便地将其与不同的药理学试剂、脂肪酸、高浓度葡萄糖以及细胞因子共同孵育。

最重要的是，由于能够实现高分辨率，并且可达到单细胞甚至亚细胞水平的分辨率，因此在胰岛切片中进行共聚焦钙成像成为分析钙波、功能连接性以及胰岛不同区域细胞各自功能作用的最合适方法之一54,67。尽管该方法具有诸多优势，但组织切片技术仍存在重要局限性。首先，该方法仍会部分破坏胰岛及外分泌组织的结构，尤其是在切割表面；制备过程中需采取预防措施，例如保持低温、频繁更换溶液以及轻柔快速的操作，以避免额外的机械性损伤和内源性酶解损伤。其次，营养物质和分泌刺激物的递送模式仍不及体内途径，且组织制备样本脱离了系统的神经支配，无法实现器官间的反馈调节（例如胰岛与其靶组织之间的相互作用），这与体内方法形成对比。第三，切片的最大厚度受限于氧气供应、营养物质递送和pH调节，通常约为200 µm9。此外，切片制备和成像均需要大量训练，而对长时间序列及大量细胞的钙信号数据进行深入分析则需要专门知识，这些知识通常不在经典生理学家的技术范畴内，往往需要物理学家或数据科学家的协助。虽然该方法保留了同型和异型细胞间的相互作用，但这也可能因感兴趣区域内存在其他细胞的信号而使样本分析变得复杂。根据具体实验方案，其他细胞的激活可能导致被观察细胞受到间接的额外刺激或抑制。

只有通过去卷积方法、更复杂的刺激方案（包括阻断某些间接效应的物质）、使用特异性基因敲除动物，以及与采用更简化方法的其他研究结果进行仔细比较，才能最终解决这一问题。此外，如果需要进行分泌测量，应注意某些切片可能缺乏胰岛，且单个切片中内分泌组织的总质量通常较低。用于成像的急性胰腺组织切片制备涉及多个关键步骤，这些步骤将在下文各节中讨论，并总结于表1中，读者也可在该表中找到简短但重要的故障排除提示。首先，在配制琼脂糖溶液时，必须确保琼脂糖粉末完全溶解，否则未溶解的颗粒可能堵塞注射过程。应将均匀的琼脂糖溶液保持在37–45 °C，一方面防止因温度过低导致琼脂糖凝固，另一方面避免因温度过高造成组织损伤。使用后剩余的琼脂糖可储存于4 °C并重新加热，但反复加热可能导致水分蒸发而使溶液密度增加，最终使注射变得困难甚至无法进行。

制备过程中的下一个关键步骤是正确夹闭十二指肠大乳头。十二指肠上的一个白色斑点提示胆总管与十二指肠的连接处。夹闭位置过于靠近近端会导致胆总管的一些侧胰管分支受阻，从而无法向这些区域注射；而夹闭位置过于靠近远端则会导致琼脂糖溶液经阻力较小的路径直接漏入十二指肠。在插管胆总管之前，可小心清除周围脂肪组织，以更清晰地暴露导管，并在注射过程中实现更好的控制。若在清除周围组织时操作不够精确，可能导致导管穿孔。用于琼脂糖注射的针头直径选择也十分重要。在小鼠中，优选使用30 G针头；更细的针头（32或33 G）由于琼脂糖溶液黏度较高，操作更为费力，且更容易发生堵塞。然而，若与低浓度琼脂糖溶液联合使用，这些细针头在体型较小的小鼠品系或幼龄动物中可能非常有用。在出生后的最初几天，可选择性地将琼脂糖注射至肾包膜下而非导管内2。在小鼠中使用直径过大的针头极有可能损伤胆总管。即使使用合适直径的针头也可能发生此类损伤，此时可用镊子在注射过程中固定针头位置。对于导管较大的动物（如大鼠），可能只能采用较大直径的针头。若针头过细，无法形成紧密封闭以防止反向渗漏，则可在成功插入导管后，在针头周围结扎固定。

由于琼脂糖溶液具有较高的黏度，注射时需要稍加用力；一旦开始注射过程，就不应中断，否则低熔点琼脂糖溶液可能在注射完成前就在针头或胆管树的主要部分中凝固，导致组织渗透不良，并在切片过程中提供较差的支撑。导管插管应始终在左肝管与胆囊管汇合形成胆总管的位置进行。如果胆总管发生穿孔，应尝试在更靠近十二指肠的位置反复进行插管。当胰腺组织被琼脂糖溶液充分固定并从腹腔中取出后，应切取注射良好的小块组织。在将组织包埋于琼脂糖之前，必须彻底清除所有脂肪和结缔组织，因为这些残留物会增加切片难度。血管和导管残余物同样需要去除，除非它们是实验的关注重点；在此情况下，应确保将其放置在合适的位置，以获得所需的横截面。将组织包埋于琼脂糖时，需确保温度适宜（37 °C），并且组织完全被琼脂糖包围，因为在振动切片过程中产生的作用力可能导致胰腺组织从琼脂糖块中撕脱。

在将组织块放入琼脂糖之前，可将其短暂地放在滤纸上以快速干燥，这有助于防止此步骤中组织与琼脂糖之间接触不良。在琼脂糖凝固过程中，应将培养皿保持水平放置，并避免胰腺组织与培养皿底部接触。如果胰腺未完全灌注，切片过程将会困难。因此，建议降低切片速度以获得组织切片。为了在振动切片过程中尽量减少细胞损伤，应定期更换切片室中的细胞外液（ECS）以及由ECS制成的冰块；后者可降低切片过程中腺泡组织释放的胰酶活性。切片厚度也至关重要。对于钙动力学和电生理实验，通常制备140 µm厚的切片；但根据研究目的，切片厚度可在90 µm至200 µm之间调整。需注意的是，较厚的切片中氧气和营养物质的扩散会受限，但其包含的组织更多。此外，随着切片厚度增加，未被切断的胰岛比例可能随之升高。切片可在室温下置于定期更换的ECS中保存数小时，甚至可在适当的细胞培养基中培养数天；然而，这可能最终影响胰岛细胞的正常生理功能3,22。

配制染料溶液时，应确保所有组分充分混匀，并避免暴露于环境光线下。胰腺切片由多层细胞构成，钙染料的摄取仅限于最表层的几层细胞，这与先前在分离胰岛中所描述的情况一致。58,68和垂体切片69然而，与孤立的胰岛不同，后者周围的包膜和外层细胞会阻碍染料向深层渗透，而组织切片则允许染料进入胰岛整个横截面，从而能够同时测量来自胰岛各层的数百个细胞的钙动力学。荧光Ca2+ 指示剂是测量钙动态最常用的工具，结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），可实现高达数百赫兹的高时间分辨率记录。在选择最合适的荧光Ca2+ 指示剂，需考虑多种因素，包括指示剂形态，其会影响细胞加载方法、检测模式（定性或定量）以及解离常数（Kd) 需要位于 Ca2+ 感兴趣的浓度范围，并取决于 pH、温度和 Mg 的存在2+ 以及其他离子，以及蛋白质结合。由于细胞内 Ca2+ 信号通常是瞬时的，Ca2+ 结合速率常数也应予以考虑。用于测量[Ca2+]IC 胰腺细胞中的动力学研究，该研究团队主要使用本方案中所述的细胞通透性Ca2+指示剂染料（材料表）因为它是一种长波长指示剂，其发射波长位于细胞自发荧光通常较少干扰的光谱区域，且激发光能量较低，可减少对细胞的光损伤风险。由于该染料在低 Ca2+ 浓度，这有助于确定基线[Ca2+]IC 并提高细胞在刺激前的可见性。钙离子结合后2+，染料的荧光强度增加14倍，从而能够检测到[Ca2+]IC.

为了成功进行活细胞钙成像，需要考虑若干关键的硬件参数，具体如方案部分所述。在信号强度较低且光毒性风险较高的活细胞成像中，应优先选用数值孔径（NA）更高的物镜，以从样本中收集更多的光信号。若需以高时间分辨率记录钙动态变化，应使用共振扫描器而非线性检流计扫描器。除了选择合适的物镜外，使用高灵敏度探测器（例如所需激光功率更低的混合探测器）有助于避免光毒性和光漂白，这对于长时间的钙成像尤为重要。钙成像中的其他重要步骤还包括时间序列图像采集时的图像质量参数设置，其中最重要的是时间分辨率和空间分辨率。由于钙信号本身的动态特性决定了可接受的最低时间分辨率，因此采样频率应至少为预期信号频率的两倍才能检测到信号，甚至需达到十倍以上才能可靠地捕捉信号的波形特征。在急性胰腺组织切片中，可同时测量数百个细胞的钙动态变化，因此空间分辨率同样重要。提高像素数量或在实时采集过程中增加扫描线平均次数，均可提升空间分辨率。然而，由于空间分辨率与时间分辨率之间存在反比关系，因此需要在这两项设置之间进行权衡。

如果需要在胰腺内特定的细胞群体中进行钙成像，则必须使用一种能够功能上区分切片内不同细胞的刺激方法。高浓度葡萄糖可稳定且快速地激活β细胞，使其产生叠加在升高钙水平上的振荡模式，并且在胰岛内的所有细胞中高度同步32,58,70。β细胞是胰岛中最丰富的细胞类型，在小鼠中主要位于胰岛核心区域。相同的刺激方案会降低α细胞的簇状放电活动，有时甚至不会显著改变其放电模式30,32,58,70,71,72。为了在功能上区分α细胞，可使用低浓度（3 mM）葡萄糖、谷氨酸或肾上腺素来增加其放电频率或基础[Ca2+]IC水平21,72,73,74,75。α细胞约占胰岛细胞的10–20%，通常分布于胰岛外周1。δ细胞也位于胰岛外周，约占胰岛内分泌细胞总数的~5%，通常在6 mM葡萄糖条件下具有活性，并在葡萄糖刺激下表现出较基础水平或轻微升高的钙水平更为不规则的簇状放电活动增强1,32,71,76。在钙成像实验中，可使用胃饥饿素（ghrelin）特异性激活δ细胞21,77,78,79。然而，目前尚无明确的实验方案可用于PP细胞和ε细胞的功能性特异性鉴定。此外，25 nM乙酰胆碱可稳定激活腺泡细胞产生簇状放电活动35,80,81。另外，还可使用多种其他促分泌剂，如胆囊收缩素原（cerulein）、胆囊收缩素（cholecystokinin）和卡巴胆碱（carbamylcholine），以诱发腺泡细胞的钙反应22,40,82,83。

最后，1 mM 鹅脱氧胆酸可稳定地在组织切片的导管细胞中诱导出钙反应；血管紧张素II、ATP以及其他一些分泌刺激剂也可用于此目的11,23,84,85。当基于特定分泌刺激剂和抑制剂的特征性反应进行功能鉴定不足以明确细胞类型时，可采用基因标记动物31、转染细胞73或免疫细胞化学方法来鉴定不同类型的细胞9,22,71,86。在最近几年中，组织切片技术已成功应用于人体组织，为外分泌41和内分泌生理学9,36,37,39开辟了许多重要的研究途径。有趣的是，对人胰岛中钙动力学的详细评估一直极具挑战性，仍有待更深入的研究87。结合先进的共聚焦显微镜技术，胰腺组织切片方法已在小鼠中揭示了许多关于钙动力学的新发现，未来有望在人体组织研究中取得同样成果。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，本研究是在没有任何商业或财务利益的情况下进行的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究工作得到了斯洛文尼亚研究署（研究核心资助编号 P3-0396 和 I0-0029，以及研究项目编号 J3-9289、N3-0048 和 N3-0133）和奥地利科学基金 / 科学研究促进基金会（双边资助编号 I3562--B27 和 I4319--B30）的经费支持。我们感谢 Maruša Rošer、Maša Čater 和 Rudi Mlakar 提供出色的技术协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
分析天平 KERN ALJ 120-4KERN & SOHN GmbHALJ 160-4A
共聚焦显微镜 Leica TCS SP5 II 直立式系统Leica5100001578
共聚焦显微镜 Leica TCS SP5 AOBS 串联 II 系统Leica
软木垫 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL 离心管Merck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430790
Corning 圆形带盖冰桶，4 LFischer Scientific, Leicestershire, UK432124
双刃剃须刀片Personna, USA
Dumont #5 - 精细镊子FST, Germany11254-20
Eppendorf Safe-Lock 管 0.5 mLEppendorf0030 121.023
锥形瓶 200 mLIsoLab, Germany027.01.100
精细剪刀 - ToughCutFST, Germany14058-11
平板轨道摇床  IKA KS 260 basicIKAIdent. No.: 0002980200
玻璃实验瓶 1000 mLIsoLab, Germany091.01.901
Hartman 止血钳，弯型FST, Germany13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L（水浸物镜，20x，NA 1.0）Leica15507701
量筒 25 mLIsoLab, Germany015.01.025
显微操作器控制箱 SM-7，键盘 SM-7Luigs & Neumann 200-100 900 7311, 200-100 900 9050
微波炉Gorenje, SloveniaMO20MW
渗透压仪 Gonotec 010Gonotec, Berlin, GermanyOSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
画笔Faber-Castell, No.2任何细软圆头2号画笔，优选黑色
纸巾
灌流泵IsmatecISM 827Reglo Analog MS - 4/8
培养皿 100/20 mmSarstedt83.3902
培养皿 35/10 mmGreiner bio-one627102
培养皿 35 x 10 mm Nunclon DeltaThermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA153066非粘性，用于琼脂糖块
pH 计 inoLab pH Level 1WTW, Weilheim, GermanyE163694
移液器 1000 mLEppendorf3121 000.120
移液器 50 mLEppendorf3121 000.066
图钉 23 mmDeli, Ningbo, ChinaE0021
螺口管，15 mLSarstedt62.554.502
Semken 镊子FST, Germany11008-13
锥形瓶稳定环IsoLab, Germany027.11.048
体视显微镜 Nikon SMZ 745Nikon, Melville, NY USA
注射器 Injekt Solo 5 mLBraun, Melsungen, Germany4606051V
注射器针头 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2")Braun, Melsungen, Germany4656300
温度控制器Luigs & Neumann200-100 500 0150, 200-150-500-145切片微型室，温度控制器 TC 07
灌流系统管路IsmatecSC0310Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + 硅胶管 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
超声波清洗仪 Studio GT-7810AGlobaltronics
振动切片机 Leica VT 1000 SLeica, Nussloch, Germany14047235613
容量瓶 1000 mLIsoLab, Germany013.01.910
涡旋混合器 Neolab 7-2020Neolab 7-2020
水浴锅 Thermo Haake 开放式循环水浴Thermo Fisher ScientificZ527912
材料/试剂
二水合氯化钙 - CaCl2.2H2OSigma Aldrich, GermanyC5080-500G
D-(+)-葡萄糖Sigma Aldrich, GermanyG8270-1KG
二甲基亚砜Sigma AldrichD4540-100ML
DL-乳酸Sigma Aldrich, GermanyL1250-500ML
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液Merck KGaA, Darmstadt, GermanyD8662-500ML
含 95% O2 和 5% CO2 的气体混合物（常压）
胶水 Wekem sekundenkleber WK-110Wekem GmbH, Bergkamen, GermanyWK 110-020
HEPESSigma Aldrich, GermanyH3375-250G
L-(+)-抗坏血酸Sigma Aldrich, GermanyA9,290-2
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒，适用于哺乳动物细胞Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USAL3224
六水合氯化镁 - MgCl2.2H2OSigma Aldrich, GermanyM2670-500G
肌醇Sigma Aldrich, GermanyI5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AMInvitrogen (Thermo FisherScientific)O6807可穿透细胞的 Ca2+ 指示剂（激发/发射：495/523 nm）
Pluronic F-127（20% DMSO 溶液）Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)P3000MP泊洛沙默：非离子三嵌段共聚物
氯化钾 - KClSigma Aldrich, Germany31248
SeaPlaque GTG 琼脂糖Lonza, Rockland, USA50111
碳酸氢钠 - NaHCO3Honeywell, Germany31437-500G
氯化钠 - NaClHoneywell, Germany31434-1KG
氢氧化钠 - NaOHSigma Aldrich, Germany30620
磷酸二氢钠 - NaH2PO4Sigma Aldrich, GermanyS0751-500G
丙酮酸钠Sigma Aldrich, Germany15990-100G
软件
FIJIFIJI 是一个开源项目
LASAFLeica microsystems, Inc.
MatlabMathworks
PythonPython Software FoundationPython 是一个开源项目

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