人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR Cas技术对原代人T细胞进行基因编辑以修饰CAR-T细胞的实验方案。

摘要

利用嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的过继性细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中已显示出显著的临床疗效，目前正被用于多种实体瘤的研究。CAR-T细胞的制备是通过从患者血液中分离T细胞，并对其进行基因改造，使其表达一种合成的免疫受体，从而引导T细胞识别并清除靶向肿瘤细胞。对CAR-T细胞进行基因编辑有望提高现有CAR-T细胞治疗的安全性，并进一步增强其治疗效果。本文描述了人源CRISPR编辑的靶向CD19的CAR-T细胞的活化、扩增及表征方法。该方法包括CAR慢病毒载体的转导，以及利用单导向RNA（sgRNA）和Cas9核酸酶靶向T细胞中特定目的基因。本方案所述方法可广泛适用于其他CAR结构及除本研究使用的基因之外的靶基因。此外，本方案还讨论了gRNA设计、先导gRNA筛选以及靶基因敲除验证的策略，以可重复地实现高效、多重的CRISPR-Cas9技术对临床级人T细胞的基因工程改造。

引言

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法彻底改变了过继性细胞治疗和癌症免疫治疗领域。CAR-T细胞是经过基因工程改造的T细胞，可表达一种合成的免疫受体，该受体将抗原特异性的单链抗体片段与来源于TCRzeta链的信号传导结构域以及T细胞活化和共刺激所必需且充分的共刺激结构域相结合^1,2,3,4。CAR-T细胞的制备始于提取患者自身的T细胞，随后通过体外病毒转导将CAR模块导入，并利用作为人工抗原呈递细胞的磁珠扩增CAR-T细胞产品⁵。扩增后的CAR-T细胞被重新回输至患者体内，可在体内定植，清除靶向肿瘤细胞，甚至在输注后持续存在多年^6,7,8。尽管CAR-T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中取得了显著的应答率，但其在实体瘤中的临床成功仍面临多种因素的挑战，包括T细胞浸润不足⁹、免疫抑制性肿瘤微环境¹⁰、抗原覆盖范围与特异性，以及CAR-T细胞功能障碍

方案

人T细胞由宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室提供，该实验室遵循优良实验室规范原则，具有标准化的样本接收、处理、冻存和分析标准操作程序和/或方案，符合MIATA及宾夕法尼亚大学伦理指南的要求。

1. 慢病毒载体的制备

注意：通过将包装构建体（Rev、gag/pol/RRE、VSVg 和转移质粒）分到四个独立的质粒中，病毒产物已被制成复制缺陷型，从而大大降低了发生重组事件产生具有复制能力病毒的可能性。

1. 转染前一天准备HEK293T细胞。在T150培养容器中接种约6 × 10⁶个细胞，加入30 mL标准培养基（称为R10：RPMI 1640培养基，添加10%胎牛血清、10 mM HEPES、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺），于37 °C孵育过夜。18–24小时后，细胞应达到60–70%融合度，且状态良好（呈现树突状突起，并在培养瓶中均匀分布）。若细胞状态良好，则进行步骤1.2。
2. 配制转染混合液，其中包含脂质体转染试剂（96 µL）、pTRP gag/pol（批号RR13SEP19A）（18 µg）、pTRP RSV-Rev（批号RR13SEP19B-3）（18 µg）、pTRP VSVG（批号RR13SEP19C）（7 µg）包装质粒以及15 µg表达质粒（CD19bbz scFv克隆至pTRPE中）。
   1. 每项转染反应中，准备一个含....

结果

本文介绍一种对T细胞进行基因工程改造的实验方案，可用于生成自体和同种异体的CAR-T细胞，以及TCR重定向T细胞。

图1详细描述了制造CRISPR编辑T细胞过程中所涉及的各个阶段。该过程首先针对目标基因设计sgRNA。一旦sgRNA被设计并合成，便将其与相应的Cas蛋白形成RNP复合物。T细胞从健康供体或患者单采血液中分离获得，随后通过电穿孔或核转染将RNP复合物递送至细胞内。编辑完成后，T细胞被激活，并转导携带CAR或TCR结构编码的慢病毒载体。激活后，T细胞在体外培养中扩增，并冷冻保存以供后续研究使用。实验室所遵循的详细实验方案见图2。在扩增过程中，全程监测细胞群体倍增情况和培养体积变化，图2B和C分别展示了模拟处理组和编辑后CAR-T细胞的示例。图2B、C显示，目标基因的敲除在扩增期间未引起细胞增殖和激活的.......

讨论

本文介绍了利用CRISPR Cas9技术对CAR-T细胞进行基因编辑并制备产品以进一步测试其功能和有效性的方法。上述方案已针对在原代人T细胞中进行CRISPR基因编辑并同时通过嵌合抗原受体对T细胞进行工程化改造进行了优化。该方案可实现高效的基因敲除，并显著减少供体间差异。利用CRISPR进行基因修饰可通过消除抑制T细胞功能的受体以及制备异体CAR-T细胞，从而提高CAR-T细胞的有效性和安全性。

对于小规模扩增方案，以每组10⁶个细胞起始，在健康正常供体中可获得约5×10⁸个CAR-T细胞，平均经历6次群体倍增。然而，这一结果可能因目的基因是否影响T细胞的活化、转导和增殖而有所差异。五亿个细胞足以用于验证基因敲除效率、体外实验和体内实验。该方案存在多种变体，其中CRISPR编辑可在活化及CAR转导之前或之后进行。Ren等人描述了一种变体，即细胞在磁珠刺激及CAR转导后再进行编辑¹⁵。在磁珠刺激前进行CRISPR编辑的优势在于，由于T细胞尚未增殖，需要编辑的细胞数量较少，从而使操作更节省时间且.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4D-Nucleofactor 核心单元	Lonza	AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-单元	Lonza	AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix	ThermoFisher	12344040
Beckman Optima XPN 超速离心机	Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 抗人 CD3 抗体	Biolegend	317322	克隆 OKT3
BV711 抗人 PD1	Biolegend		克隆 EH12.2H7
Cas9 电穿孔增强剂	IDT	1075915
CD3/CD28 Dynabeads	ThermoFisher	40203D
CD4+ T 细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	15062
CD8+ T 细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	15063
Corning 0.45 微米真空滤器/瓶	Corning	430768
Corning T150 细胞培养瓶	Millipore Sigma	CLS430825
DMSO	Millipore Sigma	D2650
DNAeasy 血液与组织试剂盒	Qiagen	69504
DynaMag 磁力架	ThermoFisher	12321D
Glutamax 补充剂	ThermoFisher	35050061
HEK293T 细胞	ATCC	CRL-3216
HEPES (1 M)	ThermoFisher	15630080
huIL-15	PeproTech	200-15
huIL-7	PeproTech	200-07
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668019
Nucleospin 凝胶与 PCR 纯化试剂盒	Takara	740609.25
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062
P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L	Lonza	V4XP-3024
青霉素-链霉素-谷氨酰胺	ThermoFisher	10378016
pTRPE 表达质粒	in house
兔抗小鼠 FMC63 scFv 单克隆抗体 (R19M), PE	CytoArt	200105
RPMI1640	ThermoFisher	12633012
sgRNA	IDT
Spy Fi Cas9	Aldevron	9214
超速离心管	Beckman Coulter	326823
病毒包装混合物	in house
X-Vivo-15 培养基	Lonza	BE02-060F