本方案介绍了一种培养和处理源自成年小鼠后部味觉乳头分离的味觉干细胞的舌类器官的方法。
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本文内容
摘要
摘要
味觉由舌头上味蕾介导，味蕾由快速更新的味觉感受细胞（TRC）组成。这种持续的更新由局部前体细胞驱动，使得味觉功能容易受到多种医疗治疗的干扰，进而严重影响生活质量。因此，在药物治疗背景下研究这一过程，对于理解味觉前体细胞功能及TRC生成是否以及如何受到影响至关重要。鉴于人类味觉组织在伦理和可获得性方面的限制，通常采用味觉系统与人类相似的小鼠模型。与耗时、昂贵且难以进行高通量研究的in vivo方法相比，小鼠舌部类器官能够实现快速实验，具有更多重复样本并减少使用小鼠数量。本文改编了先前已发表的实验方案，提出一种标准化方法，用于从成年小鼠轮廓乳头（CVP）中分离的味觉前体细胞生成味觉类器官。CVP中的味觉前体细胞表达LGR5，可通过EGFP荧光激活细胞分选（FACS）从携带Lgr5EGFP-IRES-CreERT2等位基因的小鼠中分离获得。分选后的细胞接种于基于基质凝胶的三维培养系统中，培养12天。类器官在培养前6天通过增殖而扩增，随后进入分化阶段，在此期间生成全部三种味觉细胞类型以及非味觉上皮细胞。类器官可在第12天成熟后收获，或在生长过程中的任意时间点收获，用于RNA表达分析和免疫组织化学分析。标准化成年干细胞来源的舌类器官培养方法将提高实验可重复性，并推动舌类器官成为帮助味觉功能障碍患者治疗研究中强有力的药物筛选工具。
引言
在啮齿类动物中，舌部的味蕾位于舌前部的菌状乳头内，舌后部两侧的叶状乳头内，以及舌背侧后正中线处单个的轮廓乳头（CVP）内1。每个味蕾由50–100个寿命较短且快速更新的味觉感受细胞（TRC）组成，其中包括Ⅰ型类似胶质的支持细胞、感知甜味、苦味和鲜味的Ⅱ型细胞，以及感知酸味的Ⅲ型细胞2,3,4。在小鼠的CVP中，基底膜附近的LGR5+干细胞可产生所有类型的TRC以及非味觉上皮细胞5。在味觉谱系更新过程中，LGR5的子代细胞首先被确定为有丝分裂后的味觉前体细胞（Ⅳ型细胞），这些细胞进入味蕾后，能够分化为三种TRC中的任意一种6。由于TRC更新迅速，味觉系统容易受到放疗和某些药物治疗等医学干预手段的干扰7,8,9,10,11,
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方案
所有动物实验均在获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行，遵循《实验动物照护与使用指南》、《动物福利法》和《公共卫生服务政策》的要求，并经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。本方案中使用的 Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 小鼠来自杰克逊实验室，货号 008875。
注意：为确保本实验方案顺利且及时地进行，应在开始前完成以下步骤：将水浴锅预热至 37 °C，将离心机预冷至 4 °C，使用 10 mg/mL 的 Dispase、Collagenase 和 Elastase 储存液配制注射液和解离酶溶液（见材料表），从 -20 °C 冰箱中取出基质胶（48 孔板约需 750 µL），将试剂瓶浸入冰中至少 3–4 小时以缓慢融化，用未稀释的胎牛血清（FBS）预包被微量离心管，在室温下轻轻摇晃至少 30 分钟（组织收集用 2 个 2 mL 管，解离细胞用 2 个 1.5 mL 管，细胞分选后单细胞收集用 1 个 1.5 mL 管；使用前去除多余 FBS）。
1. CVP 上皮的分离
注意：为了获得足够用于完整48孔板的LGR5+细胞，需将三个Lgr5-EGFP CVP收集至同一管中并同时处理。重要的是，需在另一管中平行收获并处理至少一....
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结果
小鼠具有一个位于舌背侧的轮廓乳头（CVP），可从中分离出LGR5+干细胞（图1A，黑色框）。将酶溶液注射至CVP下方及周围区域（图1B），可引起上皮组织轻微肿胀并消化结缔组织。经过33分钟孵育后可达到充分消化效果，从而易于将CVP上皮与下方组织分离。在尝试剥离CVP上皮时，切口应距离CVP足够远，以确保沟槽结构不被破坏或损伤（图1C）。此操作还可使镊子能够夹持上皮组织而不损伤CVP。修剪CVP周围的上皮组织可去除非靶细胞，并通过减少操作组织量提高后续步骤的效率（图1D）。在将CVP上皮加入微量离心管前，必须确认两个沟槽结构（图1C，黑色箭头）仍存在；成功的CVP上皮剥离应包含部分冯·艾布纳腺体及其导管（图1D
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讨论
本文报道了一种高效且易于重复的方法，用于培养、维持和处理源自成年小鼠味觉干细胞的舌部类器官。研究发现，使用8至20周龄Lgr5-EGFP小鼠的三个轮廓乳头（CVP）足以获得约10,000个GFP+细胞用于实验，可将这些细胞以每孔200个的密度接种于48孔板中，共接种50孔。通过向舌上皮注射新配制的Dispase II和I型胶原酶溶液，并进行33分钟孵育，可优化去除CVP沟槽上皮的操作。然而，孵育时间过短、酶液保存过久、不同批次或不同厂家的酶均可能导致沟槽去除不完全。相反，孵育时间过长则会引起组织过度消化，导致味觉组织完整性的丧失。剥离后，通过修剪掉CVP周围上皮进一步富集CVP沟槽。
在解离和收集过程中，所使用的所有微量离心管必须用胎牛血清（FBS）包被，以防止组织和细胞黏附于管壁，否则会显著降低分离细胞的回收率（数据未显示）。使用少量FBS包被，并在使用前去除管内多余液体，可最大限度减少对胰蛋白酶或其他酶可能产生的抑制作用。
已成功从未经过LGR5+细胞预先分选的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢科罗拉多大学安舒茨医学校区类器官与组织建模共享资源中心的 Peter Dempsey 博士和 Monica Brown，感谢他们提供 WNR 条件培养基以及富有价值的讨论。我们还感谢科罗拉多大学癌症中心细胞技术与流式细胞术共享资源中心，特别是 Dmitry Baturin，在细胞分选方面的专业技术支持。本研究由以下项目资助：NIH/NIDCD R01 DC012383、DC012383-S1、DC012383-S2 以及 NIH/NCI R21 CA236480（资助对象：LAB）；R21DC016131 和 R21DC016131-02S1（资助对象：DG）；以及 F32 DC015958（资助对象：EJG）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>抗体 | |||
| Alexa Fluor 546 驴抗山羊IgG | 分子探针 | A11056，RRID：AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 山羊抗兔 IgG | 分子探针 | A11010，RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 山羊抗豚鼠 IgG | Invitrogen | A11075，RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG | 分子探针 | A31573，RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠 IgG | 分子探针 | A21247，RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI（用于流式细胞术） | 赛默飞世尔科技 | 62247 | |
| DAPI（用于免疫组织化学） | Invitrogen | D3571，RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| 山羊抗CAR4 | R&D Systems | AF2414，RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| 豚鼠抗KRT13 | Acris 抗体 | BP5076，RRID:AB_979608 | 1:250 |
| 兔抗GUSTDUCIN多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395，RRID:AB_673678 | 1:250 |
| 兔抗 NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6，RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| 抗KRT8大鼠单克隆抗体 | DSHB | TROMA-IS，RRID: AB_531826 | 1:100 |
| <强>仪器设备 | |||
| 2D摇床 | Benchmark Scientific 公司 | BR2000 | |
| 3D旋转器 | Lab-Line 仪器 | 4630 | |
| 大数字计时器/秒表 | Fisher Scientific | S407992 | |
| 离心 | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 钢瓶 | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 水套式 CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 4110 | 184 升，抛光不锈钢 |
| Incucyte | 赛多利斯 | 模型：S3 | 科罗拉多大学安舒茨医学校区癌症中心细胞技术共享资源平台 |
| MoFlo XDP100 | Cytomation 公司 | 型号：S13211997 | 科罗拉多大学安舒茨医学校区盖茨中心流式细胞术核心实验室 |
| 轨道摇床 | 新不伦瑞克科学公司 | Excella E1 | |
| 实时荧光定量PCR系统 | 应用生物系统公司 | 4376600 | |
| 冷藏离心机 | Eppendorf | 5417R | |
| 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-1000 | |
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 热循环仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 580BR | |
| 涡旋混合 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| 水浴锅 | 精确度 | 51220073 | |
| <强>培养基 | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | 储备浓度 10 mM，终浓度 500 nM |
| 高级DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 补充剂 | Gibco | 17504044 | 储备液浓度50X，终浓度1X |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750-060 | 储存液浓度1000X，终浓度1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 储存液浓度100X，终浓度1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 储存液浓度100X，终浓度1X |
| 小鼠 EGF | Peprotech | 315-09-1MG | 储备浓度 500 µg/mL，终浓度为 50 ng/mL |
| 小鼠Noggin | Peprotech | 250-38 | 储备浓度 50 µg/mL，终浓度为 25 ng/mL |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | A9165 | 储备浓度 0.5 M，终浓度 1 mM |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636-100g | 储备浓度 1 M，终浓度 1 mM |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | 储存液浓度100X，终浓度1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 储备液浓度500X，终浓度1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | 储备浓度 10 mM，终浓度 0.4 µM |
| WRN 条件培养基 | 来自Dempsey实验室（AMC类器官与组织建模共享资源）。源自L-WRN（ATCC® CRL-3276™) 细胞 | ||
| Y27632 二盐酸盐 10 μg | APExBIO | A3008-10 | 储备浓度 10 mM，终浓度 10 µM |
| <强>其他 | |||
| 1 ml TB 注射器 | BD 注射器 | 309659 | |
| 2-巯基乙醇，纯度≥98% | Sigma | M3148-25ML | β-巯基乙醇 |
| 2.0 mL 微型离心管 | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48孔板 | 赛默飞世尔科技 | 150687 | |
| 5 3/4 英寸巴斯德吸管 | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma生命科学 | A9647-100G | |
| Buffer RLT 裂解缓冲液 | QIAGEN | 1015750 | |
| 细胞回收溶液 | 康宁 | 354253 | |
| 科汉-范纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| 产气荚膜梭菌胶原酶，I型 | Sigma生命科学 | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME，2 型，Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II（中性蛋白酶，II 型） | Sigma-Aldrich（罗氏） | 4942078001 | |
| 一次性过滤器 | 希森美康 | 04-0042-2316 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液，pH 7.4（1X）（Ca2+ && Mg2+ 无（游离） | Gibco | 10010-023 | |
| 杜尔贝科’含钙磷酸盐缓冲液2+ && Mg2+ | Sigma生命科学 | D8662-500ML | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA，0.5 M（pH 8.0） | Promega | V4231 | |
| 弹性蛋白酶 冻干粉 | 沃辛顿生物化学 | LS002292 | |
| 超细邦剪刀 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES 溶液 | Sigma生命科学 | H3537-100ML | |
| HyClone 胰蛋白酶 0.25% + EDTA | 赛默飞世尔科技 | 25200-056 | |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1706691 | |
| 灰陶土 | 萨金特艺术 | 22-4084 | |
| 针 | BD 注射器 | 305106 | |
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| 正常山羊血清 | 杰克逊免疫研究实验室 | 005-000-121 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 功率SYBR Green PCR Master Mix | 应用生物系统公司 | 4367659 | |
| RNeasy Micro试剂盒 | QIAGEN | 74004 | |
| 安全锁扣管 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| 氯化钠 | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| 无水磷酸氢二钠 | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| 磷酸二氢钠无水物 | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 手术剪 - 锐头 | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma生命科学 | T8787-100ML | |
| VWR 微型盖玻片 | VWR | 48366067 | 22x22毫米 |
参考文献
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L.
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