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用于VMXm光束线微晶样品制备的工作流程

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DOI：

10.3791/62306

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2021年6月17日

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1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council, Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute, Harwell Science and Innovation Campus

本文内容

摘要

数据的信噪比是进行微晶X射线衍射测量时最重要的考虑因素之一。VMXm光束线为此类实验提供了低噪声环境和微束条件。本文介绍了适用于VMXm及其他微聚焦大分子晶体学光束线的微晶样品制备、安装与冷却方法。

摘要

用于单晶低温晶体学的微晶（<10 µm）装样是一个非平凡的挑战。随着光束线光学系统、光束稳定性以及聚焦光斑尺寸从亚微米到微米范围的可调技术的发展，微晶的数据质量已有所提升，例如在Diamond Light Source的VMXm光束线上的改进1。未来数据质量的进一步提升将依赖于样品环境和样品制备技术的优化。微晶本身产生的衍射信号较弱，因此提高信噪比是获得高质量X射线衍射数据的关键，而信噪比的提升主要依赖于降低背景噪声。衍射实验中X射线背景噪声的主要来源包括：X射线在样品前后空气路径中的相互作用、样品周围过量的结晶溶液、结晶冰的存在，以及来自其他光束线仪器或X射线窗口的散射。VMXm光束线配备了一系列仪器和样品制备方案，旨在减少所有这些噪声来源。

首先，VMXm 上的真空内样品环境消除了X射线源与样品之间的空气路径。其次，VMXm 上用于大分子晶体学的样品制备方案采用了多项源自冷冻透射电镜（cryoTEM）的技术与工具。这些技术包括带有微孔碳支持膜的铜网、利用液态乙烷进行自动 blotting 和浸入式冷冻的机器人系统。这些工具能够在单个 cryoTEM 网格上制备数百个微晶，且周围液体极少，支持膜背景噪声低。同时，它们还能最大限度减少晶体周围残留液体形成的结晶冰。
本文展示了在将样品装载至 VMXm 光束线上进行X射线衍射实验之前，利用可见光和扫描电子显微镜对可溶性蛋白质微晶进行制备及质量评估的流程。我们还将提供高质量样品的实例，以及需要进一步优化的样品示例，并介绍相应的优化策略。

引言

通过大分子晶体学（MX）解析生物大分子高分辨率结构的主要障碍之一，仍然是难以获得尺寸合适且衍射质量良好的晶体。为实现这一目标，存在多种策略，从重组蛋白基因构建体的设计，到开展大规模稀疏矩阵筛选以寻找可能诱导初始晶体形成的化学试剂组合2。对于后者，晶体学家通常需要对初筛获得的晶体进行优化，以获得适合结构解析研究的、具有足够衍射质量和尺寸的晶体3。尽管有这些方法，某些目标分子可能始终无法形成较大（>10 µm）、衍射良好的晶体，因此晶体学家必须坚持使用微晶，并应对这类样品带来的各种挑战。这些挑战包括晶体的适当安装与冷冻保护、本底信号较弱衍射的管理，以及更高的辐射敏感性。微晶所含的晶胞和分子数量少于大晶体，因此其衍射信号的放大程度不及大晶体，导致衍射强度本身较弱。必须确保背景信号不会掩盖这些衍射点，尤其是在高分辨率区域，弱衍射点的强度容易丢失4。此外，微晶对辐射损伤更为敏感，即使在液氮温度下收集衍射数据5，也可能无法从单个晶体获得完整的数据集，因此需要从大量晶体中收集数据，以合并生成一个完整的数据集6。

X射线自由电子激光器（XFELs）的日益普及以及序列晶体学方法（SFX）的发展7，为从小尺寸微晶中收集数据提供了新途径。然而，这些方法属于定制化的样品输送技术，需要大量的硬件和软件专业知识，其实验通常局限于室温条件，且样品消耗量较高（数百微升），仍可能需要进一步优化8。因此，对于仅能制备有限数量微晶的研究项目而言，SFX并不适用。

与此同时，近年来同步辐射光束线技术不断进步，能够产生更小、更稳定的光束9，其亮度之高使得从越来越小的晶体中收集数据成为可能10,11。诸如NSLS-II的FMX和Diamond Light Source的I24等微聚焦光束线已能够从最大尺寸约为3 µm的晶体中解析出新颖的结构12，并展示了从尺寸低至约1 µm的更小晶体中收集可用数据的能力13。光束线必须进行精确配置，具备优异的高分辨率同轴观测光学系统、极小的样品旋转模糊球，以及与X射线束完全重合的精确对准旋转轴。将X射线束的轮廓与晶体体积精确匹配，并确保晶体在X射线束中精确对准，这一点至关重要——对于尺寸<5 µm的晶体而言尤为具有挑战性14。在光束线上满足这些实验条件，是获得高质量微晶衍射数据的关键。

从微晶收集数据的另一个可能也是最重要的方面，是将晶体呈递给X射线束的方式。微晶通常被装载在由聚酰亚胺制成的微网样品支架上，聚酰亚胺是一种低X射线散射材料，其孔径可小至10 µm15,16。聚酰亚胺网格被安装在标准针头上，并插入磁性SPINE底座中，使其与大多数MX光束线兼容17。该网格支架用于从结晶液滴中“捞取”晶体，操作流程通常与使用标准环形支架装载100 µm晶体的方法相同。尽管晶体可能分布在网格上，但其主要缺点是在采集过程中，网格和针头会携带相对大量的液体（图1C、D）。这种液体体积可能远大于晶体本身，在X射线照射时会产生背景噪声。若在快速冷冻过程中液体形成结晶冰，所产生的背景散射可能更强，从而降低本已微弱的衍射信号的信噪比，尤其是在冰的衍射分辨率范围内。因此，关键是要去除样品上的过量液体，以确保能够记录到所有可能的信号。对于在脂质立方相（LCP）中生长的膜蛋白晶体而言，这一挑战更为严峻，因为LCP本身会产生强烈的背景散射，且难以从晶体周围彻底清除18。

位于 Diamond Light Source 的新型多功能大分子晶体学微聚焦光束线（VMXm）可提供用于收集尺寸可能小于一微米的晶体数据的条件。该光束线设计可输出光束剖面尺寸为 0.3 µm × 0.5 µm（垂直×水平）1，一个角度计，其混淆球不超过60 nm，且 在真空中 样品环境。VMXm终端站的这些设计特点在数据采集过程中最大限度地减少了光束线设备产生的背景X射线噪声，其中残余的主要背景来源仍为样品本身所产生的噪声。14.

专为 VMXm 光束线设计的特定样品制备方法，可有效降低背景信号，进一步提高衍射数据的信噪比，从而最大限度地提升对尺寸小于<10 µm 的微晶所能记录数据的质量。此处所述的微晶低背景衍射的许多要求，也常见于冷冻透射电子显微镜（cryoTEM）19 和微晶电子衍射（microED）20。因此，许多已为 cryoTEM 样品制备开发的工具，经过适当调整后，也适用于微晶的制备。在单颗粒 cryoTEM 样品制备过程中，待研究的颗粒被包埋在极薄的（通常<100 nm）玻璃态冰层中，以使电子能够穿透样品。这种薄而均匀的冰层通过去除多余液体并迅速将样品冷却（约 104 K s-1）21 实现，即快速浸入约 93 K 的液态乙烷中完成玻璃化22。相比之下，MX 样品制备中常规使用的液氮作为冷冻剂的效率低于乙烷，且更容易在样品中形成结晶冰21。结晶冰的形成会降低衍射质量并产生背景噪声，通常可通过使用冷冻保护剂化合物来缓解这一问题23。可在结晶溶液的一小部分中添加低分子量聚合物（如聚乙二醇（PEG）400 和甲基-2,4-戊二醇（MPD））、糖类、油类或饱和盐类，浓度较低即可24；但并不存在一种适用于所有情况的通用冷冻保护剂，其选择通常需要优化25。此外，晶体在收获和冷冻保护过程中需经历多次操作，可能导致晶体损伤；而使用液态乙烷则可省去该步骤，有助于保护晶体的完整性。

尽管液态乙烷由于样品较薄，可作为微晶（<10 µm）有效的冷冻剂，但也有其他方法可防止结晶冰的形成，特别是在较大晶体中，例如通过精确控制湿度环境来降低晶体中的水分含量26，或通过毛细作用将过量液体从环状支撑架及晶体表面移除27，然而这些方法仍需对样品进行更多操作。采用自动化 blotting 及液态乙烷快速冷冻技术（如在 cryoTEM 中所用），可同时去除多余的结晶溶液，并提供一种可控方式对微晶进行瞬时冷却，同时尽量减少对样品的操作。

本文介绍了一种实验方案，不仅可供使用VMXm光束线及其他微聚焦光束线的研究人员用于采集高信噪比的衍射数据，也可为准备可溶性蛋白晶体及基于去垢剂的膜蛋白晶体样品以进行微晶电子衍射（microED）实验的研究人员提供参考。尽管在VMXm已配备完整的样品制备与评估设施，但目前越来越多的结构生物学实验室已具备冷冻透射电镜（cryoTEM）样品制备条件。因此，我们预计部分用户可能希望利用本单位的设施完成样品制备，再用于VMXm的机时实验。

方案

1. 仪器设备设置

注意：此处描述的方法使用配备单个滤纸臂的冷冻投入仪。某些仪器配备两个滤纸臂，我们建议使用者查阅制造商的说明书，调整仪器以确保仅使用其中一个滤纸臂。

  1. 确保将光学显微镜放置在冷冻投入仪附近，理想情况下应使显微镜和冷冻投入仪均在使用者易于触及的范围内。
  2. 根据制造商的说明设置并冷却自动冷冻投入仪。
    注意：样品室温度应设置为晶体生长时的温度。切勿将吸水纸放入样品室内。
    警告：液态乙烷为高度易燃易爆物质，必须仅在通风良好且远离潜在火花源的区域使用。
  3. 正确标记载网盒，并使用液氮在小型杜瓦瓶中将其预冷。
  4. 将载网小心地以碳膜面朝上放置在适当的辉光放电载体上（例如用Parafilm包裹的玻璃显微镜载玻片）。
  5. 使用15 mA电流，在0.39 mBar条件下对冷冻透射电镜载网进行25秒的辉光放电处理。应在使用载网前立即进行辉光放电。将辉光放电后的载网置于加盖的培养皿中备用；若辉光放电后超过30分钟未使用，需重新进行辉光放电。
    ​注意：当冷冻投入仪准备就绪且载网处理完成后，即可开始处理样品。

2. 确定初始转印参数

  1. 将样品室的相对湿度设置为90%， blotting时间为5秒，并确保冷冻仪在blotting完成后自动进行样品 plunge。
    注意：这些起始参数最适合Leica GP冷冻仪；其他设备如FEI Vitrobot可能提供诸如blotting力度等不同参数。然而，根据我们的经验，使用单个blotting臂更有利于保持晶体完整性。
  2. 为了在打开目标结晶板孔后能够重新密封，剪下一小条胶带并将一端折叠形成标签状，以便于后续开启密封，然后小心地将其放置于一旁备用。
  3. 切开覆盖在结晶孔上的密封膜，包括储液区。操作需迅速，向含有晶体的液滴中加入2–5 µL储液溶液，以维持液滴中的液体体积。
  4. 使用胶带标签重新密封该孔，确保结晶液滴不会干燥。
  5. 在暂时打开结晶孔上的胶带时，转移10 µL储液溶液至一个0.5 mL离心管中，用于后续步骤。
  6. 重新密封该孔。
  7. 将一片预先裁剪好的吸水纸放置在冷冻仪的blotting臂上。
  8. 将单个经电离放电处理的载网放入冷冻仪的镊子中，并装入仪器，使碳膜面背离blotting臂。
  9. 确保blotting室内的相对湿度达到90%。
  10. 旋转镊子，使碳膜面朝向blotting臂。
  11. 使用2.5 µL移液器，从0.5 mL离心管中吸取2 µL储液溶液，滴加到冷冻电镜载网的非支撑面（光亮的铜面）。
  12. 旋转载网，使碳支持膜面背离blotting臂，重复上述操作，小心地将液体滴加到载网的碳膜支持面。避免移液器尖端接触碳膜，以防损坏碳膜。由于电离放电过程中沉积的电荷，液体应能在载网上自然铺展。
  13. 启动blotting过程，同时观察载网。Leica GP2配备有观察用显微镜，可用于此目的。
  14. 观察在此期间液体是否从载网的碳表面被吸走：最初表现为载网上大部分液滴在液体通过载网被吸走时变得扁平。随着每个网格方格内液体进一步减少，可在载网表面观察到一波“爆裂”现象。一旦观察到该现象，可在“爆裂”结束后的2–3秒内停止blotting。测试用载网无需进行plunge，可直接丢弃。
  15. 若未观察到所谓的“爆裂”现象，请重复步骤2.11–2.14，每次将blotting时间延长1–2秒，直至在blotting臂从载网收回前刚好出现“爆裂”现象。记录此时间，用于步骤3。
    ​注意：一旦出现“爆裂”现象，应立即停止blotting，以确保晶体不会因过度blotting而脱水。使用来自储液区的结晶溶液进行反向blotting和样品稀释，可保证晶体始终处于一致的溶液环境中，降低晶体失稳的风险。

3. 收集晶体

  1. 将结晶板置于光学显微镜下，调整目标孔使其位于视野范围内。
  2. 将一张新的、经辉光放电处理的载网放入冷冻投入装置的镊子中，并将镊子安装到冷冻投入装置上，使碳膜面背对 blotting 臂。
  3. 旋转镊子，使碳膜面朝向 blotting 臂。
  4. 使用 2.5 µL 移液器，从 0.5 mL 离心管中吸取 2 µL 储液，滴加到 cryoTEM 载网的无支撑面一侧，然后旋转载网，使碳膜支撑面朝向冷冻投入装置的样品口。
  5. 揭开临时密封膜，将移液器设定为 2 µL，轻柔地反复吸取结晶液滴，以悬浮微晶（注意避免在液滴中引入气泡）。
    注意：必须在光学显微镜下观察此过程，以确保晶体从表面膜或孔底完全释放。如果晶体粘附牢固且无法通过吸液释放，可使用移液器吸头或其他结晶工具（如针灸针）轻轻松动晶体。根据晶体大小和光学显微镜的景深，有时可通过显微镜观察到晶体进入移液器吸头的过程。
  6. 将吸取的 2 µL 微晶悬液转移至冷冻投入装置，并将全部样品加至 cryoTEM 载网的碳膜面。
  7. 按照步骤 2 确定的时间进行 blotting，随后立即启动冷冻投入。在 blotting 过程中，观察是否有“爆破波”效应在整个载网上扩散，并记录该现象是否覆盖整个载网。晶体的存在可能影响初始 blotting 时间，后续载网的 blotting 时间可能需要调整 1–2 秒。
  8. 迅速操作，将载网从液态乙烷转移至浸没在液氮中的载网盒内。当残留的乙烷进入液氮时，可能在载网上凝结成不透明的白色固体。为减少此现象，应平稳地将载网从液态乙烷中取出，然后迅速转移至液氮储存容器中。
  9. 当 4 张载网均放入载网盒后，用螺丝拧紧盒盖，并将载网盒转移至装有液氮的泡沫杜瓦瓶中，以便后续使用扫描电子显微镜（SEM）进行样品评估；或使用适当的储存容器将其转移至液氮储存杜瓦瓶中长期保存。

4. 通过光学显微镜评估样品密度

警告：该方法具有破坏性。如果样品量有限（例如仅有一两个结晶液滴），建议跳过此步骤。在将样品投入液氮冷冻后（步骤 3.7），可评估晶体在载网上的分布情况。

  1. 将干燥且处于室温的冷冻透射电镜载网安装到冷冻投入仪的镊子上，并将镊子侧放在光学显微镜下，使载网位于视野范围内。调节适当的放大倍数并调焦，确保能够清晰分辨整个载网及各个载网方格。
  2. 执行步骤 3.1–3.7。
  3. 不要将载网转移至载网盒（步骤 3.8），而是通过重置冷冻投入仪将浸入液态乙烷中的载网收回。
    注意：载网及样品将回升至室温，无法再用于后续的衍射实验。
  4. 从冷冻投入装置上取下镊子。
  5. 在用镊子夹持载网的同时，将其置于光学显微镜下——此时焦距已大致调好。
  6. 进行精细调焦，并评估载网上晶体的分布密度。理想的载网应在每个方格内、远离载网支撑条的位置分布有多个孤立晶体，且晶体聚集现象极少。
  7. 若载网上晶体密度过高，导致晶体大量聚集而仅有少数孤立晶体存在，应使用储液溶液对晶体悬液进一步稀释，并重复步骤 3。稀释样品时需谨慎操作，避免过度稀释导致晶体溶解。
  8. 使用 0.5–1 µL 的小体积分步稀释晶体悬液。

5. 扫描电子显微镜样品评估

注意：在冷冻透射电镜载网上制备的微晶最好在低温条件下使用扫描电子显微镜（SEM）进行评估，这可通过配备低温台的SEM实现。在VMXm上，使用配备Quorum PP3006气锁系统和低温台的JEOL JSM-IT100 SEM（钨源）。为确保在VMXm上观察样品时辐射损伤最小28,29，采用以下设置：5 kV加速电压；束斑尺寸40（JEOL JSM-IT100上的任意单位）；工作距离10 mm。图像使用二次电子探测器采集，样品对中和聚焦时采用0.8 µs的停留时间，而单个晶体的高分辨率图像则采用16 µs的停留时间采集。在将样品装入SEM之前，必须按照制造商说明对显微镜进行校准。建议仅将一个载网装入SEM，其余使用相同参数制备的载网应保留用于X射线衍射实验。

  1. 按照制造商的说明，将 SEM 的样品冷冻台冷却至 -180 °C 以准备 SEM。根据可用系统的具体要求，遵循将冷冻电镜载网装入系统的操作说明。
  2. 将样品装入 SEM 后，打开电子束，使用高倍率（0.8 µs 停留时间）对样品进行对中并调节焦距。
  3. 首先在低倍率（×45）下观察整个载网，进行初步评估。在此倍率下记录一幅图像。
  4. 提高放大倍数，以便更仔细地检查单个网格方格，单个晶体应能非常清晰地被观察到。
  5. 在载网上移动，拍摄晶体的静态图像（16 µs 停留时间），并在继续下一步前确保晶体满足以下条件：
    1. 确保载网平整，且碳支持膜基本完整。
    2. 确保存在大量单晶，且每个晶体周围有狭窄的玻璃态液体晕圈。
    3. 确保碳支持膜上的孔洞清晰可见。
    4. 确保不存在大片玻璃态液体区域，此类区域表现为颜色较深且表面平滑。
    5. 确保载网上几乎没有或完全没有六方冰或表面冰的散在分布。
    6. 确保晶体在支持膜上分布均匀，且无重叠现象。
  6. 此时，应精确测量多个晶体的尺寸，以便在后续衍射实验中准确关联X射线束斑大小。
  7. 可从SEM中可靠取出并保持在低温条件下的样品，后续可用于X射线衍射实验。若无法实现，则应弃置这些样品。
    ​注意：在对整个载网和单个微晶成像（放大倍数分别约为 ×45 和 ×700）时，应评估是否可使用相同制备参数的载网进入光束线实验，或是否需要在步骤3中调整某些参数。载网应满足步骤5.5中描述的各项检测标准。若载网未达到这些标准，则需在重复步骤5前返回步骤3进行进一步优化。

6. 为 VMXm 上的衍射实验准备网格

  1. 冷却所需数量的 VMXm 样品架（图4A)（最多5个）装入带盖的样品卡盒中，使用样品装载器置于大型泡沫杜瓦瓶内图4B使用液氮——这可能需要大量液氮。液氮液面应略高于样品装载器上的样品位置。
  2. 准备环形夹和工具。
  3. 将剪切工具、镊子和VMXm样品镊子等工具放入样品装载器的孔中进行冷却。可在杜瓦瓶上方设置聚光灯，以便操作。
  4. 迅速将装有载有微晶的载网的网格盒转移至样品载入器的网格盒凹槽中，并拧松盖子，使其处于松动且可旋转的状态（不要取下）。
  5. 在液氮中，使用大号镊子取下样品盒的盖子，并将其置于样品加载器下方。
  6. 使用 VMXm 样品镊子将样品台提起并放置到样品装载器上，确保样品台朝上，以便可容纳载网。当处于正确位置时，样品装载器上的小销钉将插入样品台中央的小孔中。
  7. 使用冷却的精细镊子，小心地从网格盒中取出网格，并将其转移至样品台的网格孔附近。旋转网格，使其平整放置（支撑膜面朝向任意方向均可）。
  8. 轻轻 lowering 镊子，使载网尽可能接近载网孔上方（注意不要弯曲载网），然后将载网放入孔中。如果载网未正确就位，可小心使用细镊子轻推载网至合适位置，或用较大的镊子轻轻敲击样品座。
  9. 迅速将预冷的卡簧工具放在网格的网格孔上，按下按钮以安装卡簧。为确保卡簧正确就位，可连续按压按钮两次。
  10. 将液氮加至液面高于样品架约1.5 cm。使用VMXm样品镊子，小心地将装载好的样品架提起，越过样品装载器上的小销钉，放回样品盒中。记录样品架在样品盒中的位置编号。
  11. 继续将载网装入样品座，直至所有样品装载完毕。
  12. 如果样品仍留在网格盒中，则将网格盒放回储存杜瓦瓶，并从杜瓦瓶中取出样品杆以腾出更多空间。
  13. 将 cartridge 盖子重新装回 cartridge 上，确保 cartridge 顶部的插针插入盖子上的孔中。
  14. 将VMXm气闸杜瓦瓶冷却并装满液氮，放置在装有已加载样品盒的泡沫杜瓦瓶旁边。
  15. 使用 VMXm 卡盒工具，小心地将工具卡入卡盒侧面的凹槽中，并迅速将卡盒提起至气闸杜瓦瓶内。
  16. 确保液氮液面覆盖 cartridge。
  17. 将盖子盖在气闸杜瓦上，然后携带装载好的样品盒前往 VMXm 终端站。
    注意：样品卡盒装入 VMXm 端站将由光束线工作人员操作。

结果

本实验方案的目的是获得玻璃化微晶，其周围液体体积最小化，从而在X射线衍射实验中最大限度减少背景散射，提高衍射信号质量。图1A,B 和 图2 展示了在冷冻电镜载网上制备的、用于降低背景散射的微晶的扫描电镜图像示例。晶体在载网上均匀分布且呈单颗粒状态时，可实现载网的最高效利用，并获得良好的信噪比。然而，通常难以在整个载网范围内实现完全均匀分布，某些区域可能出现一定程度的聚集现象（图2A,B）。尽管存在聚集，这些示例中仍含有足够数量的单个孤立晶体，可用于实现低背景衍射（图5）。保持低背景散射所需的 blotting 程度可能存在差异。理想情况是进行较强的 blotting，使碳支持膜上的孔洞清晰可见，同时确保晶体仍处于水合状态（图2C,D）。然而，高质量的载网也可能在支持膜孔洞内残留少量液体，只要孔洞位置仍可识别即可（图2A,B）。重要的是，所有这些示例均显示存在单个、孤立的晶体，其周围有一圈玻璃化的液体薄层，以维持从 blotting 到 plunge freezing 过程中晶体的水合状态。

许多样品可能需要进一步优化（图3），包括调整印迹时间或微晶浓度。晶体过载的载网会导致印迹效率降低，并可能在单张衍射图像中记录到多个晶格（图3A,B）。黏度较高的结晶条件（例如含有8% PEG 4000和15%乙二醇的胰蛋白酶样品）（图3C），可能需要更长的印迹时间（>10 s）。相反，黏度很低、印迹速度非常快的结晶条件，可能因重力作用导致微晶在印迹前沉降，从而产生分布不均的问题，使所有微晶沉积在载网的一侧（图3D）。

最佳的样品制备能够充分发挥 VMXm 的全部性能，以尽可能高的分辨率收集高质量、高信噪比的 X 射线衍射数据图5）。这些样本的优势在于与 真空条件下 样品环境，导致衍射图像中的平均背景计数极低或为零。使用液态乙烷且不添加冷冻保护剂，可避免冰环的产生。图5），尽管当晶体靠近铜网条时，X射线束可能掠过网条，从而在约2.1 Å和约1.8 Å处产生铜粉衍射环。

显微镜网格分析；图案化微结构的扫描电镜图像；表面图案细节。
图 1：微晶在微网格支撑架与冷冻电镜网格上固定的比较。 病毒多面体微晶的扫描电子显微镜图像，微晶尺寸约为 2.5 µm（A, B），加速电压为 5 kV，束斑大小为 39（任意单位），停留时间为 16 µs。图中网格无过量液体（A），而图中晶体周围可见一圈狭窄的液体晕（B）。相同样品固定于微网格（20 µm 孔径）上，经液氮快速冷冻后，通过 I24 光束线的轴向观测系统正面（C）和侧向（D）观察。正面观察时的光学畸变（C）可反映微网格上液体层的厚度分布，侧向观察时更为清晰（D）。图 C 和 D 中的红色靶标表示 X 射线束的位置和尺寸。请点击此处查看此图的放大版本。

穿孔基底上纳米结构生长的显微镜图像；微加工研究结果
图2：高质量样本的示例。 多面体晶体（A) 在单个 ~ 范围内观察到100 µm 网格方格内。尽管部分晶体略有聚集，并与周围液体存在一定程度的连接，但仍有多个孤立的单个晶体，其周围环绕着少量液体晕圈。稍大的胰岛素晶体（B) 测量约为 5 x 5 µm 也显示出一些聚集现象，但同样存在分离良好的单个晶体。针状晶体可能具有非常狭窄的尺寸，需要使用微束进行检测，例如这些呈针状的溶菌酶晶体（C）。可以看到一条狭窄的液带环绕这些晶体（浅灰色晕圈）。较大的微晶，尺寸可达数十微米，也可以很好地固定在冷冻透射电镜载网上，例如这些约7 µm 蛋白酶K晶体（D）。在两者中（C）和（D）以及在较小程度上在（A），碳支持膜上的孔洞清晰可见，表明液体极少或没有。在示例B中，虽然未观察到空的孔洞，但仍可辨识出孔洞的位置，说明液体仅填充在支持膜的孔洞中。在所有这些示例中，网格方格边缘（一个圆润的内侧方格）周围可见一圈液晕，孔洞呈现较浅的灰色外观。这是制备良好的网格的常见特征。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显微镜图像、实验微网格装置、细胞生长、电子显微镜分析。
图3：需要进一步优化的样品示例。微晶过载的网格（A, B）会增加背景散射，因为样品会堵塞支撑膜上的孔洞，降低 blotting 效率，并且由于晶体之间的表面张力较高，残留的液体更多。这不仅会导致信噪比下降，造成信息丢失，还可能记录到多个晶格。Blotting 时间过短或结晶溶液黏度过高均可能导致样品过于湿润（C），同样产生低信噪比。对于不含沉淀剂的结晶条件（如牛胰岛素的条件，D），其黏度非常低。虽然这会导致极短的 blotting 时间，但也可能因重力作用导致晶体在 blotting 前和过程中在网格上移动。这通常会导致网格大部分区域为空，而边缘一侧晶体高度富集（D）。在将晶体悬液施加到网格前，可加入乙二醇等黏性试剂以减少晶体流动并改善晶体分布，这可能具有优势。此外，这还能延长 blotting 时间，便于观察 blotting 过程。请点击此处查看该图的放大版本。

光谱实验装置中的静态平衡设备，显示组件和样品架组件。
图 4：VMXm 上用于样品装载的工具。 已专门设计了一套工具用于装载 VMXm 样品架（A）。样品装载器（B）在操作时可容纳一个 VMXm 样品架、网格盒和工具存储空间。其设计还可实现在液氮液面稍下方操作，并允许样品盒插入其下方（B）。气闸杜瓦瓶（C）可与 VMXm 端站上的气闸氮气箱匹配，用于将装载好的样品盒从实验室转移至光束线实验舱。为在离线扫描电镜（SEM）中观察样品，专门制作了一个转运装置（D），该装置由无底座的 VMXm 样品架构成，可在与光束线所用相同的样品架中进行样品评估。请点击此处查看此图的放大版本。

用于数据分析的光谱图与像素强度图；光学激发研究。
图 5：VMXm 上微晶衍射示例。 在 VMXm 处使用 Pilatus 3 6M 探测器记录的一张约 3 µm 病毒多面体晶体的单张衍射图像，该晶体采用冷冻电镜载网并通过浸渍冷冻法装载。观测到衍射信号超过 1.7 Å，其中在 1.74 Å 处的一个衍射点（蓝色方框）被放大显示，表明背景散射极低，大量像素的计数为零。在将晶体悬液涂抹到载网之前，已加入乙二醇至终浓度为 50% v/v。VMXm 样品位置的低背景特性可通过图像中蓝色虚线下方所示强度曲线得到验证，即使在光束中心附近，背景信号也保持恒定。强度曲线显示背景信号始终低于 3 个计数。在 2.15 Å 和 1.86 Å 处可观察到两个微弱的环状信号，这是由冷冻电镜载网铜网产生的粉末衍射所致。未检测到明显的冰环，表明采用 blotting 后用液态乙烷冷却的方法有效抑制了冰晶形成。请点击此处查看此图的高清版本。

讨论

本方案展示了如何利用冷冻透射电子显微镜（cryoTEM）样品制备中的工具，用于在微聚焦光束线上进行X射线衍射实验的微晶样品制备。标准光束线仪器通常以针状样品托为基础，尽管已有努力在这些样品托上为微晶提供支撑，但在加样过程中往往难以操作，同时难以保证获得最高的信噪比（图1C,D）。许多样品还需要优化冷冻保护条件，以确保样品呈玻璃态。 plunge freezing（浸冻）方法可重复地去除多余液体，并使用高效冷媒对样品进行快速冷冻（图1A,B）。随后，可使用基于镊子的针状样品托将载网安装至标准光束线设备上，而VMXm样品 holder 则专门设计用于承载载网，并通过传导冷却在真空环境中将样品维持在玻璃化转变温度以下。VMXm的样品环境可实现低背景信号的数据采集，此时样品本身成为背景信号的唯一来源，并提供微束，可用于匹配尺寸小于10 µm的晶体。该样品制备方法还可用于电子衍射实验中的纳米晶体准备，此类实验同样要求极少量的多余液体，并因电子穿透能力较弱，需确保样品呈玻璃态。尽管cryoTEM载网较为脆弱，但熟悉用环状工具 harvesting 晶体的操作人员可迅速适应载网的操作。经过少量实践后，在 blotting、冷冻和加载等步骤中丢失的载网将极少。然而，优化步骤对成功至关重要，仔细的准备可降低晶体丢失或晶体完整性受损的风险。

冷冻电镜载网可提供相对较大的单个支撑面，能够容纳数百个晶体，从而提高通量，尤其适用于只能收集较小衍射数据楔角的情况。单个载网也可能提供足够的晶体以解析蛋白质结构，特别是对于具有高对称性的晶体。当仅有少数一两个结晶液滴生成微晶时，可先尝试仅对结晶条件进行试样 blotting，以确保在处理微晶时所用的 blotting 时间尽可能接近生成初始高质量样品所需的时间。碳支持膜对X射线透明，并有不同孔间距的规格可供选择，可根据特定晶体形态进行适配。我们最常用的是孔径为2 µm、孔间距为2 µm的支持膜，但对于小于2 µm的晶体，可能更适合使用孔径更小而间距更大的支持膜。其他类型的支持膜，例如具有1 µm孔径和4 µm间距的支持膜，或具有不同孔形的支持膜也可获得，这些都会影响blotting时间。200目（每英寸200格）的网格方格尺寸在铜网条之间提供了足够的空间（约100 µm），使得X射线束不会与铜发生强烈相互作用，同时又能为负载晶体的碳膜提供足够的结构支撑。使用液态乙烷可避免使用冷冻保护剂，从而减少了用于优化冷冻保护剂条件所需的样品体积。

在此过程中需要优化的主要参数是 blotting 时间和样品稀释度。Blotting 时间应足够长，以确保在快速冷冻前观察到整个载网上出现“弹出”（popping）现象。然而，过长的 blotting 时间可能导致晶体脱水，但可通过控制样品室内的湿度来尽量减少这一影响。虽然建议使用90%的相对湿度，但某些样品可能需要进一步优化湿度条件。湿度可能会影响 blotting 纸的吸水效率，因为 blotting 纸会逐渐被水分饱和。此外，控制样品室内的湿度还有助于提高晶体的衍射质量30。建议在检查衍射完整性之前，仅对湿度进行微小调整（<5%），以确保衍射质量不会下降。

对于非珍贵样品的优化，可使用光学显微镜替代扫描电子显微镜（SEM）进行。尽管该方法具有破坏性，但有助于评估晶体在载网上的分布密度，并为是否需要稀释或浓缩样品以使晶体在载网上更均匀分散提供决策依据。当晶体数量较多，尤其是样品浓度较高时，此步骤尤为有用。应避免晶体发生聚集（图3），因为虽然在数据收集过程中同时照射到两个晶体并非严重问题6，但聚集区域周围可能存在更大体积的液体，从而降低信噪比（图5）。虽然可通过光学显微镜整体观察载网上是否存在过多液体，但对微晶周围液体体积的评估以及晶体冰是否存在，只能借助配备低温真空转移系统和低温台的电子显微镜完成。有时，在将晶体加样至载网后、吸液前，低黏度溶液中的晶体可能会沉降在载网的一侧边缘。我们发现，在样品中加入终浓度最高达50%的乙二醇可减缓晶体在液滴中的移动，从而确保微晶在载网上更均匀分布，同时通过延长吸液时间，提高对吸液过程的控制能力（图3D）。

一些含有高黏性沉淀剂（如高分子量聚乙二醇）的结晶溶液在吸滤时可能具有挑战性，需要越来越长的吸滤时间（>10 s）。在这种情况下，减少滴加到载网背面的液体体积以及滴加到载网支持膜侧含晶体溶液的体积可能会有所帮助。使用两层吸水纸或玻璃纤维等策略也可能有助于在这些困难情况下完成吸滤31。

尽管该流程适用于可溶性蛋白质晶体，但在高黏度介质（如脂质立方相（LCP）中的膜蛋白）中形成的晶体则带来不同的挑战，本方案并不适用于此类样品。然而，目前已有针对在冷冻电镜载网上制备LCP晶体用于微晶电子衍射（microED）的策略正在发展，其中包括通过诱导LCP发生相变以降低样品黏度的方法。这使得样品能够以类似于本文所述的方式施加到载网上。最后，可使用聚焦离子束对样品进行铣削，以去除多余的非晶体材料32,33,34。

总体而言，从样品到达VMXm到提供分散良好且玻璃化的优化载网，该流程通常需要1-2小时（包括设备设置时间），具体时长取决于样品的可获得性、晶体浓度以及结晶溶液的黏度。这些方法已成功用于微晶样品的制备，以开展X射线衍射实验，研究微晶上的辐射损伤，其中样品周围液体体积最小化至关重要28,35。需要注意的是，该方案适用于所有可溶性微晶样品，而不仅限于已优化且衍射质量良好的样品。传统上，产生微晶材料的结晶实验通常需要进一步优化以获得更大的晶体，但借助本样品制备方法以及VMXm的能力，可能无需进一步优化即可从此类样品中收集到足够的数据。此外，若此类微晶样品衍射效果较差，通过该样品制备方法在VMXm上收集的数据仍可为后续优化结晶条件提供有价值的参考。用于载网制备的工具，包括辉光放电和 plunge freezing（ plunge 冷冻），目前在配备冷冻透射电镜（cryoTEM）实验条件的研究机构中已广泛可用，许多用户可提前在VMXm beamtime（光束时间）之前自行完成样品制备。

披露

无任何利益冲突需要声明。

致谢

作者谨此感谢牛津大学斯特鲁比实验室的 Jeremy Keown、Jon Grimes、Geoff Sutton 和 Dave Stuart，以及南安普顿大学的 Rachel Bolton，他们慷慨提供了微晶样品，用于 VMXm 光束线样品制备方法的开发与示范，并协助完成了光束线的调试工作。作者同时感谢 iNEXT-Discovery（项目编号 871037）为发表本论文所提供的机会与支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动化冷冻电镜样品投入式冷冻仪Leica 或 ThermoFisherVarious
带光源的台式光学显微镜VariousVarious
刀片/手术刀Fisher ScientificVarious
带碳支持膜和 2 µm 孔的 CryoTEM 铜 200 目载网QuantifoilN1-C16nCu20-50
CryoTEM 载网储存盒Agar ScientificAGG3727
ddH2On/an/a
乙烷气体供应n/an/a
乙二醇Acros Organics146750010
玻璃显微镜载玻片FisherBrand12383118
玻璃培养皿FisherBrand455732
辉光放电装置Pelco91000S
实验室封口膜（Parafilm）BemisHS234526B
大、小号精细镊子Agar ScientificVarious
液氮供应n/an/a
移液器吸头VariousVarious
移液装置VariousVarious
结晶板密封胶带Molecular DimensionsMD6-01
大、小型液氮杜瓦瓶SpearlabVarious
弹簧卡环夹紧工具SubangstromSCT08
Whatmann No.1 预切滤纸Leica16706440

参考文献

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, Pt 4 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 10 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496(2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 5 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 4 261-270 (2011).
  15. MiTeGen. MiTeGen. , Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020).
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, Pt 4 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, Pt 9 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 10 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

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