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方法文章

实时定量检测感染脑膜炎病原体的中性粒细胞中的活性氧 大肠杆菌

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DOI：

10.3791/62314

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2021年4月20日

 ,  , 
1Department of Developmental Cell Biology, Key Laboratory of Cell Biology, Ministry of Public Health, and Key Laboratory of Medical Cell Biology, Ministry of Education, China Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Escherichia coli 是新生儿革兰氏阴性菌性脑膜炎的主要致病原因。在细菌感染过程中，中性粒细胞产生的活性氧物质发挥重要的杀菌作用。本文介绍一种检测脑膜炎致病性 E. coli 刺激中性粒细胞产生活性氧物质的方法。

摘要

Escherichia coli（E. coli）是引起新生儿脑膜炎最常见的革兰氏阴性菌。菌血症的发生以及细菌穿透血脑屏障是E. coli脑膜炎发展的必要步骤。活性氧（ROS）是中性粒细胞杀灭入侵病原体的主要杀菌机制。在本实验方案中，采用实时荧光酶标仪检测荧光ROS探针，定量测定脑膜炎型E. coli感染后中性粒细胞内ROS的时程性产生情况。该方法也可用于评估病原体与宿主相互作用过程中哺乳动物细胞内ROS的生成水平。

引言

新生儿细菌性脑膜炎是一种常见的儿科感染性疾病。大肠埃希菌（E. coli）K1荚膜菌是引起新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰阴性病原体，约占总发病率的80%1,2,3。尽管抗菌化学治疗和支持性治疗已取得进展，细菌性脑膜炎仍是一种极具破坏性的疾病，具有较高的发病率和死亡率4。

新生儿细菌性脑膜炎的发生通常始于致病菌从新生儿局部病灶侵入外周循环引起的菌血症，随后细菌穿过血脑屏障（BBB）进入脑组织，导致脑膜发生炎症4。菌血症的发生依赖于细菌与宿主免疫细胞（包括中性粒细胞和巨噬细胞等）之间的相互作用。中性粒细胞约占白细胞总数的50–70%，是抵御细菌感染的第一道防线5,6。在细菌入侵过程中，活化的中性粒细胞被募集至感染部位，并释放活性氧（ROS），包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧7。这些活性氧可与细菌的细胞膜、核酸分子和蛋白质发生氧化还原反应，导致入侵细菌受损乃至死亡8。在线粒体是真核细胞中活性氧生成的主要场所，多种氧化酶系统（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶复合物、脂氧合酶系统、蛋白激酶C和环氧化酶系统）介导活性氧的生成9,10。实时检测活性氧的产生——作为中性粒细胞主要抗菌机制的指标——是研究细菌与宿主相互作用过程中宿主防御功能的一种有效方法。

在本实验方案中，采用荧光活性氧探针DHE，通过实时荧光酶标仪检测感染脑膜炎性大肠杆菌 E. coli的中性粒细胞中随时间变化的活性氧（ROS）生成情况。该方法也可用于评估其他哺乳动物细胞在病原体-宿主相互作用过程中ROS的产生。

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方案

本研究中使用的志愿者外周血样本已获得中国医科大学第一附属医院伦理审查委员会的批准（编号：#2020-2020-237-2）。

1. 试剂与培养基的制备

  1. 通过将 8.29 g NH4Cl、1 g KHCO3 和 37.2 mg Na2EDTA 加入 1 L 双蒸水中，调节 pH 至 7.2–7.4，配制红细胞裂解缓冲液。使用 0.22 µm 滤器过滤去除细菌。
  2. 通过向 RPMI 1640 培养基中加入 5% 胎牛血清配制中性粒细胞实验培养基，并于 4 °C 保存。使用前平衡至室温。
    注：使用不含酚红的 RPMI 1640 培养基。
  3. 在 1 L 玻璃烧瓶中，将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4·2H2O 和 0.2 g KH2PO4 加入 1 L 双蒸水中，配制磷酸盐缓冲液（PBS），调节 pH 至 7.2–7.4，于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。
  4. 将 0.5 g 利福平粉末溶解于 10 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 50 mg/mL 的利福平溶液。
  5. 将 10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 15 g 琼脂粉加入 1 L 双蒸水中，配制 LB 琼脂溶液，并对混合物进行高压灭菌。将含有 100 µg/mL 利福平的温热 LB 琼脂溶液倒入培养皿至其一半体积。将冷却凝固后的平板于 4 °C 保存。
  6. 将 37 g 脑心浸液（BHI）粉末溶解于 1 L 双蒸水中，配制适用于细菌菌株的 BHI 肉汤，调节 pH 至 7.2 后进行高压灭菌。
  7. 将荧光探针二氢乙啶（DHE）溶解于 DMSO 溶剂中，配制成 10 mM 储存液。使用前轻轻混匀。
    ​注：立即分装储存液至避光小瓶中。储存液在 -20 °C 下可保存 6 个月。

2. E44 菌株的制备

注意：E44 是一种具有利福平抗性的脑膜炎性 E. coli 突变菌株。

  1. 用无菌移液器吸头蘸取冻存的 E44 菌落，以划线方式将 E44 菌株接种至含有 100 µg/mL 利福平的 LB 琼脂平板上。将平板倒置于 37 °C 培养箱中过夜培养。
  2. 实验前一天，用无菌移液器吸头从平板上挑取一个 E44 菌落，放入含 100 µg/mL 利福平的 5 mL BHI 液体培养基中，置于 50 mL 锥形瓶内。将细菌培养物置于 37 °C 摇床中，以 90 rpm 振荡培养 17 小时。

3. 从人外周血中分离中性粒细胞

  1. 从志愿者体内静脉抽取 5 mL 血液样本至含有 EDTA 作为抗凝剂的真空采血管中。
  2. 将外周血样本在 500 x g 条件下离心 5 分钟。离心后血液样本分为三层，由下至上依次为红细胞（RBC）层、白细胞（WBC）层和血浆层。
  3. 用移液器吸取白细胞层至新试管中，并加入 3 倍体积的红细胞裂解缓冲液。充分混匀后，室温放置 5 分钟。
  4. 在 500 x g 条件下离心 5 分钟，彻底吸除上清液并弃去。
    1. 用红细胞裂解缓冲液重复裂解步骤 1–2 次，直至沉淀变为白色。
  5. 用 2 mL PBS 重悬沉淀以洗涤细胞，然后在 300 x g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉降至管底。
  6. 通过将沉淀重悬于 50 µL 预冷的磁性细胞分选缓冲液中，随后加入 50 µL 人 CD16 微珠，充分混匀，4 °C 孵育 30 分钟，对中性粒细胞进行标记。
    注意：溶液应预先冷却，以防止抗体在细胞表面发生帽化及非特异性标记。大多数成年人每微升血液中含有约 4,000 至 10,000 个白细胞，其中中性粒细胞约占 50–70%。据估算，5 mL 人外周血中的总白细胞数量通常可达 2–5 x 107 个。
  7. 加入 2 mL 磁性细胞分选缓冲液洗涤细胞，在 4 °C、300 x g 条件下离心 10 分钟，彻底弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µL 分选缓冲液中。
  8. 安装磁性分选柱和分离架，将分离器置于架上并用 3 mL 分选缓冲液冲洗分选柱。
  9. 将细胞悬液滴加至分选柱中，使被磁珠标记的中性粒细胞吸附在磁性分选柱上。
  10. 每次加入 3 mL 磁性细胞分选缓冲液，重复洗涤未标记细胞 3 次，确保每次洗涤后柱内储液完全流尽。
  11. 将分选柱从磁性分离器上取下，置于 15 mL 离心管上，向柱内加入 5 mL 磁性细胞分选缓冲液，用推杆将磁性标记的细胞推出。
    注意：为提高中性粒细胞纯度，可使用新的分选柱重复分选步骤。
  12. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟，彻底弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 培养基中。使用细胞计数仪测定细胞数量，并将细胞准备用于后续实验。

4. 活性氧的检测

  1. 将分离的中性粒细胞在 300 x g 条件下离心 5 分钟，重悬沉淀，并用含有 5 µM DHE 荧光探针的培养基将细胞浓度调整至 2 x 106/mL。
  2. 在 37 °C 下孵育中性粒细胞 30 分钟以负载 DHE 探针，然后将细胞悬液分配至 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板中，每孔 200 µL。
  3. 打开微孔板读板仪并启动检测软件。选择不透明白色 96 孔板格式，并确定读数区域。
    1. 设置荧光检测模式（激发/发射波长 = 518/605 nm），在 37 °C 下以每 5 分钟一次的频率进行动力学检测，持续 60 分钟。每次读数前确保振板 3 秒。
  4. 从培养箱中取出微孔板，向每孔预负载的中性粒细胞中加入培养的 E44（MOI=100）或佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）（100 ng/mL），每组设三个复孔。使用 PMA 作为阳性对照。
  5. 将微孔板放入微孔板读板仪中，并立即开始检测。

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结果

根据本文所述方案，从人外周血中分离中性粒细胞，并用荧光探针 DHE 负载，以检测 E44 感染后活性氧（ROS）水平的变化。此处我们提供了代表性数据，显示通过酶标仪实时测定 E44 菌株诱导的 ROS 生成情况。当以 MOI 为 100 加入 E44 菌株后，ROS 水平立即上升，并呈时间依赖性的持续上升趋势（图 1）。而加入已知的中性粒细胞内 ROS 诱导剂 PMA 后，我们观察到呈 S 型曲线变化，初始阶段曲线平缓，随后从 20 分钟到 40 分钟显著上升，最终在 60 分钟时达到峰值（图 1）。

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讨论

中性粒细胞是人体血液循环中数量最多的白细胞组分，作为人类先天免疫系统的重要效应细胞，在抵御病原体入侵的第一道防线中发挥关键作用11。产生活性氧（ROS）是中性粒细胞在吞噬病原体后主要的杀菌机制之一11。近期研究表明，中性粒细胞释放的一种网状结构——中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap, NET）——也参与了细菌杀灭过程6,11,12。

据报道，由病原微生物刺激中性粒细胞所产生的活性氧（ROS）主要源于NADPH氧化酶的激活，该酶由两个膜结合亚基（gp91phox 和 p22phox）以及三个胞质亚基（p47phox、p67phox 和 p40phox）...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（31670845、31870832、32000811）和辽宁省特聘教授计划（LJH2018-35）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 聚丙烯圆锥形离心管KIRGENKG2611
96 孔板Corning3025
琼脂DINGGUODH010-1.1
自动细胞计数仪Bio-rad508BR03397
生物安全柜Shanghai LishenHfsafe-1200Lcb2
脑心浸液BD237500
CD16 微珠（人源）Miltenyi Biotec130-045-701
离心机Changsha XiangyiTDZ5-WS
层析柱Miltenyi Biotec130-042-401
二氢乙啶（DHE）MedChemExpress104821-25-2
胎牛血清CellmaxSA211.02
培养箱HeraeusHera Cell
MACS 分离缓冲液Miltenyi Biotec130-091-221
酶标仪Molecular DevicesSpectraMax M5
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）BeyoitmeS1819-1mg
QuadroMACS 分离装置Miltenyi Biotec130-090-976
利福平Solarbio13292-46-1
RPMI1640 培养基Sangon BiotechE600027-0500
恒温摇床Shanghai ZhichengZWY-100D
胰蛋白胨OXOIDLP0042
酵母提取物OXOIDLP0021

参考文献

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