实时定量检测感染脑膜炎病原体的中性粒细胞中的活性氧 大肠杆菌

摘要

Escherichia coli 是新生儿革兰氏阴性菌性脑膜炎的主要致病原因。在细菌感染过程中，中性粒细胞产生的活性氧物质发挥重要的杀菌作用。本文介绍一种检测脑膜炎致病性 E. coli 刺激中性粒细胞产生活性氧物质的方法。

摘要

Escherichia coli（E. coli）是引起新生儿脑膜炎最常见的革兰氏阴性菌。菌血症的发生以及细菌穿透血脑屏障是E. coli脑膜炎发展的必要步骤。活性氧（ROS）是中性粒细胞杀灭入侵病原体的主要杀菌机制。在本实验方案中，采用实时荧光酶标仪检测荧光ROS探针，定量测定脑膜炎型E. coli感染后中性粒细胞内ROS的时程性产生情况。该方法也可用于评估病原体与宿主相互作用过程中哺乳动物细胞内ROS的生成水平。

引言

新生儿细菌性脑膜炎是一种常见的儿科感染性疾病。大肠埃希菌（E. coli）K1荚膜菌是引起新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰阴性病原体，约占总发病率的80%^1,2,3。尽管抗菌化学治疗和支持性治疗已取得进展，细菌性脑膜炎仍是一种极具破坏性的疾病，具有较高的发病率和死亡率⁴。

新生儿细菌性脑膜炎的发生通常始于致病菌从新生儿局部病灶侵入外周循环引起的菌血症，随后细菌穿过血脑屏障（BBB）进入脑组织，导致脑膜发生炎症⁴。菌血症的发生依赖于细菌与宿主免疫细胞（包括中性粒细胞和巨噬细胞等）之间的相互作用。中性粒细胞约占白细胞总数的50–70%，是抵御细菌感染的第一道防线^5,6。在细菌入侵过程中，活化的中性粒细胞被募集至感染部位，并释放活性氧（ROS），包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧⁷。这些活性氧可与细菌的细胞膜、核酸分子和蛋白质发生氧化还原反应，导致入侵细菌受损乃至死亡

方案

本研究中使用的志愿者外周血样本已获得中国医科大学第一附属医院伦理审查委员会的批准（编号：#2020-2020-237-2）。

1. 试剂与培养基的制备

1. 通过将 8.29 g NH₄Cl、1 g KHCO₃ 和 37.2 mg Na₂EDTA 加入 1 L 双蒸水中，调节 pH 至 7.2–7.4，配制红细胞裂解缓冲液。使用 0.22 µm 滤器过滤去除细菌。
2. 通过向 RPMI 1640 培养基中加入 5% 胎牛血清配制中性粒细胞实验培养基，并于 4 °C 保存。使用前平衡至室温。
   注：使用不含酚红的 RPMI 1640 培养基。
3. 在 1 L 玻璃烧瓶中，将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄·2H₂O 和 0.2 g KH₂PO₄ 加入 1 L 双蒸水中，配制磷酸盐缓冲液（PBS），调节 pH 至 7.2–7.4，于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。
4. 将 0.5 g 利福平粉末溶解于 10 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 50 mg/mL 的利福平溶液。
5. 将 10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 15 g 琼脂粉加入 1....

结果

根据本文所述方案，从人外周血中分离中性粒细胞，并用荧光探针 DHE 负载，以检测 E44 感染后活性氧（ROS）水平的变化。此处我们提供了代表性数据，显示通过酶标仪实时测定 E44 菌株诱导的 ROS 生成情况。当以 MOI 为 100 加入 E44 菌株后，ROS 水平立即上升，并呈时间依赖性的持续上升趋势（图 1）。而加入已知的中性粒细胞内 ROS 诱导剂 PMA 后，我们观察到呈 S 型曲线变化，初始阶段曲线平缓，随后从 20 分钟到 40 分钟显著上升，最终在 60 分钟时达到峰值（图 1）。

讨论

中性粒细胞是人体血液循环中数量最多的白细胞组分，作为人类先天免疫系统的重要效应细胞，在抵御病原体入侵的第一道防线中发挥关键作用¹¹。产生活性氧（ROS）是中性粒细胞在吞噬病原体后主要的杀菌机制之一¹¹。近期研究表明，中性粒细胞释放的一种网状结构——中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap, NET）——也参与了细菌杀灭过程^6,11,12。

据报道，由病原微生物刺激中性粒细胞所产生的活性氧（ROS）主要源于NADPH氧化酶的激活，该酶由两个膜结合亚基（gp91^phox 和 p22^phox）以及三个胞质亚基（p47^phox、p67^phox 和 p40^phox）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 聚丙烯圆锥形离心管	KIRGEN	KG2611
96 孔板	Corning	3025
琼脂	DINGGUO	DH010-1.1
自动细胞计数仪	Bio-rad	508BR03397
生物安全柜	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
脑心浸液	BD	237500
CD16 微珠（人源）	Miltenyi Biotec	130-045-701
离心机	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
层析柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
二氢乙啶（DHE）	MedChemExpress	104821-25-2
胎牛血清	Cellmax	SA211.02
培养箱	Heraeus	Hera Cell
MACS 分离缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
酶标仪	Molecular Devices	SpectraMax M5
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS 分离装置	Miltenyi Biotec	130-090-976
利福平	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 培养基	Sangon Biotech	E600027-0500
恒温摇床	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
胰蛋白胨	OXOID	LP0042
酵母提取物	OXOID	LP0021