海洋样品中总脂质及脂质类别的测定

摘要

本方案用于测定海水和生物样品中的脂质。滤液中的脂质采用氯仿提取，对于固体样品则使用氯仿与甲醇的混合溶液进行提取。脂质类别通过棒状薄层色谱结合火焰离子化检测进行测定，各类脂质含量之和即为总脂质含量。

摘要

脂质主要由碳和氢组成，因此与海洋中的其他有机大分子相比，能提供更高的比能。由于富含碳和氢，脂质具有疏水性，可作为有机污染物的溶剂和吸收载体，从而成为海洋生态系统中污染物生物累积的驱动因素。其疏水特性有助于从海水或生物样本中分离脂质：海洋脂质分析首先进行采样，然后使用非极性有机溶剂提取，从而方便地将其从水体基质中的其他物质中分离出来。

如果采集了海水样品，第一步通常是通过过滤将样品分离为操作定义上的“溶解态”和“颗粒态”组分。样品经采集后，通常使用氯仿从样品基质中提取真正溶解的物质和胶体，而使用氯仿与甲醇的混合液提取固体和生物样本中的脂类。这些提取物可能包含来自生物源和人为源的多种脂类组分。此时可测定总脂类及脂类类别。总脂类可通过加和各个已测定的脂类类别来获得，而这些类别通常需通过色谱法进行分离。薄层色谱（TLC）结合火焰离子化检测（FID）常用于海洋样品中脂类的定量分析。TLC-FID可提供综合的脂类类别信息，并通过加和各类别得到总脂类含量。

脂质类别信息在与从脂质提取物中释放出的单个组分（如脂肪酸和/或甾醇）的测定结果结合时尤为有用。由于脂质结构和功能具有高度多样性，因此在评估生态系统健康状况以及人为影响程度的生态学和生物地球化学研究中被广泛应用。脂质已被用于测定对海洋动物具有营养价值的物质（如水产饲料和/或猎物），并作为水质的指示指标（如烃类污染物）。

引言

本文所述方法涉及在操作上被定义为海洋脂质的物质。该定义基于这些物质可被非极性有机溶剂进行液-液萃取的特性，从而为从水体基质中的其他物质中分离这些成分提供了一种便捷的方法。由于其疏水性质，这些物质易于从海水或生物样本中分离，同时也便于富集，并去除其中的盐类和蛋白质。

几十年来，海洋生物中脂质含量及其组成的测定在食物网生态学、水产养殖营养学和食品科学领域一直备受关注。脂质是生物体中普遍存在的组分，作为细胞膜中的必需分子、生物可利用能量的主要来源，提供热绝缘和浮力，并充当信号分子。尽管其他领域中脂质测定的方法已有详尽描述，但在海洋样品中的应用通常需要进行修改，以适应野外条件以及样品类型¹。

对于海水样品，第一步通常需要通过过滤（方案步骤1）将其分离为操作定义上的“溶解态”和“颗粒态”组分。颗粒态组分即为滤膜截留的部分，而滤膜孔径大小对于界定截留阈值至关重要²。在采集颗粒物样品时，我们通常希望将脂质浓度与总质量浓度相关联，此时需另取一份较小体积的独立样品（例如10 mL）用于该目的（方案步骤1，注释）。为获得准确的质量测定结果，过滤结束时需加入甲酸铵（35 g/L）。

根据样品类型的不同，较大样品的海水滤液应达到250 mL至1 L之间，并在分液漏斗中进行液-液萃取（实验方案步骤....

方案

注意：用于脂质分析的玻璃器皿、仪器和滤膜，需先用甲醇清洗3次，再用氯仿清洗3次，或在450°C下加热至少8小时以进行清洁。

1. 海水中溶解态和颗粒态脂质的过滤步骤

注意：所关注的特定组分由过滤操作步骤进行操作性定义。本实验中，滤膜孔径为 1.2 µm。

1. 设置过滤装置，不使用滤膜，先用过滤后的海水冲洗整个装置。
2. 使用洁净的镊子将已清洗过的47 mm玻璃纤维（GF/C）滤膜放入洁净的过滤系统中。
3. 取样品并轻轻旋转摇匀，以重新悬浮可能已沉降到采样容器底部的物质。准确量取已知体积的样品（本例中为1 L），并通过滤膜进行过滤。
   注意：取样体积取决于样品中颗粒物的含量，通常根据季节和地点不同，介于250 mL至5 L之间。
4. 量取样品后，先用过滤后的海水轻轻润湿滤膜。缓慢将全部样品加入过滤装置中，并用过滤后的海水冲洗量筒，确保所有颗粒物均转移至滤膜上。同时沿装置侧壁冲洗，确保所有颗粒物均被冲洗到滤膜表面。
   1. 让所有海水通过滤膜，但不要让滤膜完全干燥，以免破坏滤膜上的细胞；当最后的水即将滤尽时，停止抽吸。
5. 使用洁净的镊子和洁净的移液器，先将滤膜对折，再三等分折叠，然后沿长度方向对折，卷成管状。将其放入洁净并已标记的10 mL玻璃小瓶中。....

结果

作为发展最快的食品生产领域，水产养殖业正在通过技术创新和适应性调整来满足不断变化的需求。其中之一是减少对源自野生鱼类的鱼粉和鱼油的依赖，后者为许多养殖水生生物提供了饲料原料。陆生植物油正被研究作为水产饲料中鱼油的可持续且经济的替代品，而肝脏是分析的目标组织，因为它是脂质代谢的主要场所¹²。图2展示了从我们的九组分标准品、一种含7%鱼油和5%菜籽油的配制饲料，以及饲喂该饲料的大西洋鲑肝脏组织中获得的原始薄层色谱-火焰电离检测（TLC-FID）色谱图。表1列出了分析不同饲料重复样本及不同鱼类样品后获得的数据。这些数据是通过使用Peak Simple软件（版本4.54）对扫描仪FID响应建立标准曲线后，定量提取物中各类脂质所得。数据表明，三酰甘油在饲料和肝脏中均占主导地位，同时显示了膜磷脂在肝脏中的重要性。

大陆边缘通常具有极高的生物生产力，在碳循环中尤其重要。在较浅的水域，表层初级生产力向海底的输送更为显著，因此测量从上层混合层沉降到海底食物网的.......

讨论

TLC-FID 系统能够从小样品中快速提供全面的脂质类别信息，这使其成为在进行更复杂的分析程序之前筛选海洋样品的有效工具。此类分析通常需要从脂质提取物中释放组分化合物，并在进行气相色谱分析时通过衍生化提高其挥发性。TLC-FID 与 GC-FID 相结合，已被证明是分析海产品及其他食品提取物的有力组合¹⁴。要成功进行海洋脂质分析，关键在于在整个过程中保护样品免受降解和污染，并在将样品点样到石英棒时格外小心。一种方法是使用微毛细管移液器将整个海洋样品直接点样到石英棒上¹⁵；在海洋样品类型方面的创新则是将海水表面微层和气溶胶样品与海水样品结合分析¹⁶。

自动扫描仪中的FID系统可快速进行微克级定量，且无需衍生化或净化步骤；然而，其灵敏度、精确度和线性范围不及气相色谱仪。这意味着必须建立校准曲线，并且有时需要以两种不同的进样量分析样品，以确保较小和较大的脂质类别峰均在校准范围之内。

利用FI.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 小瓶	VWR	66009-560
1-十六醇	Sigma	258741-1G
1-单棕榈酰消旋甘油	Sigma	M1640-1g
2 ml 小瓶	VWR	46610-722
25 mm 玻璃纤维滤膜	Fisher	09 874 32A
2ml 移液球	VWR	82024-554
47 mm 玻璃纤维滤膜	Fisher	09 874 32
5 3/4" 移液管	Fisher	1367820A
9" 移液管	Fisher	1367820C
丙酮	VWR	CAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890	Agilent
氯化钙 ANHS 500g	VWR	CACX0160-1
2 ml 小瓶盖	VWR	46610-712
氯仿	VWR	CACX1054-1
棕榈酸胆固醇酯	Sigma	C6072-1G
Chromarod S5	Shell USA	3252
二氯甲烷	VWR	CADX0831-1
DL-α-磷脂酰胆碱，二棕榈酰	Sigma	P5911-1g
乙醚，ACS 级无水，4L	VWR	CAEX0190-4
甘油三棕榈酸酯	Sigma	T5888-100MG
Hamilton 进样器 702SNR 25µl	Sigma	58381
氦气	Air Liquide	A0492781
己烷	VWR	CAHX0296-1
氢气减压阀	VWR	55850-484
Iatroscan MK6	Shell USA
Kimwipes 擦拭纸	Fisher	066662
医用空气	Air Liquide	A0464563
中号腈手套	Fisher	191301597C
大号腈手套	VWR	CA82013-782
氮气	Air Liquide	A0464775
氮气减压阀	VWR	55850-474
十九烷	Sigma	74158-1G
棕榈酸	Sigma	P0500-10G
重复分配器	Sigma	20943
碳酸氢钠 1kg	VWR	CA97062-460
无水硫酸钠 ACS 级 500g	VWR	CA71008-804
硫酸	VWR	CASX1244-5
聚四氟乙烯生料带	Fisher	14610120
组织研磨仪 125 115V，配 7mm 匀浆头	OMNI International	TM125-115
TLC 展开槽	Shell USA	3201
超高纯氢气	Air Liquide	A0492788
VWR 溶剂重装移液器	VWR	82017-766
VWR 计时器，双通道闪烁 LED	VWR	89140-196
Zebron ZB-Wax 气相色谱柱	Phenomenex	7HM-G013-11