方法文章

一种用于研究调控体节发生信号振荡功能的微流控方法

3.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62318

⸱

2021年3月19日

 ,  , 
1Hubrecht Institute-KNAW (Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) and University Medical Center Utrecht

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

提供了一种在微流控芯片上培养和操作小鼠胚胎组织的方案。通过施加通路调节剂的脉冲，该系统可用于外部控制信号振荡，从而对小鼠体节发生进行功能研究。

摘要

发育中鼠胚的前体节中胚层的周期性分段由一系列信号通路网络所调控。信号振荡和信号梯度被认为分别控制体节形成的时序和间距。尽管过去几十年中对相关信号通路已有广泛研究，但关于信号振荡在调控体节发生中功能的直接证据仍然缺乏。为了实现对信号动态的功能性研究，微流控技术是一种已被确立的用于精细调控这些动态特性的工具。通过这种基于微流控的同步化方法，内源性信号振荡可通过通路调节剂的脉冲刺激实现同步，从而能够调控例如振荡周期，或两条振荡通路之间的相位关系。此外，还可沿组织建立通路调节剂的空间梯度，以研究信号梯度的特定变化如何影响体节发生。

本方案旨在帮助初次使用微流控技术的研究人员建立微流控实验方法。文中介绍了搭建微流控系统所需的基本原理和设备，并提供了一种芯片设计，可通过3D打印机方便地制备用于芯片生产的模具。最后，讨论了如何在微流控芯片上培养原代小鼠组织，以及如何利用通路调节剂的外界脉冲信号来诱导信号振荡同步化。

该微流控系统还可被改造以容纳其他 体内 和 体外 类器官和原肠胚样体等模型系统，可用于在其他背景下对信号动态和形态发生梯度进行功能研究。

引言

发育过程受细胞间通过信号通路进行的通讯所调控。仅有少数几条信号通路协调着组织在时空中的复杂形成以及细胞的正确分化。为了调控这一系列复杂过程，信息可以编码于信号通路的动力学特征中，即通路随时间的变化，例如信号的频率或持续时间1,2。

在体节形成过程中，体节组织会周期性地从前体节中胚层（PSM）中分离出来3。PSM在空间上受到Wnt、成纤维细胞生长因子（FGF）和视黄酸信号梯度的调控。在PSM前端的决定前沿（determination front），Wnt和FGF信号水平较低，细胞已准备分化为体节。当一轮转录激活波传播至该决定前沿时，分化过程即被启动。在PSM内部，Wnt、FGF和Notch信号通路呈现振荡性活动。相邻细胞的振荡存在轻微的相位差，从而导致Wnt、FGF和Notch通路下游的振荡性转录激活以波的形式从前端向后端传播。在小鼠胚胎中，每约2小时就有一轮转录波到达决定前沿，并启动体节的形成。通过干扰或激活信号通路来研究体节形成，可以揭示这些通路的重要作用4,5,6,7,8,9。然而，若要深入探究信号动态变化对细胞行为调控的功能，关键在于对信号通路进行精细调控，而非永久性地激活或抑制它们。

为了在体节形成的鼠胚胎中实现对信号通路活性的时间调控，Sonnen 等人开发了一种微流控系统10。该系统可对含有生物样本的芯片微通道内的流体流动进行精确控制11。为研究信号动态变化在体节前中胚层（PSM）正常体节化过程中的重要性，该微流控装置被用于在体外（ex vivo）调控小鼠体节时钟的信号动态。通过在培养腔室中依次施加信号通路激活剂或抑制剂，可对外源性 Wnt、FGF 和 Notch 信号通路的动态进行调控10。例如，可改变单个通路的振荡周期以及多个振荡性信号通路之间的相位关系。结合动态信号报告基因的实时成像，可分析同步化（entrainment）对信号通路本身、细胞分化及体节形成的影响。通过实现对信号动态的此类精确控制，研究突显了在体节形成过程中 Wnt 与 Notch 信号通路之间相位关系的重要性10。

个性化的芯片设计为局部环境中的时空扰动提供了多种选择，例如稳定的梯度形成12,13,14,15、脉冲式激活/抑制10,16,17,18或局部扰动19,20。由于实验操作的自动化，微流控技术还可实现更可重复的检测结果和更高的通量21,22,23。本实验方案旨在使微流控技术和组织中内源性信号振荡的同步化技术普及到每一个标准的生命科学研究实验室。即使缺乏用于芯片制备的复杂设备（如洁净室或软光刻设备），也可制造并使用微流控芯片来解决生物学问题。模具可通过免费的计算机辅助设计（CAD）软件进行设计。用于制备微流控芯片（通常由聚二甲基硅氧烷（PDMS）构成）的模具可通过3D打印机打印，或由打印公司定制。通过这种方式，无需昂贵设备即可在一天内完成微流控芯片的制备24。本文提供了一种芯片设计，其模具可通过3D打印用于小鼠体节时钟在二维（2D）ex vivo 培养体系中的同步化研究25。

基于微流控技术的芯片上培养及精确扰动，为揭示信号通路如何调控多细胞行为的分子机制提供了巨大潜力。发育过程中的许多事件需要信号动态变化和形态发生素浓度梯度的参与。此前，已有实验室在微流控芯片中培养细胞、组织和完整生物体，相关主要针对二维细胞培养的时空扰动方案已在其他文献中提供12,26,27,28,29。将微流控技术应用于调控多细胞系统中的局部环境，为高通量且精确的时空扰动开辟了新的研究视角。目前，微流控技术已发展至可被非专业人员以低成本、简便地应用于发育生物学研究的阶段。

本文提供了一种利用 Notch 信号通路抑制剂脉冲同步小鼠体节时钟的实验方案。该实验包括以下步骤：（1）微流控芯片的制备，（2）管路准备及芯片包被，（3）微流控实验本身（图 1A）。涉及脊椎动物模型系统的研究所需的伦理审批，须事先获得责任委员会的批准。

方案

本研究所述工作已获欧洲分子生物学实验室（EMBL）伦理委员会10 和荷兰动物实验委员会（dierenexperimentencommissie, DEC）批准，并遵循Hubrecht研究所的动物护理指南。

操作液态PDMS时需佩戴手套。覆盖工作表面和设备。如有洒漏应立即清除，因为一旦固化后将难以清理。

1. 芯片的制备

注意：微流控芯片通过在模具中浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备。模具可使用计算机辅助设计（CAD）软件（例如 uFlow 或 3D）设计µF30）。麻省理工学院（Metafluidics.org）提供了一个免费设计资源库。模具可通过3D打印机打印，或使用包含所需设计的光掩膜通过软光刻技术制备（更多详细信息参见，例如，Qin et al., 2010）。31）。此处提供一种可用于芯片上培养小鼠胚胎组织的模具设计，该模具可通过3D打印机打印制备（图1B，C，补充文件1和2). 为适配分辨率较低的3D打印机进行打印，本设计相较于此前已发表的设计进行了修改10提供了一个无气泡滞留陷阱的模具和一个带有气泡滞留陷阱的模具（补充文件 1 和 2， 分别）。由于打印程序依赖于可用的打印机，此处不描述打印的具体细节。但必须确保完全去除所有未聚合的树脂。通常需要使用溶剂进行额外清洗，以清除微小结构中的未聚合树脂 <200 µ微流控腔室内的 m 孔将在实验过程中形成 PDMS 柱，用于固定芯片内的胚胎组织。PDMS 通常用于微流控系统，因为它价格低廉、具有生物相容性、透明且自发荧光低。固化后，将 PDMS 芯片从模具中切下，并键合到载玻片上。对玻璃和 PDMS 芯片进行等离子体处理可活化其表面，当两者接触时可形成共价键。

  1. 按 9:1 的质量比将单体与催化剂混合，以制备所需量的聚二甲基硅氧烷（PDMS），从而引发聚合反应。使用一次性工具（如塑料杯和叉子）进行混合，并确保充分混匀。
  2. 将 PDMS 混合物置于真空干燥器中，抽真空约 30 分钟，以去除混合物中的空气。由于干燥器内部形成真空，PDMS 混合物中的气泡将被排出。
    注意：为防止 PDMS 溢出，可在干燥器内部铺上纸巾。
  3. 将 PDMS 混合物倒入芯片模具中（约 3–5 mm 厚的 PDMS 层即可）。
  4. 将装有 PDMS 的模具重新放入真空干燥器中，再次抽真空以去除残留气泡。确保模具所有微小结构中的空气均被彻底清除。
  5. 将模具置于 65 °C（或根据模具材料选择更低温度）的烘箱中过夜固化。使用解剖刀从模具中切割出芯片。切割时需在芯片设计周围预留足够的空间（1–2 cm），以便后续键合操作。务必完全切断 PDMS，以防取出时芯片破裂。先用解剖刀钝端小心撬起 PDMS 芯片，随后可徒手轻轻揭下。
  6. 使用 1 mm 的活检打孔器，从微流控腔体内部开始打出入孔和出孔。
  7. 用压缩空气短暂清洁 PDMS 芯片，并在两侧贴上胶带，以去除附着的 PDMS 碎屑和灰尘，并保持芯片清洁直至后续使用。
    注意：芯片可在此状态下保存待用。 
  8. 用压缩空气清洁载玻片，注意避免其破碎。移除 PDMS 芯片上的胶带。
  9. 使用等离子体处理仪将芯片与载玻片键合。以下步骤针对空气等离子体条件优化。
    注意：请参考实验室等离子体处理仪的使用手册，并根据具体实验条件优化操作流程。
    1. 将芯片和载玻片放入等离子体处理仪中，待键合面朝上放置。
    2. 盖上处理仪盖子，在抽真空过程中保持盖子就位，并等待真空建立完成。
    3. 按下Gas按钮通入气体，等待约 1 分钟（压力应稳定在约 0.37 mbar）。
    4. 按下Generator按钮产生等离子体（功率：9.0，时间：1 分钟）。
    5. 处理结束后，关闭泵和气体，通气并打开舱门。
    6. 将激活后的表面相互贴合，并均匀施加压力完成键合。操作时注意避免载玻片破裂。
      注意：可通过水滴测试验证等离子体处理效果。在载玻片表面滴加一滴水，若处理成功，水滴应立即铺展而非形成球状液滴。
  10. 将键合后的芯片置于 65 °C 烘箱中加热 5 分钟。
  11. 用胶带密封芯片暴露的一侧，防止灰尘进入进样口。
    ​注意：芯片可在此状态下保存至使用前。在此期间，所有开口均应以胶带封闭。

2. 准备微流控实验

注意：进行微流控实验前需完成以下准备工作：首先，在进行微流控实验时，流体将从入口流向出口。由于入口处压力积聚，芯片上的任何孔洞都会成为流体出口。因此，所有未使用的孔洞必须封闭；例如用于装载组织的孔洞。若这些孔洞未封闭，组织可能随流体流出。为封闭这些孔洞，需使用填充聚二甲基硅氧烷（PDMS）的管路。PDMS填充管路可长期保存，因此无需每次实验单独制备，可批量提前准备。其次，在微流控实验开始前，需准备好实验所需的管路、PDMS填充管路及芯片，并进行紫外灭菌。最后，芯片需包被纤连蛋白，以使胚胎组织能够附着于玻璃表面25。

  1. 制作填充PDMS的管路。
    1. 取 ±1 米长的管路。通过使用多段管路，可填充更多PDMS。
    2. 按9:1（w:w）的比例将单体与催化剂混合，制备所需量的聚二甲基硅氧烷（PDMS），以引发聚合反应。
      注意：使用一次性工具（如塑料杯和叉子）进行混合，并充分混匀。
    3. 将PDMS混合物放入真空干燥器中，抽真空约30分钟，以去除PDMS混合物中的空气。
      注意：为防止聚二甲基硅氧烷（PDMS）溢出，应在干燥器内部覆盖纸巾。
    4. 用3 mL注射器吸取PDMS。吸取时需小心，避免混合物中产生气泡。
    5. 使用镊子将22 G针头的尖端插入管路中。
      注意：使用针头时需小心，避免刺破管路或手指。
    6. 通过针头将管路连接至装有PDMS的注射器。使用注射泵以大约500的流速填充管路 µL/h。注意不要施加过高的压力，以免损坏泵。
    7. 待管道完全充满PDMS后，将其放入15 cm培养皿中，在室温下固化（至少过夜）。
  2. 为实验准备管路和芯片。
    注意：实验需要以下管路：首先，每个出口约需 50 cm 的管路；其次，每个入口约需 2–3 m 的管路（具体长度取决于后续所用泵、培养箱或显微镜的空间布局）。入口管路需足够长，以使培养基在进入芯片前与 CO₂ 充分平衡。2 用于实验期间的胚胎培养。
    1. 将管路以45°角切割° 将管路末端剪成斜角，以形成尖端；这将便于将管路插入芯片的孔中。在每根进样管路上各连接一根针。参见步骤 2.1.5。
    2. 将装有PDMS的管路剪成 ±1 厘米的组织块。以 45 度角切割° 将末端剪成斜角，以便形成尖端；这将更便于将管路插入芯片的孔中。需要准备足够的堵头，用于封堵所有未连接管路的孔。
    3. 从芯片上移除胶带。
    4. 将所有带针头的管路、芯片和塞子放入培养皿中，并通过紫外线照射进行灭菌 ±15 分钟。任何具备紫外线消毒功能的细胞培养操作台均可使用。
  3. 芯片的纤连蛋白包被
    注意：用于 2D 培养 离体 用纤连蛋白包被芯片，以培养后部体节前中胚层（PSM）。
    1. 将芯片置于含有 PBS + 1% 青霉素/链霉素的烧杯中，室温放置。 确保芯片完全被 PBS 覆盖。使用 P200 移液器用 PBS 冲洗芯片以去除空气。
      注意：在实验开始前，芯片的所有后续操作均需在此烧杯中进行，以防止空气进入芯片。操作时需小心，避免损坏芯片的玻璃载片。
    2. 将2 mL 1:20的纤连蛋白（Fibronectin）PBS溶液加入烧杯中。
    3. 为芯片的每个腔室装载一支3 mL注射器。用镊子将一根22 G针头插入出口管路中，然后将该针头连接至装有纤连蛋白的注射器。
    4. 将注射器连接至注射泵。冲洗管路，直至管路中无残留空气。
    5. 将出口管路连接至芯片的出口，确保管路完全推到底部。设置较低的流速以润湿芯片，其他开口可保持开放。让注射泵运行至少2小时，也可过夜运行。
    6. 停止泵。在针头后立即切断管路。剩余的管路将在后续实验中用作出口。

3. 微流控实验

注意：此处介绍了一种通过施加 Notch 信号通路抑制剂 DAPT 脉冲，在二维 ex vivo 培养条件下对小鼠体节时钟进行同步化（entrainment）的实验方案。施加周期为 130 分钟的脉冲（接近小鼠体节时钟的自然周期 137 分钟25），可实现高效的同步化。具体脉冲程序为：每 100 分钟施加普通培养基，随后 30 分钟施加 2 µM DAPT（图 2A）。芯片内药物的存在可通过荧光染料进行监测。该染料的激发和发射光谱必须与荧光信号报告分子的光谱足够分离，以避免荧光实时成像过程中的串色干扰。当使用黄色荧光蛋白（如 Notch 信号报告分子 LuVeLu5（Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe））作为信号报告分子时，可选用 Cascade Blue 染料。为确定其他可能适用的荧光染料与报告分子组合，可使用免费的光谱查看工具。同步化效果可通过动态信号报告分子的实时成像进行检测5,10,32。每张芯片包含两个培养腔室，可直接比较药物脉冲（DAPT）与对照脉冲（DMSO）的作用。

  1. 配制培养基并脱气。
    1. 在实验当天，准备 50 mL 培养基（DMEM-F12 添加 0.5 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺和 1% BSA；有关小鼠尾芽培养的更多细节，参见25）。
    2. 准备装有培养基的注射器用于实验。将培养基分装至烧杯中：为同步 Notch 信号振荡，准备含 1.2 µL DMSO 和 10 µM Cascade Blue 的培养基 6 mL；另准备含 2 µM DAPT 和 10 µM Cascade Blue 的培养基 6 mL；再准备两个各含 6 mL 培养基的离心管。每支注射器至少使用 6 mL 培养基。将培养基装入注射器，并确保标记含有药物和 DMSO 的注射器。
    3. 在真空干燥器中对芯片进行 PBS 浸润脱气，并对装有培养基的注射器进行脱气。将注射器放入烧杯中，针头朝上，以便空气从顶部逸出。芯片可能漂浮且内部仍存有气泡，这些气泡将在后续实验中被清除。
    4. 使用 P200 移液器尽量冲洗或吸取出芯片中的大部分气泡。若仍有少量残留，将在后续实验过程中被去除。
    5. 将注射器安装至泵中，并将进样管路连接至注射器。为同步 Notch 信号，使用两台注射泵：一台连接培养基注射器，另一台连接药物/DMSO 注射器。在实验开始前，以较高流速（0.5 mL/h）运行，以清除管路中的气泡。注意在泵中正确设置注射器参数（直径）。
  2. 将组织加载至芯片。
    1. 解剖小鼠胚胎组织，取最尾端的尾芽组织。将解剖所得组织置于含 25 µM HEPES 的培养基中。
    2. 使用 P200 移液器以含 25 µM HEPES 的培养基冲洗芯片，以去除 PBS。
    3. 使用 P200 移液器将组织加载至芯片中（图 1C）。注意避免将气泡引入芯片。
      NOTE：高效加载需要一定练习。若组织方向不正，可尝试通过轻柔吸出再注入的方式调整方向，但此操作常导致细胞快速死亡。
    4. 每次加载组织后，使用一段填充 PDMS 的管路封闭相应的组织加载入口。使用钝头镊子确保塞子充分推到底部。
    5. 所有样品加载完毕后，使用钝头镊子将未使用的入口和出口用填充 PDMS 的管路段封闭。
  3. 微流控装置的组装。
    1. 降低微流控泵的流速。对于小鼠胚胎尾芽，60–100 µL/h 的流速效果良好。较高流速会导致细胞死亡，可能是由于剪切力过大所致。在任一时刻，多个泵的总流速不应超过每个微流控腔室 60–100 µL/h。
    2. 将管路连接至微流控芯片。操作时应避免在芯片内引入气泡（可通过确保管路末端存在一滴培养基实现）。出口仍保留自纤连蛋白包被步骤（见 2.3）。
    3. 所有管路连接完成后，将芯片从烧杯中取出，彻底干燥，放入培养皿中，并与约 1.5 米长的进样管路一同置于培养箱中过夜培养（37 °C，20% O2，5% CO2）。管路具有气体通透性，可使培养基中的 O2 和 CO2 达到平衡。若需同时进行荧光实时成像，可直接将芯片和约 1.5 米长的进样管路置于显微镜下。提供一种适用于标准 96 孔板架的芯片支架，详见 补充文件 3。
      ​NOTE：确保培养过程中湿度足够高。必要时，可在成像室或培养箱中加入湿润的纸巾，以防止微流控系统中的液体蒸发。 若显微镜培养箱内湿度过低，会导致管路和微流控芯片中形成气泡。此时可使用封闭的成像盒，将芯片和管路置于其中。制作此类成像盒最简单的方法是用一个大盖子覆盖芯片并加入湿润纸巾，无需完全密封。确保泵与芯片之间的高度差不宜过大，必要时缓慢调节高度，以防止因重力作用产生气泡。
    4. 装置放置到最终位置后，让所有泵以 20 µL/h 的流速运行 20 分钟。由于腔室和泵的高度可能已发生变化，此步骤可重新建立管路内的正确压力。
    5. 关闭药物泵，仅让培养基泵以 60 µL/h 的流速运行，直至实验/实时成像开始。
  4. 实验开始。
    1. 启动实验预设的泵程序。为同步 Notch 信号，采用 100 分钟培养基与 30 分钟药物脉冲交替的程序，重复至实验结束，通常持续 24 小时。
      NOTE：可使用任意可编程微流控泵。最简单的形式是手动编程并启动泵，也可通过计算机软件控制泵的运行。
    2. 若进行实时成像，应在至少 30 分钟后开始成像。这有助于芯片温度适应培养箱内的环境温度，避免成像过程中产生严重漂移。使用自动对焦功能仍是有益的。
    3. 使用倒置显微镜，通过芯片的玻璃盖片进行标准共聚焦成像。为充分检测周期为 130 分钟的信号振荡，设置 10 分钟的成像间隔。
    4. 对于更短的振荡周期，应缩短成像间隔以实现充分采样。包含一条低分辨率成像通道用于检测 Cascade Blue，以可视化药物在芯片上的存在情况。
    5. 激发 Venus 报告基因时，使用 515 nm 激光或波长为 960 nm 的双光子激光。
    6. 使用 20 倍平场物镜获取 6–8 层 z 轴堆栈图像，层间距离为 8 µm（分辨率 512 × 512 像素，1.38 µm/像素）。使用电动载物台，可在单次实验中对多个样品进行成像。
    7. 使用 405 nm 激光激发 Cascade Blue，每 10 分钟获取一个单层 z 轴图像（分辨率 32 × 32 像素，22.14 µm/像素）。
      NOTE：有关成像与图像分析的更多细节，请参见代表性结果部分及参考文献10。

结果

本方案介绍了一种利用微流控技术对外部同步小鼠体节时钟信号振荡的方法。通过施加Notch信号通路抑制剂的脉冲刺激，可使独立胚胎培养中的信号振荡实现相互同步10。该系统应用于研究体节时钟功能的前提是，芯片上仍能维持信号动态变化和体节形成过程。先前的研究已证明，尽管存在持续的培养基流动和物理边界的形成，Wnt和Notch信号通路的动态行为仍得以保持，并且在外周的二维培养中持续出现体节前板（anterior PSM）的代表性结构10。

为了验证信号振荡对外部药物脉冲的同步化，需在微流控实验期间对信号报告基因（例如表达黄色荧光蛋白Venus的Notch信号报告基因LuVeLu5）进行实时成像。由于难以控制芯片上二维培养物的方向，通常分析前部组织中的信号振荡。二维培养物的边缘可被稳定识别。芯片上组织切片的方向无法随意控制，且芯片的整个内表面均被纤维连接蛋白（Fibronectin）包被。因此，培养物偶尔会附着在芯片的侧壁或顶部。若样品在x、y和z方向上移出视野，或其尾部后端朝下附着，则通常将这些样品排除。

为进一步分析，可将多个此类同步化实验结果进行整合。利用染料Cascade Blue在约400 nm处显示的药物脉冲时间点，可将独立实验相互对齐。为分析和可视化同步状态，可对量化后的振荡信号进行去趋势处理（图2B、D），随后以均值与标准差形式展示，或计算振荡的相位。这使得能够分析独立的胚胎后部培养物之间振荡的相位关系，以及振荡与外部药物脉冲之间的相位关系（图2C、E）。基于Python的程序pyBOAT33是一种简便且用户友好的工具，可用于确定此类信号振荡的周期、相位和振幅。为验证同步化效果，例如可测定内源性信号振荡的周期。当施加周期为130 min的脉冲时，Notch信号振荡也表现出130 min的周期（图2F）10。此外，通过使用Cascade Blue脉冲，可将包含不同信号报告基因的独立实验相互对齐，从而间接确定多种信号报告基因振荡之间的相位关系10。

因此，该微流控系统能够调控小鼠胚胎离体培养过程中的信号振荡。结合体节形成与分化标志物的成像技术，该系统现在可用于解析分节时钟的信号通路如何相互作用，以及它们如何调控体节的形成。

Microfluidics process diagram: CAD mold design, PDMS chip preparation, embryo experiment setup.
图1微流控实验方案的示意图概览。 (A芯片模具可使用计算机辅助设计（CAD）软件进行设计。一种用于捕获信号振荡的芯片设计 离体 提供了小鼠体节发生的小鼠模型。例如，模具可通过3D打印制备或直接订购。微流控芯片通过PDMS浇铸成型。将固化的PDMS芯片切割成型后，使用等离子体炉将其共价键合至玻片表面。芯片内的玻片表面涂覆纤连蛋白，以使分离的组织能够附着。胚胎组织通过加载入口载入芯片，随后封闭入口。将具有不同培养基条件的泵连接至芯片入口，并启动流体程序。实验过程中可使用共聚焦显微镜对组织进行成像。（Kymographs改编自Sonnen） 等., 201810. 重新印制并修改自《细胞》，依据知识共享署名非商业性使用非衍生作品4.0国际许可协议（Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0）。)B芯片上培养小鼠胚胎后部组织的模具设计示意图。微流控通道的高度为 500 µm，足以用于培养小鼠胚胎尾部组织。该模具的打印文件已提供于 补充文件 1，并提供了另一种方案 补充文件 2. (C芯片上由PDMS柱包围的E10.5小鼠尾部切片的明场图像。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Detection of endogenous oscillations; graphs and heatmaps of LuVeLu oscillations under DMSO and DAPT.
图2微流控实验的代表性结果。 (A) 使用培养基和药物泵进行同步化实验的示意图。信号通路调节剂脉冲施加于 离体 小鼠胚胎的培养以及信号振荡可通过动态信号报告基因的实时成像进行观察（例如Notch信号报告基因LuVeLu）5 以及Wnt信号报告基因Axin2T2A10虚线表示随时间进行分析的区域。B-FLuVeLu 报告基因的振荡可通过周期性脉冲的 Notch 信号通路抑制剂 DAPT 进行同步化。B，D) 使用 DAPT 或 DMSO 对照处理后，在前部 PSM 中对 Notch 信号振荡进行定量分析。C，E) Notch信号振荡相位与外界DAPT/DMSO脉冲时间之间的相位-相位关系图。在发生同步的情况下，会建立稳定的相位关系。F) 使用DMSO和DAPT脉冲处理的样品中报告基因振荡的平均周期及标准误（SEM）的量化比较。图改编自 来自 Sonnen等, 201810. 根据知识共享署名非商业性使用禁止演绎 4.0 国际许可协议，转载并修改自《细胞》。 请点击此处以查看此图的放大版本。

问题建议解决方案
PDMS 未与玻璃粘合。- 确保 PDMS 和玻璃表面均清洁无污染。
- 确保腔室周围有足够的 PDMS 用于粘合。
- 优化等离子体处理仪的参数设置。
芯片上存在气泡。- 检查泵是否已开启。
- 在将组织加载到芯片之前，对芯片进行脱气处理。
- 实验开始前对培养基进行脱气处理。
- 确保培养腔内的湿度足够高。
实验初期组织死亡。- 在加载和组装芯片时，在培养基中添加 HEPES。
- 加载过程中避免频繁冲洗组织。
- 检查流速是否过高。
成像过程中组织死亡。- 确保成像过程未引起光毒性。
- 确保无污染发生。
- 流速不应过高。
成像过程中焦点发生偏移。- 成像时使用自动对焦功能，以校正成像载物片的漂移。
- 让芯片在显微镜内至少平衡 30 分钟，以达到恒定温度。
出口/入口管路脱落。- 将所有管路完全插入到底部。
芯片的玻璃破裂。- 操作时更加小心，玻璃非常脆弱。
- 薄玻璃仅在需要成像时使用。若无需成像，可使用常规较厚的载玻片。
- 若破裂位置在芯片外部，可能不影响使用；但若芯片与玻璃的密封处破裂，则会导致液体泄漏和空气进入。
芯片出现污染。- 在培养基中添加抗生素。
- 对所有设备和管路进行灭菌处理。
- 操作应迅速且保持洁净。

表1：故障排除

补充文件 1：用于通过 3D 打印机打印模具的 STL 文件。该模具用于制备微流控芯片，以实现胚胎后部组织的芯片上培养（设计如图 1所示）。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：用于通过 3D 打印机制作微流控芯片模具的 STL 文件，该芯片用于芯片上后部胚胎组织的培养。与补充文件 1及图 1所示设计相比，此设计在所有入口处均包含气泡捕获结构，以防止少量空气进入主微流控腔室。请点击此处下载该文件。

补充文件3：用于制作将芯片置入显微镜的支架的设计文件。该支架具有96孔板的尺寸，可适配大多数显微镜的标准载物台。请点击此处下载该文件。

讨论

信号动态如何调控多细胞系统一直是该领域长期存在的问题。功能研究面临一个关键挑战，即必须对这些动态进行精细调控才能实现这一目标11。原则上，可通过光遗传学手段实现对通路扰动的时间控制，该方法同时还具备高度的空间控制能力34。然而，光遗传学需要为每个待研究的信号通路建立复杂的遗传工具。本文所述的现有方案提供了一种高度通用的工具，可用于扰动任意信号通路。微流控实验允许施加时间可控的药物脉冲，从而在组织培养中功能性地研究信号通路的动力学。此处重点研究体外（ex vivo）培养中的体节发生过程，但该方案可经调整后适用于其他任何模型系统。

在实验方案中，某些步骤对于成功进行微流控实验至关重要（总结见表1）。关键点如下所述。由于实验过程中培养基的流动，组织培养会受到剪切应力的影响。模型系统暴露于持续流动中可能导致细胞应激，在极端情况下甚至因剪切效应导致细胞死亡。对于小鼠尾芽的ex vivo组织培养及当前芯片设计，60 µL/h（最高100 µL/h）的流速被证实可有效运行且剪切效应最小。当同一芯片同时启动多个泵时，需相应调整各泵的流速，以避免总流速增加。若将本方案应用于其他模型系统或芯片设计时，应优化流速。此外，也可不采用持续灌注培养基的方式，而是定期在芯片上更换培养基35。此类设置也可用于调控小鼠体节发生中的信号振荡（未发表，数据未显示）。还可以设想一种系统，其中组织培养物不直接暴露于流体流动中，而药物通过邻近通道的扩散作用到达组织。此类系统已成功用于在胚胎干细胞分化in vitro模型中施加生长因子梯度14,36。

微流控实验的一个主要问题是实验过程中芯片上出现气泡。芯片或管路中的气泡会干扰芯片上的液体均匀流动，并可能导致胚胎培养物从其位置移位。为防止气泡的产生，本方案中的多个步骤至关重要。首先，必须使用真空干燥器对注射器内的培养基以及微流控芯片本身进行脱气处理（步骤 3.1.3）。其次，在将样品加载至加载入口时，必须小心避免将空气与样品一同移液至芯片中（步骤 3.2.3）。第三，在用培养基填充管路时，必须在连接芯片之前将所有气泡完全泵出（步骤 3.3.2）。否则，这些气泡将在实验过程中被推入主芯片内。最后，在实验过程中，由于管路具有半透性，培养基会在成像室或培养箱中达到平衡状态。管路的通透性也会导致培养基蒸发，因此必须在实验期间调节湿度，以防止管路中形成新的气泡。

总体而言，微流控技术是一种高度通用的工具，可根据研究人员的具体问题进行调整。当前的设计方案允许每枚芯片并行成像最多12个离体（ex vivo）培养样本。这一数量主要受限于每次实验所用胚胎的数量以及对每个胚胎培养样本进行足够分辨率成像所需的时间。若单次实验中需要比较多种条件，可将多枚芯片安装在同一张玻片上。本文提供了一种芯片设计，适用于并行成像多个组织外植体；但个性化设计可突破样本数量的限制，实现高通量分析，并增加单次实验中可组合的条件数量16,17。微流控技术仅适用于可在芯片上培养的模型，且每种模型系统均需单独优化其芯片内培养条件27,37,38。

在过去的5到10年中，由于微流控技术在高通量方法以及对信号动态和梯度进行精细调控方面的潜力，其已被应用于解决多种生物学问题。如今，微流控技术已成为一种易于应用、成本低廉且用途广泛的工具，实验室可轻松建立。本文所述的实验方案已针对特定应用进行了优化，即研究调控体节发生过程中的信号动态。该方案和装置设计可轻松调整，以适用于组织生物学领域的不同研究问题。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢乌得勒支大学医学中心（UMC Utrecht）的 Yang Li 和 Jos Malda 在模具3D打印方面的帮助，感谢 Sonnen 团队的 Karen van den Anker 对本实验方案提供的宝贵反馈意见，以及感谢胡布雷希特研究所机械车间的 Tjeerd Faase 为显微镜内的微流控芯片设计的固定装置。我们还要感谢整个 Sonnen 团队对稿件的审阅，以及审稿人所提出的建设性意见。本研究获得了欧洲研究理事会（ERC）启动基金项目（协议号：850554）对 K.F.S. 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 注射器Becton, Dickinson and company300912
184 硅胶弹性体固化剂SYLGARD1673921
184 硅胶弹性体 PDMSSYLGARD1673921
3 ml 注射器Becton, Dickinson and company309657
胶带Scotch Magic 胶带或类似产品
钝头镊子 Bochem 18/10 不锈钢Fisher Scientific10663341
牛血清白蛋白 冻干粉 pH~7BiowestP6154
压缩空气系统
结晶皿VWR10754-7已灭菌
D-(+)-葡萄糖 45%SigmaG8769
干燥器VWR467-0104
一次性杯子Duni173 941
一次性叉子Staples511514
解剖器械
DMEM/F12Cell culture technologiescustomDMEM/F-12，无酚红，无 L-谷氨酰胺，无葡萄糖
纤连蛋白SigmaF1141-5MG
生物安全柜 BioVanguard GreenlineCleanAir by Baker511514用于紫外光源
玻璃盖玻片 No 1.5H 高精度，70x70 mmMarienfeld107999098
HEPES 缓冲液Gibco15630-056
L-谷氨酰胺Gibco25030024
显微镜LeicaLeica SP8 MP
22G 针头Becton, Dickinson and companyz412139-100EA
烘箱VWR390-09
PBS0
青霉素-链霉素Gibco15070063
等离子烘箱 FemtoDiener electronic
打孔器 Ø 1mmUni-CoreWB100073
天平SartoriusEntris
注射泵WPIAL-4000
管路 Ø 1mmAPTAWG24T
真空泵VWR181-0308

参考文献

  1. Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  2. Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
  3. Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  4. Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
  5. Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  6. Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
  7. Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
  8. Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding - From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
  9. Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
  10. Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
  11. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  12. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
  13. Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
  14. Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
  15. Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
  16. Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  18. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
  19. Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016(2001).
  20. Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
  21. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  22. Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
  23. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  24. Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
  25. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
  26. Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
  27. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  28. Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
  29. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
  30. Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  31. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  32. Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
  33. Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
  34. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  35. Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
  36. Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
  37. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
  38. Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Notch

相关文章